專利名稱：肌酐含量測(cè)定方法及肌酐診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種測(cè)定肌酐含量的方法，同時(shí)本發(fā)明還涉及用于實(shí)現(xiàn)該方法的肌酐診斷試劑盒，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
測(cè)定肌酐主要有化學(xué)測(cè)定法(Jaffe法)、酶法、高效液相層析法和毛細(xì)管電泳法等。
化學(xué)測(cè)定法——成本低廉，操作簡便，是目前國內(nèi)測(cè)定肌酐最常用的方法之一。標(biāo)本中的肌酐與苦味酸鹽作用生成黃紅色的苦味酸肌酐復(fù)合物。此法的缺點(diǎn)是特異性不高，因?yàn)榫S生素C、丙酮、乙酰乙酸、甲基多巴以及高濃度葡萄糖、蛋白質(zhì)和一些抗生素如青霉素G、頭孢西丁、頭孢唑啉等也能與堿性苦味酸反應(yīng)生成紅色。
高效液相層析法(HPLC)——肌酐在弱酸性環(huán)境中帶正電荷，通過陽離子交換層析柱可與其他成分很好分離，在234nm測(cè)定其光吸收。此法分析的精密度高、特異性好，但本法不適于大批量臨床標(biāo)本分析，通常僅作為肌酐測(cè)定的參考方法，用于評(píng)價(jià)市售肌酐測(cè)定的試劑盒和某些科研目的。
毛細(xì)管電泳法——血清標(biāo)本用高速離心作預(yù)處理，尿液標(biāo)本可用低速離心，除去有形成分，上清液用膠束動(dòng)電毛細(xì)管電泳分離后測(cè)定235nm處吸光度。本法測(cè)定線性范圍寬，操作較為簡便，但需用特殊設(shè)備和進(jìn)行血清標(biāo)本的預(yù)處理，臨床常規(guī)使用困難。
酶學(xué)測(cè)定法——主要有肌酐脫亞胺酶(Creatinine deiminase)和肌酐酶(Creatininase)兩大類。檢索發(fā)現(xiàn)，申請(qǐng)?zhí)枮?2139298.6、申請(qǐng)日為2002.11.15的專利申請(qǐng)公開了應(yīng)用酶反應(yīng)產(chǎn)物氧化型煙酰胺輔酶配制的測(cè)定試劑。該發(fā)明所指的酶法測(cè)定試劑并不加入測(cè)定反應(yīng)所需的還原型煙酰胺輔酶或其類似物，而加入其反應(yīng)產(chǎn)物氧化型煙酰胺輔酶或其類似物及其相應(yīng)的生成還原型輔酶所需的酶和底物系統(tǒng)，通過在試劑內(nèi)形成酶-底物-NAD或酶-底物-NADP等慢反應(yīng)系統(tǒng)，將這類氧化型輔酶或其類似物緩慢循環(huán)還原為還原型煙酰胺輔酶或其類似物。當(dāng)被還原的還原型煙酰胺輔酶或其類似物達(dá)到一定的濃度時(shí)，該發(fā)明所指的酶法試劑就可達(dá)到測(cè)定樣本中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、尿素、氨、肌酐和二氧化碳等的目的。該發(fā)明的特點(diǎn)在于為丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑、尿素養(yǎng)試劑、氨試劑、肌酐試劑和二氧化碳試劑等的測(cè)試提供一個(gè)內(nèi)源合成丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑、尿素養(yǎng)試劑、氨試劑、肌酐試劑和二氧化碳試劑等反應(yīng)所需要的底物—還原型煙酰胺輔酶。其缺點(diǎn)之一為，這個(gè)系統(tǒng)在生成反應(yīng)所需要的還原型煙酰氨輔酶的同時(shí)，也抵消了部分丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、尿素、氨、肌酐和二氧化碳等的活性，造成試劑測(cè)試的準(zhǔn)確性大大降低。其缺點(diǎn)之二是，該試劑在正式測(cè)試前必須事先反應(yīng)一段時(shí)間，以便能夠產(chǎn)生足夠的還原型煙酰氨輔酶，這樣一來就造成了緩不濟(jì)急的結(jié)果，給測(cè)試帶來很大的不便。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種可以克服以上現(xiàn)有技術(shù)缺點(diǎn)的肌酐含量的測(cè)定方法，同時(shí)給出實(shí)現(xiàn)該方法的肌酐診斷試劑盒，采用該試劑盒中的試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或者半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行肌酐含量測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明測(cè)定肌酐含量的步驟如下1)、將樣品與主要由腺苷三磷酸、輔酶、肌酐脫亞胺酶、N-甲基海因酶、氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶、肌氨酸氧化酶、醛脫氫酶、過氧化物酶、還原型色原體組合組成的試劑混合，使之發(fā)生如下原理的反應(yīng)肌酐+水+H+肌酐脫亞胺酶N-甲基海因+氨離子N-甲基海因+水+腺苷三磷酸N-甲基海因酶氨甲酰肌氨酸+腺苷二磷酸+磷酸根氨甲酰肌氨酸+水氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶肌氨酸+氨離子+碳酸氫根肌氨酸+氧+水肌氨酸氧化酶過氧化氫+甲醛+甘氨酸甲醛+輔酶+水醛脫氫酶二氧化碳+過氧化氫+還原性輔酶+氫離子過氧化氫+還原型色原體組合過氧化物酶吲嗒胺色原或醌亞胺色原+水2)、檢測(cè)最終反應(yīng)物在主波長400--600nm吸光度上升的速度，測(cè)算出肌酐含量的大小。
通常步驟2)將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或者半、全自動(dòng)生化分析儀器下，檢測(cè)主波長主波長400--600nm吸光度上升的速度，測(cè)算出肌酐含量的大小。
以上樣品與試劑的混合比例按體積為1/10到1/250，以上過程的測(cè)定溫度控制在常規(guī)的20℃到50℃范圍，反應(yīng)時(shí)間控制在常規(guī)的2-30分鐘。
本發(fā)明應(yīng)用肌酐脫亞胺酶偶聯(lián)N-甲基海因酶、氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶、肌氨酸氧化酶、醛脫氫酶、過氧化物酶等酶偶聯(lián)反應(yīng)以及還原型色原體(Chromogen)組合系統(tǒng)，將無色的還原型色原體組合氧化成有顏色的醌亞胺色原(Quioneimine)或者吲嗒胺色原(Indamine)染料，因此測(cè)量染料含量的高低(不同染料吸收波長不同，介于400--600nm之間)可以直接反映肌酐含量的大小。這個(gè)酶偶聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)有(1)它利用將無色的還原型色原體組合氧化成有顏色的醌亞胺色原或者吲嗒胺色原染料來反映肌酐含量，有精確度好的優(yōu)點(diǎn)。(2)這個(gè)酶偶聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)組成的反應(yīng)成分都是外加的，不受內(nèi)、外源物質(zhì)的污染，測(cè)試結(jié)果精確。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明方法的肌酐診斷試劑盒可以是單劑，包括緩沖液 40--200mmol/l腺苷三磷酸 0.2--20mmol/l輔酶 0.5--20mmol/l肌酐脫亞胺酶 1000--20000U/lN-甲基海因酶 1000--20000U/l氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶 1000--10000U/l肌氨酸氧化酶 1000--20000U/l醛脫氫酶 500--50000U/l過氧化物酶 1000--50000U/l還原型色原體組合 0.1--20mmol/l穩(wěn)定劑 10--80％(總體積)以上還原型色原體組合可以是0.1-20mmol/l的3-甲基-2-苯噻唑酮腙(3-methyl-2-benzothiazolinone-hydrszone簡稱MBTH)或0.1-20mmol/l的4-氨基抗砒(4-aminoantipyrine)與0.1--20mmol/l以下十四種成分之一組合而成
石碳酸(phenol)N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺(N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)-m-anisidine簡稱ESPAS)N，N-雙乙基-m-甲苯胺(N，N-Diethyl-m-toluidine)2，4-雙氯石碳酸(2，4-Dichloriphenol)2，4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸(2，4，6-Tribromo-3-hydroxy-benzenesulfonic acid簡稱TBHB)3，5-雙氯石碳酸磺酸(3，5-Dichlorophenolsulfonic acid)3，5-雙氯-2-羥基-苯磺酸(3，5-Dichloro-2-hydroxy-benzenesulfonicacid簡稱DHBS)N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽(N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidine sodium簡稱TOOS)仨溴羥基苯甲酸(Tribromohydroxybenzoic acid)雙甲基苯胺(Dimethylaniline簡稱DMA)N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺(N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidine簡稱EHSPT)2，2′-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)(2，2′-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)簡稱ABTS4-羥基-3-甲氧基苯甲酸(Vanillic acid(4-hydroxy-3-methoxybenzoic acid)簡稱HMB)3-甲基-乙基-羥基苯胺(3-methyl-ethyl-hydroxyaniline簡稱MEHA)也可以將以上單劑配成如下雙劑試劑I緩沖液 40--200mmol/l
腺苷三磷酸0.2--20mmol/l輔酶 0.5--20mmol/lN-甲基海因酶 1000--20000U/l氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶1000--10000U/l肌氨酸氧化酶 1000--20000U/l醛脫氫酶 500--50000U/l過氧化物酶1000--50000U/l還原型色原體組合(一) 0.1--20mmol/l穩(wěn)定劑10--80％(總體積)還原型色原體組合(一)可以是0.1-20mmol/l的3-甲基-2-苯噻唑酮腙或0.1-20mmol/l的4-氨基抗砒二者中之一。
試劑II緩沖液40--200mmol/l肌酐脫亞胺酶 1000--20000U/l還原型色原體組合(二) 0.1--20mmol/l穩(wěn)定劑10--80％(總體積)還原型色原體組合(二)可以是0.1--20mmol/l以下十四種成分之一石碳酸、N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺、N，N-雙乙基-m-甲苯胺、2，4-雙氯石碳酸、2，4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸、3，5-雙氯石碳酸磺酸、3，5-雙氯-2-羥基-苯磺酸、N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽、仨溴羥基苯甲酸、雙甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺、2，2′-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)、4-羥基-3-甲氧基苯甲酸、3-甲基-乙基-羥基苯胺。
雙劑的配方不僅限于上述配方，還原型色原體組合(一)及(二)可以互換位置。其中的試劑I的成分，腺苷三磷酸、輔酶、N-甲基海因酶、氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶、肌氨酸氧化酶、醛脫氫酶、過氧化物酶可以放在試劑II，試劑II其中的成分，肌酐脫亞胺酶也可以放在試劑I，如此可以形成多種配方，不在此一一詳述。
還可以將試劑配成如下三試劑試劑I緩沖液 40--200mmol/l腺苷三磷酸 0.2--20mmol/l輔酶 0.5--20mmol/l還原型色原體組合(一) 0.1--20mmol/l穩(wěn)定劑 10--50mmol/l還原型色原體組合(一)可以是0.1-20mmol/l的3-甲基-2-苯噻唑酮腙或0.1-20mmol/l的4-氨基抗砒二者中之一。
試劑II緩沖液 40--200mmol/lN-甲基海因酶 1000--20000U/l氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶 1000--10000U/l肌氨酸氧化酶 1000--20000U/l醛脫氫酶 500--50000U/l過氧化物酶 1000--50000U/l穩(wěn)定劑 10--80％(總體積)試劑III緩沖液 40--200mmol/l肌酐脫亞胺酶 1000--20000U/l還原型色原體組合(二) 0.1--20mmol/l穩(wěn)定劑 10--80％(總體積)
還原型色原體組合(二)可以是0.1--20mmol/l以下十四種成分之一石碳酸、N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺、N，N-雙乙基-m-甲苯胺、2，4-雙氯石碳酸、2，4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸、3，5-雙氯石碳酸磺酸、3，5-雙氯-2-羥基-苯磺酸、N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽、仨溴羥基苯甲酸、雙甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺、2，2′-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)、4-羥基-3-甲氧基苯甲酸、3-甲基-乙基-羥基苯胺。
三劑的配方不僅限于上述配方，還原型色原體組合(一)及(二)可以分開放在試劑I、II或III的任何位置。其中的試劑I的成分，腺苷三磷酸、輔酶可以放在試劑II或III中，試劑II的成分，N-甲基海因酶、氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶、肌氨酸氧化酶、醛脫氫酶、過氧化物酶等也可以放在試劑I或III中。試劑III其中的成分，肌酐脫亞胺酶也可以放在試劑I或試劑II中，如此可以形成多種配方，不一一詳述。
緩沖劑的pH范圍可以是6.0～11.0。緩沖劑可以是三(羧甲基)氨基甲烷—鹽酸(Tris-HCl)緩沖液、磷酸鹽(Phosphate)緩沖液、三乙醇胺(Triethanolamine)緩沖液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-1-propanol)緩沖液、咪唑(Imidazole)緩沖液或雙甘氨肽(Glycylglycine)緩沖液等，但不僅限于這些緩沖液。
此外，為了減少各試劑成分之間的交叉影響、保持試劑的穩(wěn)定性，以便長期儲(chǔ)存，以上單劑、雙劑的試劑I、試劑II或三劑的試劑I、試劑II、試劑III中通常加入穩(wěn)定劑10～80％或者10～50mmol/l，穩(wěn)定劑可以是乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸胺或鹽等中的一種或一種以上。
實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下配方成分關(guān)系的本發(fā)明肌酐診斷試劑盒較為理想緩沖液 80--120mmol/l腺苷三磷酸 2--10mmol/l輔酶 2--8mmol/l肌酐脫亞胺酶 6000--12000U/lN-甲基海因酶 6000--12000U/l氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶 4000--8000U/l肌氨酸氧化酶 8000--16000U/l醛脫氫酶 5000--20000U/l過氧化物酶 8000--20000U/l還原型色原體組合 0.5--10mmol/l穩(wěn)定劑 20--50％(總體積)由于本發(fā)明是完全利用酶學(xué)方法，酶解反應(yīng)具有特異性高的特點(diǎn)，不易受到內(nèi)、外源其他物質(zhì)的干擾。酶法方法簡便、易于操作。酶解反應(yīng)的特異性促使測(cè)試結(jié)果精確。酶解反應(yīng)都是在緩沖液條件下進(jìn)行，沒有污染環(huán)境問題。酶法方法不需要特殊、額外的儀器，測(cè)試成本低廉。因此可以保證具有較高的測(cè)試準(zhǔn)確性，更便于推廣應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
實(shí)施例一(單劑)本實(shí)施例的肌酐診斷試劑盒包括緩沖液80mmol/l腺苷三磷酸2mmol/l輔酶 2mmol/l肌酐脫亞胺酶 6000U/l
N-甲基海因酶 6000U/l氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶4000U/l肌氨酸氧化酶 8000U/l醛脫氫酶 5000U/l過氧化物酶8000U/l4-氨基抗砒2mmol/l石碳酸10mmol/l穩(wěn)定劑50％(總體積)在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，測(cè)試主波長495～505nm，測(cè)試副波長600nm以上，被測(cè)肌酐樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)。
加入樣品和試劑后，使之混合，發(fā)生以下反應(yīng)肌酐+水+H+肌酐脫亞胺酶N-甲基海因+氨離子N-甲基海因+水+腺苷三磷酸N-甲基海因酶氨甲酰肌氨酸+腺苷二磷酸+磷酸根氨甲酰肌氨酸+水氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶肌氨酸+氨離子+碳酸氫根肌氨酸+氧+水肌氨酸氧化酶過氧化氫+甲醛+甘氨酸甲醛+輔酶+水醛脫氫酶二氧化碳+過氧化氫+還原性輔酶+氫離子過氧化氫+還原型色原體組合過氧化物酶吲嗒胺色原或醌亞胺色原+水將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測(cè)主波長495～505nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出肌酐的含量大小。
本實(shí)施例應(yīng)用肌酐脫亞胺酶偶聯(lián)N-甲基海因酶、氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶、肌氨酸氧化酶、醛脫氫酶、過氧化物酶等酶偶聯(lián)反應(yīng)以及還原型色原體(Chromogen)組合系統(tǒng)，將無色的還原型色原體組合氧化成有顏色的醌亞胺色原(Quioneimine)或者吲嗒胺色原(Indamine)染料，因此測(cè)量染料含量的高低(不同染料吸收波長不同，介于400--600nm之間)可以直接反映肌酐含量的大小。這個(gè)酶偶聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)有(1)它利用將無色的還原型色原體組合氧化成有顏色的醌亞胺色原或者吲嗒胺色原染料來反映肌酐含量，有精確度好的優(yōu)點(diǎn)。(2)這個(gè)酶偶聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)組成的反應(yīng)成分都是外加的，不受內(nèi)、外源物質(zhì)的污染，測(cè)試結(jié)果精確。
實(shí)施例二(雙劑)本實(shí)施例的肌酐診斷試劑有試劑I緩沖液 100mmol/l輔酶5mmol/lN-甲基海因酶9000U/l氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶 6000U/l肌氨酸氧化酶12000U/l醛脫氫酶12000U/l過氧化物酶 10000U/l4-氨基抗砒 1mmol/l穩(wěn)定劑 50％(總體積)試劑II緩沖液 100mmol/l腺苷三磷酸 6mmol/l
肌酐脫亞胺酶 9000U/l2，4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸 1mmol/l穩(wěn)定劑50％(總體積)測(cè)定肌酐含量時(shí)，溫度控制在30℃，反應(yīng)時(shí)間15分鐘，測(cè)試主波長546nm，測(cè)試副波長630nm以上，被測(cè)肌酐樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)。
具體測(cè)定步驟為肌酐+水+H+肌酐脫亞胺酶N-甲基海因+氨離子N-甲基海因+水+腺苷三磷酸N-甲基海因酶氨甲酰肌氨酸+腺苷二磷酸+磷酸根氨甲酰肌氨酸+水氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶肌氨酸+氨離子+碳酸氫根肌氨酸+氧+水肌氨酸氧化酶過氧化氫+甲醛+甘氨酸甲醛+輔酶+水醛脫氫酶二氧化碳+過氧化氫+還原性輔酶+氫離子過氧化氫+還原型色原體組合過氧化物酶吲嗒胺色原或醌亞胺色原+水將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測(cè)主波長546nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出肌酐的含量大小。
各反應(yīng)步驟的反應(yīng)時(shí)間控制在15分鐘。
實(shí)施例三(三劑)本實(shí)施例的肌酐診斷試劑為三劑，有試劑I緩沖液 120mmol/l
輔酶 8mmol/l3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2mmol/l穩(wěn)定劑 20mmol/l試劑II緩沖液 120mmol/lN-甲基海因酶 12000U/l氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶 8000U/l肌氨酸氧化酶 16000U/l醛脫氫酶 20000U/l過氧化物酶 20000U/l穩(wěn)定劑 50％(總體積)試劑III緩沖液 100mmol/l腺苷三磷酸 6mmol/l肌酐脫亞胺酶 9000U/l雙甲基苯胺 2mmol/l穩(wěn)定劑 50％(總體積)在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度25℃，反應(yīng)時(shí)間20分鐘，測(cè)試主波長578nm，測(cè)試副波長700nm以上，被測(cè)肌酐樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)。
具體測(cè)定步驟為肌酐+水+H+肌酐脫亞胺酶N-甲基海因+氨離子N-甲基海因+水+腺苷三磷酸N-甲基海因酶氨甲酰肌氨酸+腺苷二磷酸+磷酸根氨甲酰肌氨酸+水氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶肌氨酸+氨離子+碳酸氫根肌氨酸+氧+水肌氨酸氧化酶過氧化氫+甲醛+甘氨酸甲醛+輔酶+水醛脫氫酶二氧化碳+過氧化氫+還原性輔酶+氫離子過氧化氫+還原型色原體組合過氧化物酶吲嗒胺色原或醌亞胺色原+水將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測(cè)主波長578nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出肌酐的含量大小。
各反應(yīng)步驟的反應(yīng)時(shí)間控制在10分鐘。
實(shí)施例四本實(shí)施例的肌酐診斷試劑有試劑I緩沖液100mmol/l腺苷三磷酸4mmol/l輔酶 2mmol/l4-氨基抗砒1mmol/l穩(wěn)定劑20mmol/l試劑II緩沖液100mmol/l肌酐脫亞胺酶 8000U/lN-甲基海因酶 8000U/l氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶6000U/l肌氨酸氧化酶 8000U/l醛脫氫酶 9000U/l
過氧化物酶 20000U/l雙甲基苯胺 2mmol/l穩(wěn)定劑 50％(總體積)測(cè)定肌酐含量時(shí)，溫度控制在30℃，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，測(cè)試主波長578nm，測(cè)試副波長700nm以上，被測(cè)肌酐樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)。
加入樣品和試劑后，使之混合，發(fā)生以下反應(yīng)肌酐+水+H+肌酐脫亞胺酶N-甲基海因+氨離子N-甲基海因+水+腺苷三磷酸N-甲基海因酶氨甲酰肌氨酸+腺苷二磷酸+磷酸根氨甲酰肌氨酸+水氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶肌氨酸+氨離子+碳酸氫根肌氨酸+氧+水肌氨酸氧化酶過氧化氫+甲醛+甘氨酸甲醛+輔酶+水醛脫氫酶二氧化碳+過氧化氫+還原性輔酶+氫離子過氧化氫+還原型色原體組合過氧化物酶吲嗒胺色原或醌亞胺色原+水將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測(cè)主波長578nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出肌酐的含量大小。
各反應(yīng)步驟的反應(yīng)時(shí)間控制在10分鐘。
總之，實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過紫外/可見光分析儀或者半、全自動(dòng)生化分析儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，不受內(nèi)、外源物質(zhì)的污染。
權(quán)利要求
1.一種肌酐含量測(cè)定方法，步驟如下1)、將樣品與主要由腺苷三磷酸、輔酶、肌酐脫亞胺酶、N-甲基海因酶、氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶、肌氨酸氧化酶、醛脫氫酶、過氧化物酶、還原型色原體組合組成的試劑混合，使之發(fā)生如下原理的反應(yīng)肌酐+水+H+肌酐脫亞胺酶N-甲基海因+氨離子N-甲基海因+水+腺苷三磷酸N-甲基海因酶氨甲酰肌氨酸+腺苷二磷酸+磷酸根氨甲酰肌氨酸+水氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶肌氨酸+氨離子+碳酸氫根肌氨酸+氧+水肌氨酸氧化酶過氧化氫+甲醛+甘氨酸甲醛+輔酶+水醛脫氫酶二氧化碳+過氧化氫+還原性輔酶+氫離子過氧化氫+還原型色原體組合過氧化物酶吲嗒胺色原或醌亞胺色原+水2)、檢測(cè)最終反應(yīng)物在主波長400——600nm吸光度上升的速度，測(cè)算出肌酐含量的大小。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述肌酐含量測(cè)定方法，其特征在于所述步驟2)為將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或者半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長400——600nm吸光度上升的速(程)度，測(cè)算出肌酐的含量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述肌酐含量測(cè)定方法，其特征在于溫度控制在20℃到50℃范圍，反應(yīng)時(shí)間控制在2-30分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述肌酐含量測(cè)定方法，其特征在于被測(cè)肌酐樣品與試劑的比例控制在1/10到1/500。
5.一種肌酐診斷試劑盒，由以下成分組成緩沖液 40——200mmol/l腺苷三磷酸 0.2——20mmol/l輔酶0.5——20mmol/l肌酐脫亞胺酶1000——20000U/lN-甲基海因酶1000——20000U/l氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶 1000——10000U/l肌氨酸氧化酶1000——20000U/l醛脫氫酶500——50000U/l過氧化物酶 1000——50000U/l還原型色原體組合0.1——20mmol/l穩(wěn)定劑 10——80％(總體積)
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述肌酐診斷試劑盒，其特征在于所述試劑配成單劑、雙劑或三劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述肌酐診斷試劑盒，其特征在于所述穩(wěn)定劑為乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸銨或鹽中的至少一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述肌酐診斷試劑盒，其特征在于所述緩沖劑的pH范圍是6.0～11.0，所述緩沖劑是三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液、三乙醇胺緩沖液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩沖液、咪唑緩沖液或雙甘氨肽緩沖液中的一種。
9.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述肌酐診斷試劑，其特征在于所述還原型色原體為0.1-20mmol/l的3-甲基-2-苯噻唑酮腙與0.1-20mmol/l以下十四種成分之一組合而成石碳酸、N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺、N，N-雙乙基-m-甲苯胺、2，4-雙氯石碳酸、2，4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸、3，5-雙氯石碳酸磺酸、3，5-雙氯-2-羥基-苯磺酸、N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽、仨溴羥基苯甲酸、雙甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺、2，2′-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)、4-羥基-3-甲氧基苯甲酸、3-甲基-乙基-羥基苯胺。
10.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述肌酐診斷試劑，其特征在于所述還原型色原體組合為由0.1-20mmol/l的4-氨基抗砒 與0.1-20mmol/l以下十四種成分之一組合而成石碳酸、N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺、N，N-雙乙基-m-甲苯胺、2，4-雙氯石碳酸、2，4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸、3，5-雙氯石碳酸磺酸、3，5-雙氯-2-羥基-苯磺酸、N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽、仨溴羥基苯甲酸、雙甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺、2，2′-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)、4-羥基-3-甲氧基苯甲酸、3-甲基-乙基-羥基苯胺。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種測(cè)定肌酐含量的方法，同時(shí)本發(fā)明還涉及肌酐診斷試劑盒，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。該試劑盒包括緩沖液、腺苷三磷酸、輔酶、肌酐脫亞胺酶、N－甲基海因酶、氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶、肌氨酸氧化酶、醛脫氫酶、過氧化物酶、還原型色原體組合、穩(wěn)定劑，通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生酶偶聯(lián)反應(yīng)，再將最終反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)主波長吸光度變化的情況(速度)，從而測(cè)算出肌酐的含量大小。采用本發(fā)明完全可以通過生化分析儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，不受內(nèi)外源物質(zhì)的污染，便于推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/32GK1757752SQ20041006488
公開日2006年4月12日 申請(qǐng)日期2004年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月10日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:王爾中