專利名稱：一種以大孔陰離子樹(shù)脂為填充料的果糖基轉(zhuǎn)移酶的初純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于蛋白分離純化技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種以大孔陰離子樹(shù)脂為填充料的果糖基轉(zhuǎn)移酶的初純化方法。
背景技術(shù)：
隨著人們對(duì)保健食品和低熱量食品需求的增加，自20世紀(jì)80年代以來(lái)出現(xiàn)了一系列所謂的替代甜味劑，包括異麥芽低聚糖、大豆低聚糖、帕拉金糖和低聚果糖在內(nèi)的低聚糖是其中很重要的一類，其重要性在于它們具有難消化、低熱量、降血脂、增殖雙歧桿菌、抗齲齒及美容等獨(dú)特的生理功能。低聚果糖(Fructooligosaccharides，簡(jiǎn)稱F0S)，又稱寡果糖或蔗果三糖族低聚糖，分子式為G-F-Fn，n = 1 3(G為葡萄糖，F(xiàn)為果糖)。低聚果糖是蔗糖分子的果糖殘基上通β -2-1糖苷鍵連接1 3個(gè)果糖基而形成的果糖寡聚體蔗果三糖(1-kestose，GF2)、 蔗果四糖(nystose，GF3)、蔗果五糖(lF-fructofuranosyl nystose，GF4)及其混合物。它一般是利用微生物或植物中具有果糖轉(zhuǎn)移活性的酶作用于蔗糖而得的。目前低聚果糖的工業(yè)生產(chǎn)主要是通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)生的果糖基轉(zhuǎn)移酶 (fructosyltransferase)催化而得到的。由于發(fā)酵得到的果糖基轉(zhuǎn)移酶經(jīng)過(guò)破壁后的酶液含有較多的其它成分，影響果糖基轉(zhuǎn)移酶的催化活性和穩(wěn)定性，因而果糖基轉(zhuǎn)移酶的純化具有重要的現(xiàn)實(shí)和實(shí)踐意義，楊光禮研究員(2002年)和魏遠(yuǎn)安教授(2008年)報(bào)告的果糖基轉(zhuǎn)移酶的純化都是用葡聚糖等實(shí)驗(yàn)性填充料，生產(chǎn)成本高，工業(yè)生產(chǎn)推廣較困難。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種以大孔陰離子樹(shù)脂為填充料來(lái)進(jìn)行果糖基轉(zhuǎn)移酶的初步分離的方法。本方法過(guò)程簡(jiǎn)單，所得到的初步純化的果糖基轉(zhuǎn)移酶具有生產(chǎn)成本低，酶活回收率高，去除的雜蛋白較多，具有廣泛的工業(yè)用途。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)目的的技術(shù)方案如下—種以大孔陰離子樹(shù)脂為填充料的果糖基轉(zhuǎn)移酶的初純化方法，其特征在于將經(jīng)預(yù)處理大孔陰離子樹(shù)脂裝層析柱，用20mmol/mL的pH值為6. 5磷酸緩沖液以2. OmL/min 的流速通過(guò)層析柱，平衡層析柱，將含有果糖基轉(zhuǎn)移酶的粗酶液上樣，用兩倍體積的磷酸緩沖液洗脫，再用兩倍體積的磷酸緩沖液配置的Imol/mL的NaCl溶液Ο-lmol/mL梯度洗脫， 用UV280nm在線監(jiān)測(cè)，收集有酶活的峰，將收集到有酶活的酶液濃縮即得果糖基轉(zhuǎn)移酶。而且，所述大孔陰離子樹(shù)脂為大孔陰離子樹(shù)脂D290。而且，所述預(yù)處理大孔陰離子樹(shù)脂的方法為大孔陰離子樹(shù)脂先用蒸餾水浸泡4h 溶脹，除雜，然后用0. lmol/L的鹽酸浸泡2h，去離子水沖洗至中性；再用0. Imol/L的氫氧化鈉浸泡2h，用去離子水沖洗至中性，用2倍體積的去離子水浸泡，放置于4°C保存?zhèn)溆?。而且，所述果糖基轉(zhuǎn)移酶的粗酶液的制備方法如下
3
將經(jīng)過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)的菌絲體，離心洗凈，收集菌絲體，將菌絲溶于5倍體積的水，球磨機(jī)5000r/min條件下20min，球磨兩次，然后在超高壓均質(zhì)機(jī)IOOOPa破壁兩次，冷凍離心， 超濾濃縮得到粗酶液。而且，所用NaCl溶液梯度為0-lmol/mL。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果如下1、本發(fā)明利用大孔陰離子樹(shù)脂D290作為填充料分離純化果糖基轉(zhuǎn)移酶，樹(shù)脂與果糖基轉(zhuǎn)移酶之間特異吸附，有效去除的雜蛋白，果糖基轉(zhuǎn)移酶被停留在層析柱內(nèi)，經(jīng)過(guò)洗脫液洗脫后獲得純化后的果糖基轉(zhuǎn)移酶，本方法具有生產(chǎn)成本低，使用方便，效率高，酶活回收率高的特點(diǎn)，其具有廣泛的應(yīng)用前景。2、本方法純化過(guò)程簡(jiǎn)單，所得到的初步純化的果糖基轉(zhuǎn)移酶具有生產(chǎn)成本低，酶活回收率高，去除的雜蛋白較多，具有廣泛的工業(yè)用途。3、本發(fā)明還提供了一種游離果糖基轉(zhuǎn)移酶的制備方法，先球磨機(jī)5000r/min條件下20min，球磨兩次，然后在超高壓均質(zhì)機(jī)IOOOPa破壁兩次，胞內(nèi)酶溶出率高，回收率高。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明，下述實(shí)施例是說(shuō)明性的，不是限定性的， 不能以下述實(shí)施例來(lái)限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。以下實(shí)施例總中果糖基轉(zhuǎn)移酶來(lái)自黑曲霉發(fā)酵獲得，本方法同樣適合其他方法或者渠道得到的含有果糖基轉(zhuǎn)移酶的溶液、粗酶液或發(fā)酵液等的純化，方法原理通本方法，不再一一舉例。實(shí)施例1一種以大孔陰離子樹(shù)脂為填充料的果糖基轉(zhuǎn)移酶的初純化方法，步驟如下(1)將黑曲霉(是否有編號(hào))經(jīng)過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)獲得菌絲體，離心洗凈，收集菌絲體，菌絲體可存放于_20°C待用；(2)在菌絲中加入5倍體積的水，球磨機(jī)5000r/min條件下20min，球磨兩次，然后在超高壓均質(zhì)機(jī)IOOOPa破壁兩次，冷凍離心，超濾濃縮得到粗酶液，再冷凍干燥至粉末，放置冰箱長(zhǎng)期保存；(3)樹(shù)脂預(yù)處理將大孔陰離子樹(shù)脂D290用去離子水浸泡4h除雜，然后再用 0. lmol/L的鹽酸浸泡2h，用去離子水沖洗至中性；再用0. lmol/L的氫氧化鈉浸泡2h，用去離子水沖洗至中性，用2倍體積的去離子水浸泡，放置于4°C保存?zhèn)溆茫?4)吸附將處理好的樹(shù)脂裝層析柱，用20mmol/mL的pH值為6. 5磷酸緩沖液 (20mmoVLNa2HPO4-NaH2PO4)以2. OmL/min的流速通過(guò)層析柱，平衡層析柱，再上樣4mL， 用兩倍體積的磷酸緩沖液洗脫，再用兩倍體積的磷酸緩沖液配置的Imol/mL的NaCl溶液 Ο-lmol/mL梯度洗脫。同時(shí)UV280nm在線監(jiān)測(cè)，收集有酶活的峰。(5)將收集到有酶活的酶液用miIlipore離心超濾管(Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units)離心 30min，超濾濃縮脫鹽。(6)測(cè)酶活測(cè)上樣樣品的酶的總酶活308U，比活力為1. 2U/mg,收集到純化后的總酶活為233. 25U，比活力為5. 3U/mg。酶活回收率為75. 7%，純化倍數(shù)為4. 4。實(shí)施例2
4
一種以大孔陰離子樹(shù)脂為填充料的果糖基轉(zhuǎn)移酶的初純化方法，步驟如下(1)將黑曲霉經(jīng)過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)的菌絲體，離心洗凈，收集菌絲體。菌絲體可存放于-20°C待用。(2)加入5倍體積的水，球磨機(jī)5000r/min條件下20min，球磨兩次。然后在超高壓均質(zhì)機(jī)1000 破壁兩次，冷凍離心，超濾濃縮得到粗酶液，再冷凍干燥至粉末，放置冰箱長(zhǎng)期保存。(3)樹(shù)脂預(yù)處理將大孔陰離子樹(shù)脂D290用去離子水浸泡除雜，然后用0. lmol/L 的鹽酸浸泡2h，用去離子水沖洗至中性；再用0. lmol/L的氫氧化鈉浸泡2h，用去離子水沖洗至中性，用2倍體積的去離子水浸泡，放置于4°C保存?zhèn)溆茫?4)吸附將處理好的樹(shù)脂裝層析柱，用20mmol/mL的pH值為6. 5磷酸緩沖液以 2. OmL/min的流速通過(guò)層析柱，平衡層析柱，再上樣3mL，用兩倍體積的磷酸緩沖液洗脫，再用兩倍體積的磷酸緩沖液配置的Imol/mL的NaCl溶液Ο-lmol/mL梯度洗脫。同時(shí)UW80nm 在線監(jiān)測(cè)，收集有酶活的峰。(5)將收集到有酶活的酶液用miIlipore離心超濾管(Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units)離心 30min，超濾濃縮脫鹽。(6)測(cè)酶活測(cè)上樣樣品的酶的總酶活225U，比活力為1. 3U/mg,為收集到純化后的總酶活為168U，比活力為5. 6U/mg。酶活回收率為74. 7%，純化倍數(shù)為4. 3。
權(quán)利要求
1.一種以大孔陰離子樹(shù)脂為填充料的果糖基轉(zhuǎn)移酶的初純化方法，其特征在于將經(jīng)預(yù)處理大孔陰離子樹(shù)脂裝層析柱，用20mmol/mL的pH值為6. 5磷酸緩沖液以2. OmL/min的流速通過(guò)層析柱，平衡層析柱，將含有果糖基轉(zhuǎn)移酶的粗酶液上樣，用兩倍體積的磷酸緩沖液洗脫，再用兩倍體積的磷酸緩沖液配置的Imol/mL的NaCl溶液梯度洗脫，用UV280nm在線監(jiān)測(cè)，收集有酶活的峰，將收集到有酶活的酶液濃縮即得果糖基轉(zhuǎn)移酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以大孔陰離子樹(shù)脂為填充料的果糖基轉(zhuǎn)移酶的初純化方法， 其特征在于所述大孔陰離子樹(shù)脂為大孔陰離子樹(shù)脂D290。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以大孔陰離子樹(shù)脂為填充料的果糖基轉(zhuǎn)移酶的初純化方法， 其特征在于所述預(yù)處理大孔陰離子樹(shù)脂的方法為大孔陰離子樹(shù)脂先用蒸餾水浸泡4h溶脹，除雜，然后用0. lmol/L的鹽酸浸泡2h，去離子水沖洗至中性；再用0. lmol/L的氫氧化鈉浸泡2h，用去離子水沖洗至中性，用2倍體積的去離子水浸泡，放置于4°C保存?zhèn)溆谩?br> 4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以大孔陰離子樹(shù)脂為填充料的果糖基轉(zhuǎn)移酶的初純化方法， 其特征在于所述果糖基轉(zhuǎn)移酶的粗酶液的制備方法如下將經(jīng)過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)的菌絲體，離心洗凈，收集菌絲體，將菌絲溶于5倍體積的水，球磨機(jī) 5000r/min條件下20min，球磨兩次，然后在超高壓均質(zhì)機(jī)IOOOPa破壁兩次，冷凍離心，超濾濃縮得到粗酶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以大孔陰離子樹(shù)脂為填充料的果糖基轉(zhuǎn)移酶的初純化方法， 其特征在于所用NaCl溶液梯度為0-lmol/mL。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種以大孔陰離子樹(shù)脂為填充料的果糖基轉(zhuǎn)移酶的初純化方法，將經(jīng)預(yù)處理大孔陰離子樹(shù)脂裝層析柱，用磷酸緩沖液沖洗層析柱層析柱，平衡層析柱，將含有果糖基轉(zhuǎn)移酶的粗酶液上樣，用兩倍體積的磷酸緩沖液洗脫，再用兩倍體積的磷酸緩沖液配置的1mol/mL的NaCl溶液0-1mol/mL梯度洗脫，用UV280nm在線監(jiān)測(cè)，收集有酶活的峰，將收集到有酶活的酶液濃縮即得果糖基轉(zhuǎn)移酶。本發(fā)明通過(guò)先球磨再超高壓均質(zhì)的方法得到了酶活較高的酶液，再采用大孔陰離子樹(shù)脂D290為填充料對(duì)果糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行初純化，得到具有一定純度的果糖基轉(zhuǎn)移酶，對(duì)于利用果糖就轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)低聚果糖具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義和工業(yè)價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N9/10GK102286439SQ201110249360
公開(kāi)日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2011年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月29日
發(fā)明者劉曉光, 劉逸寒, 李玉, 王穩(wěn)航, 荊瑋, 路福平 申請(qǐng)人:天津科技大學(xué)