專利名稱：一種生產(chǎn)抗癌藥物工程菌的發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種生產(chǎn)抗癌藥物工程菌即DH5a-pBVnm23-H1的發(fā)酵方法，它屬于基因工程藥物制備領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
本發(fā)明所指工程菌即DH5a-pBVnm23-H1是一種抗癌轉(zhuǎn)移基因工程藥物Nm23-H1的中試發(fā)酵方法研究。從Dialog國際聯(lián)機(jī)檢索數(shù)據(jù)庫的檢索結(jié)果來看，雖然有許多研究表明nm23基因的表達(dá)水平和惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)，但其中未發(fā)現(xiàn)涉及nm23-H1工程菌的中試發(fā)酵的研究及其文獻(xiàn)報(bào)道。
本發(fā)明工程菌的發(fā)酵方法包括如下步驟發(fā)酵培養(yǎng)基配方和發(fā)酵工藝。培養(yǎng)基的篩選是在首先了解單個(gè)因素對(duì)工程菌的生長及目標(biāo)蛋白表達(dá)的影響后，再通過正交實(shí)驗(yàn)綜合考慮各因素之間的交互作用，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后確定發(fā)酵配方，同時(shí)進(jìn)行發(fā)酵工藝檢驗(yàn)和優(yōu)選，至選定發(fā)酵工藝條件。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是探索一種工程菌的發(fā)酵方法，篩選出能滿足設(shè)計(jì)要求的發(fā)酵培養(yǎng)基配方和發(fā)酵工藝條件，進(jìn)而達(dá)到高菌體得率與高目標(biāo)蛋白表達(dá)。
本發(fā)明的目的可以通過如下措施來達(dá)到一種生產(chǎn)抗癌藥物工程菌即DH5a-pBVnm23-H1的發(fā)酵方法，它包括如下步驟發(fā)酵培養(yǎng)基配方篩選和發(fā)酵工藝條件的選定。按配制10L發(fā)酵液，發(fā)酵培養(yǎng)基配方(重量百分比)如下酵母提取物(Yeast extract) 0.30～3.0蛋白胨(Typtone) 0.30～3.0氯化鈉(NaCl)0.50～1.5葡萄糖(Glucose) 0.30～5.0微量元素適量發(fā)酵工藝條件為(1)菌種的加入量菌種的接種量為培養(yǎng)基溶液的5～15％，菌種的光密度(OD值)為1～3。
(2)工程菌生長和誘導(dǎo)表達(dá)的時(shí)間及溫度工程菌發(fā)酵過程中，長菌溫度為28～35℃，時(shí)間2～5小時(shí)，誘導(dǎo)表達(dá)的溫度為39～45℃，時(shí)間3～7小時(shí)。
(3)加糖時(shí)刻及方式選擇加糖方式采取慢速加糖方式，加糖量為100～350g，且在0.5～3小時(shí)加完。
(4)發(fā)酵液酸堿度調(diào)節(jié)采用酸堿自動(dòng)平衡調(diào)節(jié)pH值，使pH值維持在6.5～7.5之間。
(5)溶氧水平通過通氣量與轉(zhuǎn)速自動(dòng)調(diào)節(jié)溶氧，維持在40％以上水平。
本發(fā)明的目的還可以通過以下措施來達(dá)到調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值采用氫氧化鈉(NaOH)和鹽酸(HCL)自動(dòng)平衡調(diào)節(jié)。
本發(fā)明具有如下特點(diǎn)(1)菌體得率高，達(dá)10～60菌體濕重/L發(fā)酵液。
(2)目標(biāo)蛋白表達(dá)量高(包括相對(duì)含量和絕對(duì)含量)，其含量可達(dá)15～45％。
(3)發(fā)酵時(shí)間短。
(4)發(fā)酵成本低。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明下面將結(jié)合實(shí)施例作進(jìn)一步詳述。
例一A發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下酵母提取物(Yeast extract) 1.0％蛋白胨(Typtone)2.0％氯化鈉(NaCl) 1.0％葡萄糖(Glucose)2.0％微量元素 適量B發(fā)酵工藝按上述配方配制10L發(fā)酵液(用去離子水)于發(fā)酵罐中，經(jīng)滅菌后接種菌種，菌種的接種量為培養(yǎng)基溶液的10％，光密度(OD值)為2.5。同時(shí)設(shè)定溶氧水平為50％，用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)節(jié)pH值為7.0，開始進(jìn)行培養(yǎng)。在開始培養(yǎng)2小時(shí)后把葡萄糖100g(首先配成50％的溶液消毒)慢速加入發(fā)酵罐，用時(shí)2.5小時(shí)。發(fā)酵過程中長菌溫度為30℃，時(shí)間3小時(shí)，誘導(dǎo)溫度40℃，時(shí)間7小時(shí)。
發(fā)酵完畢經(jīng)分離，菌體得率為30g菌體濕得/L發(fā)酵液，目標(biāo)蛋白含量達(dá)35％。
例二A發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下酵母提取物(Yeast extract) 1.2％蛋白胨(Typtone)2.0％氯化鈉(NaCl) 0.9％葡萄糖(Glucose)1.7％微量元素 適量B發(fā)酵工藝按上述配方配制10L發(fā)酵液(用去離子水)于發(fā)酵罐中，經(jīng)滅菌后接種菌種，菌種的接種量為培養(yǎng)基溶液的10％，光密度(OD值)為2.3。同時(shí)設(shè)定溶氧水平為45％，用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)節(jié)pH值為7.0，開始進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)3小時(shí)后開始把葡萄糖150g慢速加入發(fā)酵罐，用時(shí)3小時(shí)，發(fā)酵過程中長菌溫度為31℃，時(shí)間3.5小時(shí)，誘導(dǎo)溫度42℃，時(shí)間6.5小時(shí)。
發(fā)酵完畢經(jīng)分離，菌體得率為33g菌體濕重/L發(fā)酵液，目標(biāo)蛋白含量達(dá)33％。
例三A發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下酵母提取物(Yeast extract) 1.0％蛋白胨(Typtone)2.2％氯化鈉(NaCl) 1.0％葡萄糖(Glucose)1.5％微量元素 適量B發(fā)酵工藝按上述配方配制10L發(fā)酵液(用去離子水)于發(fā)酵罐中，經(jīng)滅菌后接種菌種，菌種的接種量為培養(yǎng)基溶液的8％，光密度(OD值)為3。同時(shí)設(shè)定溶氧水平為55％，用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.2，開始進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)1小時(shí)后把葡萄糖180g慢速加入發(fā)酵罐，用時(shí)3小時(shí)。發(fā)酵過程中長菌溫度為34℃，時(shí)間4小時(shí)，誘導(dǎo)溫度43.5℃，時(shí)間5.5小時(shí)。
發(fā)酵完畢經(jīng)分離，菌體得率為38g菌體濕重/L發(fā)酵液，目標(biāo)蛋白含量達(dá)32.5％。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)抗癌藥物工程菌的發(fā)酵方法，其特征是A.按配制10L發(fā)酵液，發(fā)酵培養(yǎng)基配方重量百分比如下酵母提取物(Yeast extract)0.30～3.0蛋白胨(Typtone) 0.30～3.0氯化鈉(NaCl) 0.50～1.5葡萄糖(Glucose) 0.30～5.0微量元素 適量B.發(fā)酵工藝(1)菌種的加入量菌種的接種量為培養(yǎng)基溶液的5～15％，菌種的光密度為1～3；(2)工程菌生長和誘導(dǎo)表達(dá)的時(shí)間及溫度工程菌發(fā)酵過程中，長菌溫度為28～35℃，時(shí)間2～5小時(shí)，誘導(dǎo)表達(dá)的溫度為39～45℃，時(shí)間3～7小時(shí)；(3)加糖時(shí)刻及方式選擇加糖方式采取慢速加糖方式，加糖量為100～350g，且在0.5～3小時(shí)加完；(4)發(fā)酵液酸堿度調(diào)節(jié)采用酸堿自動(dòng)平衡調(diào)節(jié)pH值，使pH值維持在6.5～7.5之間；(5)溶氧水平通過通氣量與轉(zhuǎn)速自動(dòng)調(diào)節(jié)溶氧，維持在40％以上水平。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述之方法，其特征是調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值采用氫氧化鈉和鹽酸自動(dòng)平衡調(diào)節(jié)。
全文摘要
本發(fā)明是一種生產(chǎn)抗癌藥物工程菌即DH5a－pBVnm23－H1的發(fā)酵方法研究。該法包括如下步驟發(fā)酵培養(yǎng)基配方篩選和發(fā)酵工藝條件選定。配方包括酵母提取物、蛋白胨、葡萄糖等組成，發(fā)酵工藝包括菌種的加入量及其最佳生長時(shí)期，工程菌生長和誘導(dǎo)表達(dá)的時(shí)間及溫度、加糖時(shí)刻及方式選擇，發(fā)酵液酸堿度的調(diào)節(jié)等。用本發(fā)明培養(yǎng)基配方及所建立的發(fā)酵工藝進(jìn)行DH5a－pBVnm23－H1的發(fā)酵，具有菌體得率高、目標(biāo)蛋白表達(dá)量高、時(shí)間短、成本低等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1412297SQ01129780
公開日2003年4月23日 申請(qǐng)日期2001年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月18日
發(fā)明者王一飛, 張美英, 錢垂文, 李久香 申請(qǐng)人:暨南大學(xué)