專利名稱：用于發(fā)酵法制備轉(zhuǎn)氨酶的培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種用于轉(zhuǎn)氨酶高效發(fā)酵制備的培養(yǎng)基，特別是一種用于發(fā)酵法制備天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
L-Phe是人體八種必需氨基酸之一，是氨基酸輸液和氨基酸飲膳所必需的成分，又是重要的藥物和食品甜味劑合成的中間體，近年來需求量逐年增加。天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶是酶法制備L-Phe的關(guān)鍵酶，其活性、表達(dá)量及生產(chǎn)成本直接影響著L-Phe的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。同時(shí)該酶能以酸性氨基酸為氨基供體、α-酮酸為氨基受體，高效制備系列氨基酸，在光學(xué)活性氨基酸的制備中有良好的應(yīng)用潛力。故積極尋找物美價(jià)廉的培養(yǎng)基成分，提高轉(zhuǎn)氨酶的發(fā)酵酶活、增加發(fā)酵穩(wěn)定性和降低發(fā)酵成本，具有顯著的理論和實(shí)際應(yīng)用意義。
目前轉(zhuǎn)氨酶發(fā)酵所用的培養(yǎng)基為碳源、氮源和無機(jī)鹽，氮源主要是蛋白胨和玉米漿，蛋白胨雖然成分豐富，但價(jià)格較為昂貴；玉米漿為淀粉行業(yè)的副產(chǎn)品，成分波動(dòng)大、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，經(jīng)常導(dǎo)致轉(zhuǎn)氨酶發(fā)酵的不穩(wěn)定，嚴(yán)重影響了轉(zhuǎn)氨酶的發(fā)酵生產(chǎn)，日益成為轉(zhuǎn)氨酶應(yīng)用的瓶頸。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于利用質(zhì)量穩(wěn)定的棉籽蛋白作為發(fā)酵氮源，用于發(fā)酵法制備轉(zhuǎn)氨酶的培養(yǎng)基。
本發(fā)明的目的可以通過以下措施來達(dá)到一種用于發(fā)酵法制備轉(zhuǎn)氨酶的培養(yǎng)基，其特征在于所述的培養(yǎng)基中含有一種有機(jī)氮源—棉籽蛋白。
本發(fā)明所述的用于發(fā)酵法制備天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的培養(yǎng)基配方如下1、斜面培養(yǎng)基普通肉湯培養(yǎng)基，加入2％瓊脂；2、種子培養(yǎng)基葡萄糖 2～3％棉籽蛋白 1.5～3％蛋白胨 0.1～0.5％
K2HPO40.05～0.1％NaCl0.02～0.08％；3.發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖 2～3％棉籽蛋白2～4％ZnSO40.02～0.08％K2HPO40.05～0.1％MgSO40.02～0.08％FeCl3.6H2O 0.01～0.05％。
采用本發(fā)明所述的培養(yǎng)基發(fā)酵制備天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的工藝，具體如下將在肉湯加瓊脂制成的斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌種E.Coli ATCC 11303，從斜面轉(zhuǎn)到種子瓶中(內(nèi)含種子培養(yǎng)基)，上搖床，35～40℃，14hr，搖床轉(zhuǎn)速160～200r/min；待種子瓶中生長(zhǎng)旺盛時(shí)，以10％的接種量接到50L一級(jí)種子罐(內(nèi)裝種子培養(yǎng)基)，35～40℃，攪拌通風(fēng)，培養(yǎng)14hr，后轉(zhuǎn)500L二級(jí)種子罐(內(nèi)裝種子培養(yǎng)基)，攪拌通風(fēng)，培養(yǎng)10hr，溫度為35～40℃；然后轉(zhuǎn)到5噸發(fā)酵罐(內(nèi)含發(fā)酵培養(yǎng)基)，35～40℃攪拌通風(fēng)，培養(yǎng)8～10hr。種子罐和發(fā)酵罐發(fā)酵期間，每隔2hr取樣檢驗(yàn)，測(cè)定糖度、pH值、OD值，并顯微鏡觀察菌體生長(zhǎng)情況，發(fā)酵液pH保持在7.2左右，當(dāng)發(fā)酵液殘?zhí)墙档?g/L左右、OD值達(dá)到8以上時(shí)，放罐、離心分離得到大腸桿菌菌體，然后進(jìn)入酶法轉(zhuǎn)化工序。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明涉及的用于發(fā)酵法制備轉(zhuǎn)氨酶的培養(yǎng)基，結(jié)合本發(fā)明所述的發(fā)酵工藝，可以穩(wěn)定地進(jìn)行轉(zhuǎn)氨酶的發(fā)酵，有效地避免了采用玉米漿培養(yǎng)基帶來的發(fā)酵波動(dòng)，轉(zhuǎn)氨酶活性也得到了提高，最終產(chǎn)品(L-苯丙氨酸)的轉(zhuǎn)化得率從75％提高到85％；同時(shí)由于舍棄了昂貴蛋白胨，培養(yǎng)基成本降低了40％。
本發(fā)明中所述的培養(yǎng)基中含有新型精細(xì)有機(jī)氮源——棉籽蛋白具有質(zhì)量穩(wěn)定、蛋白含量高、游離棉酚含量低、微生物利用效果好及價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，它作為一種具有性價(jià)比優(yōu)勢(shì)的有機(jī)氮源，可替代豆粕、酵母粉、魚粉和玉米漿等多種有機(jī)氮源，在發(fā)酵行業(yè)的各個(gè)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1由大腸桿菌E.Coli ATCC 11303斜面取一環(huán)接入裝有50ml培養(yǎng)液的250ml搖瓶中，35℃振蕩培養(yǎng)12小時(shí)即為搖瓶種子。搖瓶種子培養(yǎng)基組成如下葡萄糖2％，棉籽蛋白1.5％，蛋白胨0.1％，K2HPO40.05％，NaCl 0.05％，pH7.0；取5ml搖瓶種子接入裝有100ml發(fā)酵培養(yǎng)基的1000ml搖瓶中，發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下葡萄糖2％，棉籽蛋白2.5％，ZnSO40.02％，K2HPO40.05％，MgSO40.02％，F(xiàn)eCl3.6H2O 0.01％，pH7.0；將發(fā)酵搖瓶37℃振蕩培養(yǎng)16小時(shí)后，發(fā)酵液光密度11(640nm)，轉(zhuǎn)氨酶活性(對(duì)L-苯丙氨酸)83％；實(shí)施例2取例1所述搖瓶種子3升，接入50升發(fā)酵罐中(裝30升發(fā)酵培養(yǎng)基，其組成同例1)，控制罐壓0.08-0.1Mpa，通風(fēng)攪拌，35-37℃培養(yǎng)16小時(shí)，發(fā)酵液光密度11.8(640nm)，轉(zhuǎn)氨酶活性(對(duì)L-苯丙氨酸)83.6％；實(shí)施例3將例1所述搖瓶種子以3％的種量接入裝有200升二級(jí)種子培養(yǎng)液的300升發(fā)酵罐中。該搖瓶種子培養(yǎng)基組成如下葡萄糖2％，棉籽蛋白2％，蛋白胨0.08％，K2HPO40.05％，NaCl 0.05％，pH7.0；接種后維持罐壓0.08-0.1Mpa，通風(fēng)攪拌，35-37℃培養(yǎng)13小時(shí)，發(fā)酵液光密度10(640nm)，經(jīng)檢查無雜菌合格后即接入10000升發(fā)酵罐中，此罐裝有7000升經(jīng)滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基(其組成如下)，控制罐壓0.08-0.1Mpa，通風(fēng)攪拌，35-37℃培養(yǎng)10小時(shí)，發(fā)酵液光密度12(640nm)，轉(zhuǎn)氨酶活性(對(duì)L-苯丙氨酸)83.6％；發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下葡萄糖2％，棉籽蛋白3％，ZnSO40.02％，K2HPO40.05％，MgSO40.02％，F(xiàn)eCl3.6H2O 0.01％，pH7.0。
權(quán)利要求
1.一種用于發(fā)酵法制備轉(zhuǎn)氨酶的培養(yǎng)基，其特征在于所述的培養(yǎng)基中含有一種有機(jī)氮源—棉籽蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述的種子培養(yǎng)基為葡萄糖2～3％棉籽蛋白 1.5～3％蛋白胨0.1～0.5％K2HPO40.05～0.1％NaCl 0.02～0.08％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖 2～3％棉籽蛋白2～4％ZnSO40.02～0.08％K2HPO40.05～0.1％MgSO40.02～0.08％FeCl3.6H2O0.01～0.05％。
全文摘要
本發(fā)明涉及的是用于轉(zhuǎn)氨酶發(fā)酵生產(chǎn)的微生物培養(yǎng)基，本發(fā)明所述的培養(yǎng)基包括種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基；在由大腸桿菌利用蛋白胨和玉米漿為氮源發(fā)酵時(shí)，玉米漿的質(zhì)量不穩(wěn)定影響了產(chǎn)酶的穩(wěn)定。利用質(zhì)量穩(wěn)定的棉籽蛋白作為發(fā)酵氮源，結(jié)合本發(fā)明所述的發(fā)酵工藝，可以穩(wěn)定地進(jìn)行產(chǎn)酶發(fā)酵，有效地避免了玉米漿培養(yǎng)基帶來的發(fā)酵波動(dòng)，轉(zhuǎn)氨酶活性也得到了提高，最終產(chǎn)品(L－苯丙氨酸)的轉(zhuǎn)化得率從75％提高到85％；同時(shí)由于舍棄了昂貴蛋白胨，培養(yǎng)基成本降低了40％。
文檔編號(hào)C12N1/38GK1597921SQ20041006466
公開日2005年3月23日 申請(qǐng)日期2004年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月17日
發(fā)明者周華, 萬(wàn)紅貴, 韋萍, 何若平, 高振, 顧海紅, 于榮華, 歐陽(yáng)平凱 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué)