專利名稱：肌酐含量測(cè)定方法及肌酐診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種測(cè)定肌酐含量的方法，同時(shí)本發(fā)明還涉及用于實(shí)現(xiàn)該方法的肌酐診斷試劑盒，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
測(cè)定肌酐主要有化學(xué)測(cè)定法(Jaffe法)、酶法、高效液相層析法和毛細(xì)管電泳法等。
化學(xué)測(cè)定法——成本低廉，操作簡(jiǎn)便，是目前國內(nèi)測(cè)定肌酐最常用的方法之一。標(biāo)本中的肌酐與苦味酸鹽作用生成黃紅色的苦味酸肌酐復(fù)合物。此法的缺點(diǎn)是特異性不高，因?yàn)榫S生素C、丙酮、乙酰乙酸、甲基多巴以及高濃度葡萄糖、蛋白質(zhì)和一些抗生素如青霉素G、頭孢西丁、頭孢唑啉等也能與堿性苦味酸反應(yīng)生成紅色。
高效液相層析法(HPLC)——肌酐在弱酸性環(huán)境中帶正電荷，通過陽離子交換層析柱可與其他成分很好分離，在234nm測(cè)定其光吸收。此法分析的精密度高、特異性好，但本法不適于大批量臨床標(biāo)本分析，通常僅作為肌酐測(cè)定的參考方法，用于評(píng)價(jià)市售肌酐測(cè)定的試劑盒和某些科研目的。
毛細(xì)管電泳法——血清標(biāo)本用高速離心作預(yù)處理，尿液標(biāo)本可用低速離心，除去有形成分，上清液用膠束動(dòng)電毛細(xì)管電泳分離后測(cè)定235nm處吸光度。本法測(cè)定線性范圍寬，操作較為簡(jiǎn)便，但需用特殊設(shè)備和進(jìn)行血清標(biāo)本的預(yù)處理，臨床常規(guī)使用困難。
酶學(xué)測(cè)定法——主要有肌酐脫亞胺酶(Creatinine deiminase)和肌酐酶(Creatininase)兩大類。檢索發(fā)現(xiàn)，申請(qǐng)?zhí)枮?2139298.6、申請(qǐng)日為2002.11.15的專利申請(qǐng)公開了應(yīng)用酶反應(yīng)產(chǎn)物氧化型煙酰胺輔酶配制的測(cè)定試劑。該發(fā)明所指的酶法測(cè)定試劑并不加入測(cè)定反應(yīng)所需的還原型煙酰胺輔酶或其類似物，而加入其反應(yīng)產(chǎn)物氧化型煙酰胺輔酶或其類似物及其相應(yīng)的生成還原型輔酶所需的酶和底物系統(tǒng)，通過在試劑內(nèi)形成酶-底物-NAD或酶-底物-NADP等慢反應(yīng)系統(tǒng)，將這類氧化型輔酶或其類似物緩慢循環(huán)還原為還原型煙酰胺輔酶或其類似物。當(dāng)被還原的還原型煙酰胺輔酶或其類似物達(dá)到一定的濃度時(shí)，該發(fā)明所指的酶法試劑就可達(dá)到測(cè)定樣本中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、尿素、氨、肌酐和二氧化碳等的目的。該發(fā)明的特點(diǎn)在于為丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑、尿素養(yǎng)試劑、氨試劑、肌酐試劑和二氧化碳試劑等的測(cè)試提供一個(gè)內(nèi)源合成丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑、尿素養(yǎng)試劑、氨試劑、肌酐試劑和二氧化碳試劑等反應(yīng)所需要的底物—還原型煙酰胺輔酶。其缺點(diǎn)之一為，這個(gè)系統(tǒng)在生成反應(yīng)所需要的還原型煙酰氨輔酶的同時(shí)，也抵消了部分丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、尿素、氨、肌酐和二氧化碳等的活性，造成試劑測(cè)試的準(zhǔn)確性大大降低。其缺點(diǎn)之二是，該試劑在正式測(cè)試前必須事先反應(yīng)一段時(shí)間，以便能夠產(chǎn)生足夠的還原型煙酰氨輔酶，這樣一來就造成了緩不濟(jì)急的結(jié)果，給測(cè)試帶來很大的不便。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種可以克服以上現(xiàn)有技術(shù)缺點(diǎn)的肌酐含量的測(cè)定方法，同時(shí)給出實(shí)現(xiàn)該方法的肌酐診斷試劑盒，采用該試劑盒中的試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或者半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行肌酐含量測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明測(cè)定肌酐含量的步驟如下1)、將樣品與主要由腺苷三磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、還原型輔酶、肌酐脫亞胺酶、N-甲基海因酶、氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶組成的試劑混合，使之發(fā)生如下原理的反應(yīng)肌酐+水+H+肌酐脫亞胺酶N-甲基海因+氨離子N-甲基海因+水+腺苷三磷酸N-甲基海因酶氨甲酰肌氨酸+腺苷二磷酸+磷酸根氨甲酰肌氨酸+水氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶肌氨酸+氨離子+碳酸氫根二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根草酰乙酸+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶蘋果酸+輔酶2)、檢測(cè)最終反應(yīng)物在主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速度，測(cè)算出肌酐含量的大小。
通常步驟2)將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或者半、全自動(dòng)生化分析儀器下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速度，測(cè)算出肌酐含量的大小。
以上樣品與試劑的混合比例按體積為1/10到1/250，以上過程的測(cè)定溫度控制在常規(guī)的20℃到50℃范圍，反應(yīng)時(shí)間控制在常規(guī)的2-30分鐘。
本發(fā)明應(yīng)用肌酐脫亞胺酶偶聯(lián)N-甲基海因酶、氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶反應(yīng)比色或連續(xù)監(jiān)測(cè)法。肌酐脫亞胺酶水解肌酐產(chǎn)生N-甲基海因，然后N-甲基海因酶作用于N-甲基海因和腺苷三磷酸產(chǎn)生氨甲酰肌氨酸，再通過氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶產(chǎn)生碳酸氫根(二氧化碳)，再通過偶聯(lián)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶作用產(chǎn)生草酰乙酸，再通過偶聯(lián)蘋果酸脫氫酶的作用，將還原型輔酶(NADH、NADPH或其它類似物——在340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(NAD+、NADP+或其它類似物——在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測(cè)定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的速(程)度，通過測(cè)量340nm處吸光度下降的速度，可以測(cè)算肌酐的含量。
用以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明方法的肌酐診斷試劑盒可以是單劑，包括緩沖液 40——200mmol/l腺苷三磷酸 0.2——20mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 1——20mmol/l還原型輔酶 0.2——0.3mmol/l肌酐脫亞胺酶1000——20000U/lN-甲基海因酶1000——20000U/l氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶 1000——10000U/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 2000——20000U/l蘋果酸脫氫酶2000——20000U/l穩(wěn)定劑10——80％(總體積)也可以將以上單劑配成如下雙劑，更有利于消除內(nèi)、外源碳酸氫根污染試劑I緩沖液 40——200mmol/l腺苷三磷酸 0.2——20mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 1——20mmol/l還原型輔酶 0.2——0.3mmol/lN-甲基海因酶1000——20000U/l
氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶 1000——10000U/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 2000——20000U/l蘋果酸脫氫酶2000——20000U/l穩(wěn)定劑10——80％(總體積)試劑II緩沖液 40——200mmol/l肌酐脫亞胺酶1000——20000U/l穩(wěn)定劑10——80％(總體積)雙劑的配方不僅限于上述配方，其中的試劑I的成分，腺苷三磷酸、N-甲基海因酶、氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶等可以放在試劑II，試劑II其中的成分，肌酐脫亞胺酶也可以放在試劑I，如此可以形成多種配方，不在此一一詳述。
還可以將試劑配成如下三試劑，不但更有利于消除內(nèi)、外源碳酸氫根污染，還更有利于試劑的穩(wěn)定試劑I緩沖液 40——200mmol/l腺苷三磷酸 0.2——20mmo l/l磷酸烯醇式丙酮酸 1——20mmol/l還原型輔酶 0.2——0.3mmol/l穩(wěn)定劑10——80mmol/l試劑II緩沖液 40——200mmol/lN-甲基海因酶1000——20000U/l氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶 1000——10000U/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 2000——20000U/l
蘋果酸脫氫酶2000——20000U/l穩(wěn)定劑10——80％(總體積)試劑III緩沖液 40——200mmol/l肌酐脫亞胺酶1000——20000U/l穩(wěn)定劑10——80％(總體積)三劑的配方不僅限于上述配方。其中的試劑I的成分，腺苷三磷酸可以放在試劑II或試劑III中，磷酸烯醇式丙酮酸、還原型輔酶可以放在試劑II中。試劑II其中的成分，N-甲基海因酶、氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶等也可以放在試劑I或試劑III中，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶也可以放在試劑I中。試劑III其中的成分，肌酐脫亞胺酶也可以放在試劑I或試劑II中。如此可以形成多種配方，不一一詳述。
緩沖劑的pH范圍可以是6.0～11.0。緩沖劑可以是三(羧甲基)氨基甲烷—鹽酸(Tris-HCl)緩沖液、磷酸鹽(Phosphate)緩沖液、三乙醇胺(Triethanolamine)緩沖液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-1-propanol)緩沖液、咪唑(Imidazole)緩沖液或雙甘氨肽(Glycylglycine)緩沖液等，但不僅限于這些緩沖液。
以上還原型輔酶可以是NADPH、NADH或thio-NADH等還原型煙酰胺輔酶或其衍生物。
此外，為了減少各試劑成分之間的交叉影響、保持試劑的穩(wěn)定性，以便長(zhǎng)期儲(chǔ)存，以上單劑、雙劑的試劑I、試劑II或三劑的試劑I、試劑II、試劑III中通常加入穩(wěn)定劑10～80％或者10～50mmol/l，穩(wěn)定劑可以是乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸胺或鹽等中的一種或一種以上。
實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下配方成分關(guān)系的本發(fā)明肌酐診斷試劑盒較為理想緩沖液 80——120mmol/l腺苷三磷酸 2——10mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 6——16mmol/l還原型輔酶 0.2——0.3mmol/l肌酐脫亞胺酶6000——12000U/lN-甲基海因酶6000——12000U/l氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶 4000——8000U/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 6000——12000U/l蘋果酸脫氫酶8000——16000U/l穩(wěn)定劑20——50％(總體積)由于本發(fā)明是完全利用酶學(xué)方法，酶解反應(yīng)具有特異性高的特點(diǎn)，不易受到內(nèi)、外源其他物質(zhì)的干擾。酶法方法簡(jiǎn)便、易于操作。酶解反應(yīng)的特異性促使測(cè)試結(jié)果精確。酶解反應(yīng)都是在緩沖液條件下進(jìn)行，沒有污染環(huán)境問題。酶法方法不需要特殊、額外的儀器，測(cè)試成本低廉。因此可以保證具有較高的測(cè)試準(zhǔn)確性，更便于推廣應(yīng)用。
此外，本發(fā)明的顯著特色之一是可以消除內(nèi)、外源碳酸氫根的污染，消除內(nèi)、外源碳酸氫根的作用發(fā)生在整個(gè)反應(yīng)時(shí)間段的前半部分，在后半段時(shí)間受污染的內(nèi)、外源碳酸氫根已經(jīng)被消耗殆盡，而在后半段時(shí)間測(cè)試肌酐含量所需要的碳酸氫根都是產(chǎn)生于肌酐的含量。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
實(shí)施例一(單劑)
本實(shí)施例的肌酐診斷試劑盒包括緩沖液80mmol/l腺苷三磷酸 2mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 6mmol/l還原型輔酶 0.2mmol/l肌酐脫亞胺酶 6000U/lN-甲基海因酶 6000U/l氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶 4000U/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 6000U/l蘋果酸脫氫酶 8000U/l穩(wěn)定劑50％(總體積)在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm以上，被測(cè)肌酐樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)。
加入樣品和試劑后，使之混合，發(fā)生以下反應(yīng)肌酐+水+H+肌酐脫亞胺酶N-甲基海因+氨離子N-甲基海因+水+腺苷三磷酸N-甲基海因酶氨甲酰肌氨酸+腺苷二磷酸+磷酸根氨甲酰肌氨酸+水氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶肌氨酸+氨離子+碳酸氫根二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根草酰乙酸+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶蘋果酸+輔酶將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速(程)度，測(cè)算出肌酐的含量。
本實(shí)施例應(yīng)用肌酐脫亞胺酶偶聯(lián)N-甲基海因酶、氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶反應(yīng)比色或連續(xù)監(jiān)測(cè)法。肌酐脫亞胺酶水解肌酐產(chǎn)生N-甲基海因，然后N-甲基海因酶作用于N-甲基海因和腺苷三磷酸產(chǎn)生氨甲酰肌氨酸，再通過氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶產(chǎn)生碳酸氫根(二氧化碳)，再通過偶聯(lián)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶作用產(chǎn)生草酰乙酸，再通過偶聯(lián)蘋果酸脫氫酶的作用，將還原型輔酶(NADH、NADPH或其它類似物——在340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(NAD+、NADP+或其它類似物——在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測(cè)定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的速(程)度，通過測(cè)量340nm處吸光度下降的速度，可以測(cè)算肌酐的含量。
實(shí)施例二(雙劑)本實(shí)施例的肌酐診斷試劑有試劑I緩沖液 100mmol/l腺苷三磷酸 6mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 10mmol/l還原型輔酶 0.25mmol/lN-甲基海因酶 9000U/l氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶 6000U/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 9000U/l蘋果酸脫氫酶 12000U/l穩(wěn)定劑50％(總體積)試劑II緩沖液 100mmol/l
肌酐脫亞胺酶 9000U/l穩(wěn)定劑 50％(總體積)測(cè)定肌酐含量時(shí)，溫度控制在30℃，反應(yīng)時(shí)間15分鐘，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm以上，被測(cè)肌酐樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)。
具體測(cè)定步驟為肌酐+水+H+肌酐脫亞胺酶N-甲基海因+氨離子N-甲基海因+水+腺苷三磷酸N-甲基海因酶氨甲酰肌氨酸+腺苷二磷酸+磷酸根氨甲酰肌氨酸+水氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶肌氨酸+氨離子+碳酸氫根二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根草酰乙酸+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶蘋果酸+輔酶將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速(程)度，測(cè)算出肌酐的含量。
各反應(yīng)步驟的反應(yīng)時(shí)間控制在15分鐘。
實(shí)施例三(三劑)本實(shí)施例的肌酐診斷試劑為三劑，有試劑I緩沖液120mmol/l腺苷三磷酸 10mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 16mmol/l還原型輔酶0.3mmol/l穩(wěn)定劑 20mmol/l
試劑II緩沖液120mmol/lN-甲基海因酶 12000U/l氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶 8000U/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 12000U/l蘋果酸脫氫酶 16000U/l穩(wěn)定劑 50％(總體積)試劑III緩沖液120mmol/l肌酐脫亞胺酶 12000U/l穩(wěn)定劑 50％(總體積)在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度25℃，反應(yīng)時(shí)間20分鐘，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm以上，被測(cè)肌酐樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)。
具體測(cè)定步驟為肌酐+水+H+肌酐脫亞胺酶N-甲基海因+氨離子N-甲基海因+水+腺苷三磷酸N-甲基海因酶氨甲酰肌氨酸+腺苷二磷酸+磷酸根氨甲酰肌氨酸+水氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶肌氨酸+氨離子+碳酸氫根二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根草酰乙酸+還原型輔酶草果酸脫氫酶蘋果酸+輔酶將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速(程)度，測(cè)算出肌酐的含量。
各反應(yīng)步驟的反應(yīng)時(shí)間控制在20分鐘。
實(shí)施例四本實(shí)施例的肌酐診斷試劑有試劑I緩沖液 100mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸10mmol/l還原型輔酶0.25mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 8000U/l蘋果酸脫氫酶12000U/l穩(wěn)定劑 50％(總體積)試劑II緩沖液 100mmol/l腺苷三磷酸 4mmol/l肌酐脫亞胺酶 8000U/lN-甲基海因酶 8000U/l氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶 6000U/l穩(wěn)定劑 50％(總體積)在生化分析儀上設(shè)定溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm以上，被測(cè)肌酐樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)。
加入樣品和試劑后，使之混合，發(fā)生以下反應(yīng)肌酐+水+H+肌酐脫亞胺酶N-甲基海因+氨離子N-甲基海因+水+腺苷三磷酸N-甲基海因酶氨甲酰肌氨酸+腺苷二磷酸+磷酸根氨甲酰肌氨酸+水氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶肌氨酸+氨離子+碳酸氫根二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根草酰乙酸+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶蘋果酸+輔酶將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速(程)度，測(cè)算出肌酐的含量。
總之，實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過紫外/可見光分析儀或者半、全自動(dòng)生化分析儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，不受內(nèi)、外源物質(zhì)的污染。
權(quán)利要求
1.一種肌酐含量測(cè)定方法，步驟如下1)、將樣品與主要由腺苷三磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、還原型輔酶、肌酐脫亞胺酶、N-甲基海因酶、氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶組成的試劑混合，使之發(fā)生如下反應(yīng)肌酐+水+H+肌酐脫亞胺酶N-甲基海因+氨離子N-甲基海因+水+腺苷三磷酸N-甲基海因酶氨甲酰肌氨酸+腺苷二磷酸+磷酸根氨甲酰肌氨酸+水氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶肌氨酸+氨離子+碳酸氫根二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根草酰乙酸+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶蘋果酸+輔酶2)、檢測(cè)最終反應(yīng)物在主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速度，測(cè)算出肌酐含量的大小。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述肌酐含量測(cè)定方法，其特征在于所述步驟2)為將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或者半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速(程)度，測(cè)算出肌酐的含量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述肌酐含量測(cè)定方法，其特征在于溫度控制在20℃到50℃范圍，反應(yīng)時(shí)間控制在2-30分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述肌酐含量測(cè)定方法，其特征在于被測(cè)肌酐樣品與試劑的比例控制在1/10到1/500。
5.一種肌酐診斷試劑盒，由以下成分組成緩沖液 40——200mmol/l腺苷三磷酸 0.2——20mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸1——20mmol/l還原型輔酶 0.2——0.3mmol/l肌酐脫亞胺酶1000——20000U/lN-甲基海因酶1000——20000U/l氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶 1000——10000U/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 2000——20000U/l蘋果酸脫氫酶2000——20000U/l穩(wěn)定劑 10——80％(總體積)
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述肌酐診斷試劑盒，其特征在于所述試劑配成單劑、雙劑或三劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述肌酐診斷試劑盒，其特征在于所述穩(wěn)定劑為乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸銨或鹽中的至少一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述肌酐診斷試劑盒，其特征在于所述緩沖劑的pH范圍是6.0～11.0，所述緩沖劑可以是三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液、三乙醇胺緩沖液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩沖液、咪唑緩沖液或雙甘氨肽緩沖液中的一種。
9.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述肌酐診斷試劑盒，其特征在于所述還原型輔酶是NADPH、NADH或thio-NADH還原型煙酰胺輔酶或其衍生物中的一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種測(cè)定肌酐含量的方法，同時(shí)本發(fā)明還涉及肌酐診斷試劑盒，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。該試劑盒包括緩沖液、腺苷三磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、還原型輔酶、肌酐脫亞胺酶、N－甲基海因酶、氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶、穩(wěn)定劑，通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生酶偶聯(lián)反應(yīng)，再將最終反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)吸光度變化的情況(速度)，從而測(cè)算出肌酐的含量。采用本發(fā)明完全可以通過生化分析儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，不受內(nèi)外源物質(zhì)的污染，便于推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/32GK1757748SQ20041006488
公開日2006年4月12日 申請(qǐng)日期2004年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月10日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:王爾中