專利名稱：工業(yè)化卵黃反應(yīng)干燥培養(yǎng)基制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種微生物檢驗(yàn)培養(yǎng)基的制備方法，具體地說涉及一種工業(yè)化卵黃反應(yīng)干燥培養(yǎng)基制備方法。
背景技術(shù)：
在微生物領(lǐng)域中，培養(yǎng)基因其制備方法的不同分為兩大類干燥培養(yǎng)基和不可干燥培養(yǎng)基。干燥培養(yǎng)基制備工藝簡單、使用方便、可工業(yè)化生產(chǎn)而被廣泛應(yīng)用。隨著微生物技術(shù)的不斷發(fā)展，許多不可干燥培養(yǎng)基已被研制成為干燥培養(yǎng)基。但目前含卵黃成分的培養(yǎng)基，由于含有遇熱不穩(wěn)定成分，無法制成干燥培養(yǎng)基，只能使用時(shí)臨時(shí)配制。傳統(tǒng)卵黃反應(yīng)培養(yǎng)基的制備過程分為三步①培養(yǎng)基高溫滅菌穩(wěn)定成分，混合制備后高壓滅菌，制成制劑A；②卵黃不穩(wěn)定成分用無菌操作方法制成制劑B(卵黃混懸液)；③將制劑A和制劑B按無菌操作方法，在55℃左右混合制成所需要的卵黃反應(yīng)完全培養(yǎng)基，此培養(yǎng)基一旦制成只能一次性使用，不能再次加熱。從上述配制過程可以看出，由于卵黃中含有遇熱不穩(wěn)定成分，使得制備十分繁瑣且難度大，溫度和無菌操作不當(dāng)，隨時(shí)可能使實(shí)驗(yàn)失敗。為此，英國Oxoid.Ltd.公司研制了“濃縮卵黃乳懸液”并申請(qǐng)了專利，英國的專利產(chǎn)品實(shí)際上是上述傳統(tǒng)制備過程中的制劑B，并沒有解決卵黃成分遇熱不穩(wěn)定的問題，僅是一個(gè)中間產(chǎn)品，卵黃反應(yīng)培養(yǎng)基的制備過程還需將制劑A和制劑B混合，其操作同樣復(fù)雜，無法實(shí)現(xiàn)卵黃反應(yīng)培養(yǎng)基的工業(yè)化生產(chǎn)。由于卵黃反應(yīng)培養(yǎng)基存在遇熱不穩(wěn)定、不能工業(yè)化生產(chǎn)的缺點(diǎn)，給檢驗(yàn)帶來極大不便，如成本高、制備復(fù)雜、準(zhǔn)確性及重現(xiàn)性差等，國內(nèi)許多檢驗(yàn)人員一提到配制卵黃反應(yīng)培養(yǎng)基就感到頭疼。目前，美國、日本等許多發(fā)達(dá)國家的科研人員正在攻克這一技術(shù)難題，但至今尚未研制出卵黃反應(yīng)干燥培養(yǎng)基。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種可工業(yè)化生產(chǎn)、配制簡單、使用方便、成本低的卵黃反應(yīng)干燥培養(yǎng)基制備方法。
本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)措施來實(shí)現(xiàn)一種工業(yè)化卵黃反應(yīng)干燥培養(yǎng)基的制備方法，其步驟包括(一)卵黃有效成分的提取取20g雞蛋黃，用200ml丙酮分三次提取，過濾，合并濾液；濾渣加入200ml乙醇分三次提取，過濾、合并濾液；分別蒸餾除去乙醇，得乙醇提取物；蒸餾除去丙酮，得丙酮提取物；(二)卵黃乳懸液的制取取上述乙醇提取物或其它卜r汕磷脂0.001-1g、上述丙酮提取物或其它中性脂肪0.001-1g，再加入TritonX類表面活性劑0.001-1g、有機(jī)胺衍生物類陽離子表面活性劑或聚乙二醇類表面活性劑0.001-1g、金屬陽離子0.001-0.5g，將其混合，加入8-12ml 9％氯化鈉水溶液研磨，使其乳化均勻，制成卵黃乳懸液，該卵黃乳懸液可替代傳統(tǒng)方法制成的卵黃乳懸液，并可根據(jù)需要加入促進(jìn)細(xì)菌生長的不同營養(yǎng)成分如糖、鹽、胨、 維生素等；(三)稱取厭氧雞蛋瓊脂，KG瓊脂，Kranep氏瓊脂，肝、小牛肉、雞蛋瓊脂，MYP瓊脂(甘露糖卵黃多粘菌素瓊脂)，TSC瓊脂(胰蛋白胨-亞硫酸鹽絲氨酸瓊脂)，卵磷脂卵黃磷蛋白溶液，卵黃高鹽瓊脂，SFP瓊脂或OPSP瓊脂等各種具有卵黃反應(yīng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基或制劑A各成分，用上述制取的卵黃乳懸液按比例等量替代傳統(tǒng)方法制成的卵黃乳懸液，與基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分混合(根據(jù)培養(yǎng)基的硬度需要，適量加入瓊脂粉)，用NaHCO3或NaOH調(diào)整培養(yǎng)基PH值，在溫度100±20℃干燥，然后粉碎、150μm±6.6μm過篩、分裝，即制得各種卵黃反應(yīng)干燥培養(yǎng)基。
上述除乙醇提取的卵黃有效成分外，其它甘油磷脂是指豆磷脂、卵磷脂、腦磷脂、肌醇磷脂、縮醛磷脂、絲氨酸磷脂、神經(jīng)鞘磷脂、溶血卵磷脂或溶血腦磷脂等。
上述除丙酮提取的卵黃有效成分外，其它中性脂肪是指三酰甘油脂，其中三酰甘油脂的R1、R2、R3包括C4～C9短鏈脂肪酸、C10～C15中鏈脂肪酸、C16～C19長鏈脂肪酸及C20以上超長鏈脂肪酸；飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸及多不飽和脂肪酸。
上述TritonX類表面活性劑是指TritonX-45、TritonX-100、TritonX-101、TritonX-102、TritonX-114、TritonX-155、TritonX-165、TritonX-200、TritonX-405或TritonX-805等。
上述有機(jī)胺衍生物類陽離子表面活性劑是指三辛胺、溴化三辛胺、氯化三辛胺、三異辛胺、氯化三辛基甲基銨、三辛基甲基氯化銨、三辛基庚烷銨、甲基三正辛胺、溴化乙基三甲銨、溴化辛基三甲銨、溴化四甲基銨、二羥基二乙基十八胺、氟化羥乙基三甲銨、溴化羥乙基三甲銨、碘化羥乙基三甲銨、碘化四甲銨、溴化癸基三甲銨、膽胺、三正己胺、三乙醇胺、二羥基乙基十二胺、月桂基二乙醇酰胺、二甲基十二胺、四丁基溴化銨、氯化甲基芐乙銨、溴化四丁基銨、四丁基硫酸氫銨、氯化羥乙基三甲銨、氯化二乙基芐銨、四丁基碘化銨、四庚基銨、氯化四丁基銨、氟化四丁基銨、四乙基溴化銨、氯化二甲基芐銨、月桂醇乙基銨、溴化芐基辛基二甲銨、膽堿、乙酰膽堿、檸檬酸二氫膽堿、葡萄糖酸膽堿、碳酸氫膽堿聚氧乙烯十二烷銨或氯化芐基二甲銨等；聚乙二醇類表面活性劑是指PEG-200、PEG-300、PEG-400、PEG-600、PEG-1000、PEG 1500、PEG-2000、PEG-3000、PEG-4000、PEG-5000、PEG-6000或PEG-8000等。
上述金屬陽離子是指Ca2+、Mg2+、Fe2+、Fe3+、Zn2+、Cu2+、Cu+、Ag+、Al2+或Al3+等。
本發(fā)明提供的卵黃反應(yīng)干燥培養(yǎng)基制備方法，使卵黃反應(yīng)干燥培養(yǎng)基的工業(yè)化生產(chǎn)成為可能，檢驗(yàn)人員實(shí)驗(yàn)時(shí)再不需要臨時(shí)配制，只需取干粉加蒸餾水滅菌后，澆碟制成平板即可使用，并可二次加熱反復(fù)使用，大大簡化了實(shí)驗(yàn)過程，使用方便、成本低、實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差小，從而使卵黃反應(yīng)培養(yǎng)基的應(yīng)用領(lǐng)域得到極大的拓展，可廣泛用于食品檢驗(yàn)、醫(yī)院微生物檢驗(yàn)、海關(guān)微生物檢驗(yàn)、化妝品檢驗(yàn)、藥品檢驗(yàn)、生物制品檢驗(yàn)、獸醫(yī)獸藥部門的微生物檢驗(yàn)以及農(nóng)業(yè)、科研部門的微生物檢驗(yàn)，尤具為特殊環(huán)境中的醫(yī)療、預(yù)防提供了快速的微生物檢驗(yàn)方法，涉及領(lǐng)域非常廣泛。
(四)
具體實(shí)施例方式
(四)鑒別對(duì)比實(shí)驗(yàn)1、以傳統(tǒng)方法制備厭氧雞蛋瓊脂培養(yǎng)基平板；2、制作厭氧雞蛋瓊脂干燥培養(yǎng)基平板稱取厭氧雞蛋瓊脂干燥培養(yǎng)基干粉6.8g，加100ml蒸餾水，溶解，10磅30分鐘滅菌，澆碟制成平板，備用。
3、分別在兩種平板上接種肉毒梭狀芽胞桿菌，35℃厭氧培養(yǎng)，結(jié)果見表1表1兩種培養(yǎng)基鑒別肉毒梭狀芽胞桿菌的結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明肉毒梭狀芽胞桿菌在兩種厭氧雞蛋瓊脂平板上的鑒別效果一致。
需要說明的是MYP瓊脂培養(yǎng)基傳統(tǒng)配方中加入的制劑C多粘菌素B硫酸鹽，可按傳統(tǒng)制備方法于49±1℃時(shí)加入；因本發(fā)明卵黃反應(yīng)有效成分經(jīng)過調(diào)整，鑒別特異性增強(qiáng)，也可不加制劑C多粘菌素B硫酸鹽。
(三)鑒別對(duì)比實(shí)驗(yàn)1、以傳統(tǒng)方法制備MYP瓊脂培養(yǎng)基平板；2、制作MYP瓊脂干燥培養(yǎng)基平板稱取MYP瓊脂干燥培養(yǎng)基干粉5.9g，加100ml蒸餾水，10磅30分鐘滅菌，澆碟制成平板，備用。
3、兩種平板分別接種蠟樣芽胞桿菌，32℃培養(yǎng)，結(jié)果見表2表2兩種培養(yǎng)基鑒別蠟樣芽胞桿菌的結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明蠟樣芽胞桿菌在兩種MYP瓊脂平板上的鑒別效果一致。
3、兩種平板分別接種產(chǎn)氣莢膜梭狀芽胞利菌，35-37℃厭氧培養(yǎng)，結(jié)果見表3表3兩種培養(yǎng)基鑒別產(chǎn)氣莢膜梭狀芽胞桿菌的結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明產(chǎn)氣莢膜梭狀芽胞桿菌在兩種厭氧雞蛋瓊脂平板上的鑒別效果一致。
3、兩種平板分別接種金黃色匍萄球菌，在35℃培養(yǎng)，結(jié)果見表4
表4兩種培養(yǎng)基鑒別金黃色葡萄球菌的結(jié)果

表5兩種培養(yǎng)基平板的外觀及物理性質(zhì)的比較

*注以“+”的多少，表示平板的透明程度表4、5實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明亞碲酸鹽多粘菌素卵黃瓊脂干燥培養(yǎng)基與亞碲酸鹽多粘菌素卵黃瓊脂培養(yǎng)基對(duì)金黃色葡萄球菌的鑒別效果一致，且干燥后培養(yǎng)基透明度優(yōu)于傳統(tǒng)方法制備的亞碲酸鹽多粘菌素卵黃瓊脂培養(yǎng)基平板，更有利于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察。
權(quán)利要求
1.一種工業(yè)化卵黃反應(yīng)干燥培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于它包括以下步驟(一)卵黃有效成分的提取取20g雞蛋黃，用200ml丙酮分三次提取，過濾，合并濾液；濾渣加入200ml乙醇分三次提取，過濾、合并濾液；分別蒸餾除去乙醇，得乙醇提取物；蒸餾除去丙酮，得丙酮提取物；(二)卵黃乳懸液的制取取上述乙醇提取物或其它甘油磷脂0.001-1g、上述丙酮提取物或其它中性脂肪0.001-1g，再加入TritonX類表面活性劑0.001-1g、有機(jī)胺衍生物類陽離子表面活性劑或聚乙二醇類表面活性劑0.001-1g、金屬陽離子0.001-0.5g，將其混合，加入8-12ml 9％氯化鈉水溶液研磨，使其乳化均勻，制成卵黃乳懸液，該卵黃乳懸液可替代傳統(tǒng)方法制成的卵黃乳懸液，并可根據(jù)需要加入促進(jìn)細(xì)菌生長的不同營養(yǎng)成分如糖、鹽、胨、 、維生素等；(三)稱取厭氧雞蛋瓊脂，KG瓊脂，Kranep氏瓊脂，肝、小牛肉、雞蛋瓊脂，MYP瓊脂，TSC瓊脂，卵磷脂卵黃磷蛋白溶液，卵黃高鹽瓊脂，SFP瓊脂或OPSP瓊脂等各種具有卵黃反應(yīng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基或制劑A各成分，用上述制取的卵黃乳懸液按比例等量替代傳統(tǒng)方法制成的卵黃乳懸液，與基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分混合，用NaHCO3或NaOH調(diào)整培養(yǎng)基PH值，在溫度100±20℃干燥，然后粉碎、150μm±6.6μm過篩、分裝，即制得各種卵黃反應(yīng)干燥培養(yǎng)基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工業(yè)化卵黃反應(yīng)干燥培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于上述除乙醇提取的卵黃有效成分外，其它甘油磷脂是指豆磷脂、卵磷脂、腦磷脂、肌醇磷脂、縮醛磷脂、絲氨酸磷脂、神經(jīng)鞘磷脂、溶血卵磷脂或溶血腦磷脂等。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工業(yè)化卵黃反應(yīng)干燥培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于上述除丙酮提取的卵黃有效成分外，其它中性脂肪是指三酰甘油脂，其中三酰甘油脂的R1、R2、R3包括C4～C9短鏈脂肪酸、C10～C15中鏈脂肪酸、C16～C19長鏈脂肪酸及C20以上超長鏈脂肪酸；飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸及多不飽和脂肪酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工業(yè)化卵黃反應(yīng)干燥培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于上述TritonX類表面活性劑是指TritonX-45、TritonX-100、TritonX-101、TritonX-102、TritonX-114、TritonX-155、TritonX-165、TritonX-200、TritonX-405或TritonX-805等。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工業(yè)化卵黃反應(yīng)干燥培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于上述有機(jī)胺衍生物類陽離子表面活性劑是指三辛胺、溴化三辛胺、氯化三辛胺、三異辛胺、氯化三辛基甲基銨、三辛基甲基氯化銨、三辛基庚烷銨、甲基三正辛胺、溴化乙基三甲銨、溴化辛基三甲銨、溴化四甲基銨、二羥基二乙基十八胺、氟化羥乙基三甲銨、溴化羥乙基三甲銨、碘化羥乙基三甲銨、碘化四甲銨、溴化癸基三甲銨、膽胺、三正己胺、三乙醇胺、二羥基乙基十二胺、月桂基二乙醇酰胺、二甲基十二胺、四丁基溴化銨、氯化甲基芐乙銨、溴化四丁基銨、四丁基硫酸氫銨、氯化羥乙基三甲銨、氯化二乙基芐銨、四丁基碘化銨、四庚基銨、氯化四丁基銨、氟化四丁基銨、四乙基溴化銨、氯化二甲基芐銨、月桂醇乙基銨、溴化芐基辛基二甲銨、膽堿、乙酰膽堿、檸檬酸二氫膽堿、葡萄糖酸膽堿、碳酸氫膽堿聚氧乙烯十二烷銨或氯化芐基二甲銨等；聚乙二醇類表面活性劑是指PEG-200、PEG-300、PEG-400、PEG-600、PEG-1000、PEG-1500、PEG-2000、PEG-3000、PEG-4000、PEG-5000、PEG-6000或PEG-8000等。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工業(yè)化卵黃反應(yīng)干燥培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于上述上述金屬陽離子是指Ca2+、Mg2+、Fe2+、Fe3+、Zn2+、Cu2+、Cu+、Ag+、Al2+或Al3+等。
全文摘要
一種工業(yè)化卵黃反應(yīng)干燥培養(yǎng)基的制備方法，它包括以下步驟用無水乙醇和丙酮提取卵黃有效成分或用其它甘油磷脂、中性脂肪與TritonX類表面活性劑、有機(jī)胺衍生物類陽離子表面活性劑或聚乙二醇類表面活性劑、金屬陽離子混合，加入氯化鈉水溶液研磨，使其乳化均勻，制取卵黃乳懸液；再稱取具有卵黃反應(yīng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基或制劑A各成分與卵黃乳懸液混合，調(diào)整培養(yǎng)基pH值，再經(jīng)干燥、粉碎、過篩、分裝，即制得各種卵黃反應(yīng)干燥培養(yǎng)基。該方法使卵黃反應(yīng)干燥培養(yǎng)基的工業(yè)化生產(chǎn)成為可能，配制簡單，簡化了實(shí)驗(yàn)過程，使用方便、成本低、實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差小，從而使卵黃反應(yīng)培養(yǎng)基的應(yīng)用領(lǐng)域得到極大的拓展。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK1414109SQ02141758
公開日2003年4月30日 申請(qǐng)日期2002年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月28日
發(fā)明者宋京都 申請(qǐng)人:宋京都