一種利用精氨酸標(biāo)記細(xì)菌的silac培養(yǎng)基及其制備方法與應(yīng)用【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)一種利用精氨酸標(biāo)記細(xì)菌的SILAC培養(yǎng)基及其制備方法與應(yīng)用。該培養(yǎng)基包括無(wú)機(jī)鹽、碳源、氮源、脯氨酸和重穩(wěn)定同位素標(biāo)記精氨酸。該培養(yǎng)基還包括甘、丙、纈、亮、異亮、苯丙、脯、色、絲、酪、半胱、蛋、蘇、天冬、谷、賴、組等氨酸以及天冬酰胺、谷氨酰胺。本發(fā)明使用脯氨酸，阻止重穩(wěn)定同位素標(biāo)記精氨酸轉(zhuǎn)化為脯氨酸，從而提高蛋白質(zhì)的鑒定數(shù)量和定量準(zhǔn)確性；而添加了其他19種常見(jiàn)的氨基酸讓該培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分齊全，使該培養(yǎng)基適用于多種細(xì)菌，細(xì)菌在該培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度快，標(biāo)記速度快，1～3代可以完成標(biāo)記；并且使SILAC技術(shù)用于細(xì)菌蛋白質(zhì)組中操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好等?！緦＠f(shuō)明】-種利用精氨酸標(biāo)巧細(xì)菌的sILAC培養(yǎng)基及其制備方法與應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
[0001]本發(fā)明設(shè)及一種培養(yǎng)基，特別設(shè)及一種利用精氨酸標(biāo)記細(xì)菌的SILAC培養(yǎng)基及其制備方法與應(yīng)用?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]細(xì)菌是自然界中種類和數(shù)量眾多的群體。它與人類活動(dòng)息息相關(guān)，有許多細(xì)菌是致病的，甚至能致命，相反也有許多細(xì)菌是有益的，特別是許多工程菌服務(wù)于人類，同時(shí)在人體的消化道中也有許多益生菌有助于人類健康。自人類基因組計(jì)劃完成后，許多細(xì)菌如大腸桿菌等，其基因組也紛紛被測(cè)序解讀，運(yùn)也就為蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展提供了契機(jī)。蛋白質(zhì)組學(xué)能W-個(gè)細(xì)胞內(nèi)全部蛋白質(zhì)來(lái)解讀生命現(xiàn)象，運(yùn)為尋找藥物祀點(diǎn)，生物標(biāo)簽W及了解微生物提供了有效的手段。[0003]如上所述的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法中，早期用于研究細(xì)菌蛋白質(zhì)組學(xué)的是雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜鑒定。然而，雙向電泳有諸多局限，如蛋白質(zhì)鑒定數(shù)量少，實(shí)驗(yàn)程序繁瑣，疏漏了分子量較大、分子量較小W及極端等電點(diǎn)蛋白質(zhì)，還疏漏了許多疏水性蛋白質(zhì)。而在細(xì)菌中，疏水的膜蛋白質(zhì)占有很大的比重，因此雙向電泳技術(shù)損失了很多蛋白質(zhì)的信息。WiTRAQ為代表的化學(xué)標(biāo)記W及非標(biāo)記定量也可W用于細(xì)菌蛋白質(zhì)的定量。其中iTRAQ高效的標(biāo)記樣品中的膚段，而不受制約蛋白本身的理化性質(zhì)，然而iTRAQ試劑盒昂貴，而且在標(biāo)記前分別處理樣品，特別是對(duì)下游進(jìn)一步做膚段進(jìn)行富集的實(shí)驗(yàn)，容易引入隨機(jī)誤差。但是與代謝標(biāo)記和非標(biāo)記定量技術(shù)相比，化學(xué)標(biāo)記的膚段鑒定數(shù)量較少。非標(biāo)記定量對(duì)樣品的要求低，但是對(duì)質(zhì)譜要求較高，而且多維度預(yù)分離導(dǎo)致了更差的再現(xiàn)性，因此由于實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性差種種原因限制了非標(biāo)記定量技術(shù)的在蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。[0004]因此，相對(duì)而言，代謝標(biāo)記是比較理想的定量細(xì)菌蛋白質(zhì)組學(xué)的方法。在細(xì)菌的代謝標(biāo)記中，1?標(biāo)記雖然已經(jīng)很好的應(yīng)用于細(xì)菌中，但是運(yùn)也同時(shí)要求細(xì)菌必須能生長(zhǎng)在只W無(wú)機(jī)1?為氮源的能自身合成氨基酸等各種含氮產(chǎn)物的微生物中，然而許多的微生物為氨基酸或者維生素營(yíng)養(yǎng)缺陷型，也就導(dǎo)致了細(xì)菌無(wú)法生長(zhǎng)在運(yùn)些只W無(wú)機(jī)錠鹽為氮源的培養(yǎng)基中。同時(shí)，1?標(biāo)記對(duì)捜索引擎提出了強(qiáng)大的挑戰(zhàn)。另外一種代謝標(biāo)記技術(shù)-SILAC(Stableisotopelabelingbyaminoacidincellculture,細(xì)胞穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù))有蛋白質(zhì)鑒定數(shù)量多，定量準(zhǔn)確，容易操作，W及應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。然而SILAC在細(xì)菌蛋白組學(xué)中的應(yīng)用卻寥寥無(wú)幾，并且通常要求細(xì)菌為營(yíng)養(yǎng)缺陷株。Soufi，B.等人（Stableisotopelabelingbyaminoacidsincellculture(SILAC)appliedtoquantitativeproteomicsofBacillussubtilis.Journalofproteomeresearch9,3638-3646)提供了一種利用賴氨酸標(biāo)記枯草芽抱桿菌的方法，同時(shí)用該方法進(jìn)行了枯草芽抱桿菌的蛋白質(zhì)組研究，在該方法中，為了能夠保證重穩(wěn)定同位素標(biāo)記賴氨酸的標(biāo)記效率，上述方法的實(shí)驗(yàn)者將枯草芽抱桿菌中的賴氨酸合成酶基因敲除。徐平等人(一種利用SILAC標(biāo)記大腸桿菌蛋白質(zhì)組的方法及其專用培養(yǎng)基（CN201210276080.4)W及論文：如anti化tiveproteomicsreve曰Issignific曰ntch曰ngesincellsh曰pe曰nd曰nenergyshift曰fterIPTGinductionviaanoptimizedSILACapproachforEscherichiacoli.Journalofproteomeresearch12,5978-5988)提供了一種利用重穩(wěn)定同位素標(biāo)記賴氨酸標(biāo)記大腸桿菌的SILAC培養(yǎng)基。FrohlichF等人（NativeSILAC:me1:aboliclabelingofproteinsinprototrophmicroorganismsbasedonlysinesynthesisregulation.Molecularfecellularp;roteomics:MCP12,1995-2005)提供了一種利用重穩(wěn)定同位素標(biāo)記賴氨酸標(biāo)記酵母菌的方法。[0005]由W上已經(jīng)發(fā)表的專利和論文，可W看出目前SILAC技術(shù)在細(xì)菌等微生物中應(yīng)用現(xiàn)有技術(shù)中，均只能實(shí)現(xiàn)單個(gè)賴氨酸標(biāo)記，甚至需要敲除賴氨酸合成酶的基因。然而，在蛋白質(zhì)組研究的過(guò)程中，用于水解蛋白質(zhì)的一般是膜酶，它特異性地識(shí)別并且切斷膚段中精氨酸和賴氨酸C末端的膚鍵。因此使用單個(gè)賴氨酸標(biāo)記細(xì)菌的SILAC技術(shù)，對(duì)C末端W精氨酸結(jié)尾的多膚無(wú)法進(jìn)行定量，因此損失約一半的蛋白質(zhì)定量分析。并且，對(duì)于某些含賴氨酸低或者不含有賴氨酸的蛋白質(zhì)無(wú)法，最終容易導(dǎo)致定量結(jié)果不準(zhǔn)確。[0006]SILAC應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中時(shí)，均實(shí)現(xiàn)了賴氨酸和精氨酸的雙標(biāo)記。由于如下細(xì)菌自身的原因，導(dǎo)致精氨酸標(biāo)記一直無(wú)法在細(xì)菌中實(shí)現(xiàn)。一是由于許多細(xì)菌為氨基酸自養(yǎng)型生物，能夠合成自身所需要的氨基酸。若該細(xì)菌能夠合成精氨酸而不利用環(huán)境中提供的重穩(wěn)定同位素標(biāo)記的精氨酸，則導(dǎo)致重穩(wěn)定同位素標(biāo)記的精氨酸的標(biāo)記效率低，而無(wú)法實(shí)現(xiàn)雙氨基酸標(biāo)記。二是由于許多細(xì)菌，如枯草芽抱桿菌、地衣芽抱桿菌、啤酒酵母構(gòu)巢曲霉和粗糖鏈抱菌、金黃色葡萄球菌，都能夠利用精氨酸合成脯氨酸。如果重穩(wěn)定同位素標(biāo)記精氨酸能夠標(biāo)記細(xì)菌蛋白質(zhì)，那么當(dāng)細(xì)菌利用重穩(wěn)定同位素標(biāo)記精氨酸合成脯氨酸時(shí)，蛋白質(zhì)中的脯氨酸將同時(shí)或分別含有重穩(wěn)定同位素1?和i5N:若精氨酸為kArginine-i3C6i5N4時(shí)，則轉(zhuǎn)化為kProlineUCsi^i;若精氨酸為kArginine-UCs，則轉(zhuǎn)化為心?'〇1ineUCs。含有重穩(wěn)定同位素的脯氨酸將改變多膚的質(zhì)量，改變多膚的質(zhì)荷比，導(dǎo)致該多膚無(wú)法被鑒定到，最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)鑒定數(shù)量的減少和蛋白質(zhì)定量的誤差增大。甚至，由于氨基酸通過(guò)=簇酸循環(huán)能夠用于合成其代謝所需要的物質(zhì)，若重穩(wěn)定同位素標(biāo)記精氨酸或者賴氨酸通過(guò)=簇酸循環(huán)而合成其他物質(zhì)，將導(dǎo)致鑒定的蛋白質(zhì)數(shù)量更加少，定量更加不準(zhǔn)確。[0007]基于W上運(yùn)些原因，導(dǎo)致了SILAC用于細(xì)菌中時(shí)只能使用單個(gè)氨基酸，即賴氨酸作為標(biāo)記氨基酸。因此，要實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定同位素標(biāo)記精氨酸用于細(xì)菌的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，必須要解決細(xì)菌自身合成氨基酸W及重穩(wěn)定同位素標(biāo)記氨基酸轉(zhuǎn)化成其他氨基酸的問(wèn)題?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0008]本發(fā)明首要的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種利用精氨酸標(biāo)記細(xì)菌的SILAC培養(yǎng)基。通過(guò)向該培養(yǎng)基添加了脯氨酸，抑制了重鏈同位素標(biāo)記精氨酸轉(zhuǎn)化成脯氨酸，促使精氨酸也可W作為標(biāo)記氨基酸應(yīng)用于細(xì)菌的SILAC標(biāo)記中。[0009]-種利用精氨酸標(biāo)記細(xì)菌的SILAC培養(yǎng)基，包括無(wú)機(jī)鹽、碳源、氮源，還包括脯氨酸和重穩(wěn)定同位素標(biāo)記精氨酸。[0010]優(yōu)選地，所述的重穩(wěn)定同位素標(biāo)記精氨酸為心日巧1'111；[]1日-1化614抓或心日'旨1'；[]1；[]16-1化6柳4。[0011]優(yōu)選地，所述利用精氨酸標(biāo)記細(xì)菌的SILAC培養(yǎng)基還包括甘氨酸、丙氨酸、鄉(xiāng)氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、絲氨酸、酪氨酸、半脫氨酸、蛋氨酸、天冬酷胺、谷氨酷胺、蘇氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、組氨酸。所述的培養(yǎng)基為限制性培養(yǎng)基，營(yíng)養(yǎng)成分相對(duì)有限，當(dāng)細(xì)菌生長(zhǎng)在其中時(shí)，由于培養(yǎng)基中含有充足的重穩(wěn)定同位素標(biāo)記精氨酸，細(xì)菌容易將重穩(wěn)定同位素標(biāo)記精氨酸進(jìn)行脫氨基作用，進(jìn)而使重穩(wěn)定同位素標(biāo)記精氨酸的碳骨架進(jìn)入=簇酸循環(huán)，用于合成其他生命過(guò)程所需的物質(zhì)，如合成其他氨基酸。重穩(wěn)定同位素標(biāo)記精氨酸的碳骨架含有同位素1叱，當(dāng)該骨架用于合成其他氨基酸時(shí)候會(huì)改變氨基酸的分子量，導(dǎo)致在質(zhì)譜儀分析后的質(zhì)核比無(wú)法與數(shù)據(jù)庫(kù)匹配而造成蛋白質(zhì)鑒定量的減少或定量的錯(cuò)誤。加入其他氨基酸，能有效的抑制相對(duì)應(yīng)氨基酸的生物合成，提高蛋白質(zhì)的鑒定數(shù)量W及提供蛋白質(zhì)定量的準(zhǔn)確性。其次是許多細(xì)菌為氨基酸缺陷型，或?yàn)榱诵枰?，需要敲除?xì)菌的某些基因，導(dǎo)致在缺少某種氨基酸的培養(yǎng)基中細(xì)菌無(wú)法生長(zhǎng)，加入各種常見(jiàn)的氨基酸在培養(yǎng)基中能使培養(yǎng)基具有最廣泛的適用性。[0012]優(yōu)選地，在所述的利用精氨酸標(biāo)記細(xì)菌的SILAC培養(yǎng)基中，所述的甘氨酸的含量為100~40〇111旨/1;所述的丙氨酸的含量為100~40〇111旨/1;所述的鄉(xiāng)氨酸的含量為100~400mg/レ所述的亮氨酸的含量為100~400mg/l;所述的異亮氨酸的含量為100~400mg/l;所述的苯丙氨酸的含量為100~40〇111旨/1;所述的色氨酸的含量為100~40〇111旨/1;所述的絲氨酸的含量為100~40〇111旨/1;所述的酪氨酸的含量為100~400mg/l;所述的半脫氨酸的含量為100~40〇111旨/1;所述的蛋氨酸的含量為100~400mg/l;所述的天冬酷胺的含量為100~400mg/L所述的谷氨酷胺的含量為100~40〇111旨/1;所述的蘇氨酸的含量為100~400mg/l;所述的天冬氨酸的含量為100~40〇111旨/1;所述的谷氨酸的含量為100~40〇111旨/1;所述的組氨酸的含量為100~40〇111旨/1;所述的賴氨酸的含量為100~400mg/l;發(fā)明人經(jīng)過(guò)反復(fù)的實(shí)驗(yàn)和摸索，最終確定在上述各種氨基酸在該濃度范圍內(nèi)既能夠有效的抑制相應(yīng)氨基酸的生物合成，又不會(huì)造成細(xì)菌通過(guò)自身代謝途徑合成精氨酸，而導(dǎo)致重穩(wěn)定同位素標(biāo)記精氨酸的標(biāo)記效率不合格。同時(shí)，細(xì)菌還能在該培養(yǎng)基中快速的生長(zhǎng)。[0013]作為優(yōu)選地，所述的利用精氨酸標(biāo)記細(xì)菌的SILAC培養(yǎng)基中，還包括巧樣酸、硫胺素、尼克酸、泛酸、生物素、Tris堿。添加上述物質(zhì)能夠使細(xì)菌更好地生長(zhǎng)。自然界中或者為了某些需要會(huì)造成許多細(xì)菌為維生素的營(yíng)養(yǎng)缺陷型或某些特定物質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型，增加巧樣酸、硫胺素、尼克酸、泛酸、生物素能夠增加所述SILAC培養(yǎng)基的適用性。Tris堿溶液是良好的緩沖液，配合HC1使用可W配置所需的抑，使培養(yǎng)基更適合多種不同細(xì)菌的生長(zhǎng)。[0014]優(yōu)選地，所述的利用精氨酸標(biāo)記細(xì)菌的SILAC培養(yǎng)基中，所述無(wú)機(jī)鹽為氯化巧、氯化鐘、氯化鋼、硫酸儀、憐酸二氨鐘、硫酸儘、硫酸亞鐵;所述碳源為葡萄糖;所述氮源為無(wú)機(jī)氮源，更優(yōu)選為硫酸錠。發(fā)明人經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，在盡量兼顧多種細(xì)菌生長(zhǎng)的前提下，挑選了上述各種無(wú)機(jī)鹽，有利于細(xì)菌在本發(fā)明所提供的SILAC培養(yǎng)基中生長(zhǎng)狀態(tài)更好。[0015]優(yōu)選地，所述的利用精氨酸標(biāo)記細(xì)菌的SILAC培養(yǎng)基中，所述脯氨酸的濃度為200~400mg/L。發(fā)明人經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)脯氨酸低于200mg/L時(shí)，并不能完全的抑制重穩(wěn)定同位素標(biāo)記精氨酸轉(zhuǎn)化成脯氨酸，而過(guò)高的濃度的脯氨酸會(huì)造成浪費(fèi)。[0016]優(yōu)選地，所述的利用精氨酸標(biāo)記細(xì)菌的SILAC培養(yǎng)基中，所述重穩(wěn)定同位素標(biāo)記精氨酸的濃度為30~400mg/l;優(yōu)選為100~400mg/l;更優(yōu)選為200~400mg/L。當(dāng)重穩(wěn)定同位素標(biāo)記精氨酸的濃度低于30mg/L時(shí)，許多細(xì)菌會(huì)生長(zhǎng)緩慢，如金黃色葡萄球菌，甚至?xí)?dǎo)致標(biāo)記效率過(guò)低而無(wú)法用于定量蛋白質(zhì)。其次重穩(wěn)定同位素標(biāo)記精氨酸價(jià)格相當(dāng)昂貴，過(guò)高的濃度會(huì)造成極大的浪費(fèi)。[0017]優(yōu)選地，所述的利用精氨酸標(biāo)記細(xì)菌的SILAC培養(yǎng)基中，所述氯化巧的濃度為16.58mg/L，所述氯化鐘的濃度為3000mg/L，所述氯化鋼的濃度為9500mg/L，所述硫酸儀的濃度為633mg/L，所述憐酸二氨鐘的濃度為140mg/L，所述硫酸儘?此0的濃度lOmg/L，所述巧樣酸的濃度為6mg/L，所述硫胺素的濃度為2mg/L，所述尼克酸的濃度為2mg/L，所述泛酸的濃度為2mg/L，所述生物素的濃度為2mg/L，所述硫酸亞鐵?7此0的濃度為6mg/L，所述硫酸錠的濃度為4000mg/L，所述葡萄糖的濃度為5000mg/L，所述化is-base(化is堿)的濃度為12100mg/l;所述甘氨酸、丙氨酸、鄉(xiāng)氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、絲氨酸、酪氨酸、半脫氨酸、蛋氨酸、天冬酷胺、谷氨酷胺、蘇氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸氨酸、組氨酸、脯氨酸、重穩(wěn)定同位素標(biāo)記精氨酸的濃度均為200mg/L。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在兼顧細(xì)菌生長(zhǎng)速度，標(biāo)記效率，氨基酸的相互轉(zhuǎn)化各方面的問(wèn)題的前提下，確定了SILAC培養(yǎng)基中各個(gè)組分的最優(yōu)濃度，在上述條件下，細(xì)菌能夠快速的生長(zhǎng)；同時(shí)能夠兼顧多種細(xì)菌的生長(zhǎng)，能有效的防止氨基酸的相互轉(zhuǎn)化，并且獲得合格的，即大于等于95%的重穩(wěn)定同位素標(biāo)記精氨酸的標(biāo)記效率。[0018]優(yōu)選地，所述利用精氨酸標(biāo)記細(xì)菌的SILAC培養(yǎng)基中，所述的細(xì)菌為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌、銅綠假單胞桿菌和鮑曼不動(dòng)桿菌中的至少一種。上述細(xì)菌中包含了革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌，且上述多種細(xì)菌均為常見(jiàn)的模式生物，上述細(xì)菌能夠被標(biāo)記表明所述的SILAC培養(yǎng)基具有最廣泛的適用性。[0019]本發(fā)明所述的利用精氨酸標(biāo)記細(xì)菌的SILAC培養(yǎng)基，在標(biāo)記細(xì)菌蛋白質(zhì)組中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。用本發(fā)明所述的SILAC培養(yǎng)基進(jìn)行標(biāo)記細(xì)菌進(jìn)而獲得細(xì)菌的定量蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)，具有操作簡(jiǎn)單，所需時(shí)間短，定量準(zhǔn)確率高，鑒定蛋白質(zhì)數(shù)量多，重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。[0020]本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：[0021]在研究的過(guò)程，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，添加到培養(yǎng)基中的重穩(wěn)定同位素標(biāo)記的氨基酸的標(biāo)記效率會(huì)隨著添加的氨基酸濃度的升高而提高;發(fā)明人猜想細(xì)菌會(huì)優(yōu)先利用培養(yǎng)基中的氨基酸而抑制其自身相應(yīng)氨基酸的合成，從而使重穩(wěn)定同位素標(biāo)記精氨酸在膚段中的占有率足夠高，即保證足夠高的標(biāo)記效率。而且細(xì)菌在運(yùn)種添加了豐富氨基酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度快，同時(shí)標(biāo)記效率也高。[0022]本發(fā)明通過(guò)向培養(yǎng)基中添加脯氨酸，阻止了重穩(wěn)定同位素標(biāo)記精氨酸轉(zhuǎn)化為脯氨酸，促使重穩(wěn)定同位素標(biāo)記精氨酸應(yīng)用于標(biāo)記細(xì)菌蛋白質(zhì)組，因此提高了蛋白質(zhì)的鑒定數(shù)量和定量準(zhǔn)確性；同時(shí)在培養(yǎng)基中添加了其他19種常見(jiàn)的氨基酸讓該培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分齊全，使得本發(fā)明所提供的SILAC培養(yǎng)基適用于多種細(xì)菌，細(xì)菌在該培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度快，標(biāo)記速度快，1~3代可W完成標(biāo)記;并且使SILAC技術(shù)用于細(xì)菌蛋白質(zhì)組中操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好等?！靖綀D說(shuō)明】[0023]圖1為實(shí)施例1的蛋白質(zhì)定量相關(guān)性分析圖?！揪唧w實(shí)施方式】[0024]下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。[00巧]實(shí)施例一[0026]1、制備不同配比的SILAC培養(yǎng)基[0027](1)培養(yǎng)基A，具體成分和含量如表1所示:溶劑為水。[002引棄1[0029][0030][0031]所述重穩(wěn)定同位素標(biāo)記精氨酸為L(zhǎng)-a巧rinine-UC6i4N4。[0032](2)培養(yǎng)基B:與培養(yǎng)基A的區(qū)別僅在于培養(yǎng)基B還包括表2中的各組分;且所述重穩(wěn)定同位素標(biāo)記精氨酸為心曰巧!'inine-UC6i5N4，濃度為30mg/l;[0033]表2[0034][0035](3)培養(yǎng)基C:與培養(yǎng)基B的區(qū)別僅在于重穩(wěn)定同位素標(biāo)記精氨酸的濃度為lOOmg/L。[0036](4)培養(yǎng)基D:與培養(yǎng)基B的區(qū)別僅在于重穩(wěn)定同位素標(biāo)記精氨酸的濃度為200mg/L。[0037](5)培養(yǎng)基E:與培養(yǎng)基B的區(qū)別僅在于重穩(wěn)定同位素標(biāo)記精氨酸的濃度為300mg/L。[0038](6)培養(yǎng)基F:與培養(yǎng)基B的區(qū)別僅在于重穩(wěn)定同位素標(biāo)記精氨酸的濃度為400mg/L。[0039](7)培養(yǎng)基G:培養(yǎng)基D的區(qū)別僅在于所述甘氨酸、丙氨酸、鄉(xiāng)氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、絲氨酸、酪氨酸、半脫氨酸、蛋氨酸、天冬酷胺、谷氨酷胺、蘇氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、組氨酸的濃度均為1OOmg/L。[0040](8)培養(yǎng)基H:培養(yǎng)基D的區(qū)別僅在于所述甘氨酸、丙氨酸、鄉(xiāng)氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、絲氨酸、酪氨酸、半脫氨酸、蛋氨酸、天冬酷胺、谷氨酷胺、蘇氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、組氨酸的濃度均為400mg/L。[0041](9)培養(yǎng)基I:與培養(yǎng)基D的區(qū)別僅在于不含有脯氨酸。[0042](10)培養(yǎng)基J:與培養(yǎng)基D的區(qū)別僅在于脯氨酸濃度為lOOmg/L。[0043](11)培養(yǎng)基K:與培養(yǎng)基D的區(qū)別僅在于脯氨酸濃度為400mg/L。[0044]2、培養(yǎng)基A~哺勺標(biāo)記細(xì)菌的效果檢測(cè)。[0045]將每種培養(yǎng)基分別用于培養(yǎng)大腸桿菌(BW25113,中國(guó)微生物菌種保藏中屯、）、金黃色葡萄球菌(ATCC29213)、枯草芽抱桿菌(美國(guó)168)、銅綠假單胞桿菌(ATCC9027)、鮑曼不動(dòng)桿菌(ATCC19606)，于37°C、220巧m搖床培養(yǎng)獲細(xì)菌。按文獻(xiàn)"Soufi，B.，Kumar，C.，Gnad,F.,Mann,M.,Mijakovic,I.,andMacek,B.(2010)Stableisotopelabelingbyaminoacidsincellculture(SILAC)appliedtoquantitativeproteomicsofBacillussubtilis.Journalofproteomeresearch9,3638-3646"操作，提取并且用膜酶水解細(xì)菌蛋白質(zhì)獲得多膚;將多膚用液相串聯(lián)質(zhì)譜儀分析后，用Max如ant進(jìn)行捜索，在捜索結(jié)果中的"peptide.txt"文件中，根據(jù)捜索結(jié)果中含有重穩(wěn)定同位素標(biāo)記精氨酸的多膚與含有非重穩(wěn)定同位素標(biāo)記精氨酸的多膚的比值，即重鏈與輕鏈的比值，計(jì)算得出含有重穩(wěn)定同位素標(biāo)記精氨酸的多膚的占有率，即標(biāo)記效率。結(jié)果如表3所示。本實(shí)施例所用菌株從美國(guó)菌種保藏中屯、或中國(guó)微生物菌種保藏中屯、購(gòu)買(mǎi)獲得。[0046]表3、各種細(xì)菌的重穩(wěn)定同位素標(biāo)記精氨酸的標(biāo)記效率（％)[0047][0([0049]表3中表示沒(méi)有此數(shù)據(jù)。[(K)加]3、培養(yǎng)基D、I、J、K的效果檢測(cè)。[0化1]將金黃色葡萄球菌(ATCC29213)分別培養(yǎng)于培養(yǎng)基D、I、J、K，獲得細(xì)菌，提取細(xì)菌蛋白質(zhì)，再用膜酶將蛋白質(zhì)進(jìn)行水解；所得多膚用液相串聯(lián)質(zhì)譜儀分析；將所得數(shù)據(jù)用MaxQuant進(jìn)行捜索，選擇參數(shù)時(shí)，在可變修飾項(xiàng)目中選擇"Pro6"。在捜索結(jié)果中，計(jì)算"msms.txt"文件中Pro6占全部脯氨酸的比例;結(jié)果如下表4所示;所述Pro6為細(xì)菌W重穩(wěn)定同位素標(biāo)記精氨酸化-argrinine-UC6i5N4)為原料合成的帶有重穩(wěn)定同位素的脯氨酸化-Proline口C日1日化）。[0052]表4、細(xì)菌蛋白質(zhì)中Pro6占所有脯氨酸的比例（％)[0化3][0054]由于Pro6的存在會(huì)導(dǎo)致在捜庫(kù)時(shí)B、Y離子無(wú)法與數(shù)據(jù)庫(kù)匹配，或者形成錯(cuò)配，導(dǎo)致蛋白質(zhì)鑒定數(shù)量的減少和造成定量不準(zhǔn)確。如上表所示，本發(fā)明在在培養(yǎng)基中添加了脯氨酸后，能有效的抑制金黃色葡萄球菌利用精氨酸合成脯氨酸。當(dāng)培養(yǎng)基中的脯氨酸濃度達(dá)到200111旨/1時(shí)，即培養(yǎng)基0，？'〇6的含量會(huì)降至2.31%，約等于背景水平。如此，有利于提高準(zhǔn)確鑒定的蛋白質(zhì)數(shù)量和提高蛋白質(zhì)定量信息的準(zhǔn)確性，同時(shí)也促使了SILAC用于細(xì)菌中可W實(shí)現(xiàn)用精氨酸作為標(biāo)記氨基酸，為雙標(biāo)記SILAC技術(shù)應(yīng)用于細(xì)菌提供了保證。[0化5]4、定量蛋白質(zhì)組可重復(fù)性檢測(cè)。[0化6]取所配制的SILAC培養(yǎng)基D于37°C、220rpm搖床培養(yǎng)金黃色葡萄球菌ATCC29213,并且加入環(huán)丙沙星(CPFX)至濃度為0.化g/L。同時(shí)，在相應(yīng)的輕鏈培養(yǎng)基（即用相應(yīng)的培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基中的同位素氨基酸換成非同位素標(biāo)記氨基酸)培養(yǎng)金黃色葡萄球菌ATCC29213作為對(duì)照。將被穩(wěn)定同位素標(biāo)記的和非標(biāo)記的細(xì)菌等量混合進(jìn)行定量蛋白質(zhì)組分析，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行生物學(xué)重復(fù)兩次，對(duì)同一蛋白質(zhì)的兩次變化值進(jìn)行相關(guān)性分析，求得皮爾遜相關(guān)系數(shù)r=0.9578,具體方法參見(jiàn)（NativeSILAC:metaboliclabelingofproteinsinprototrophmicroorganismsbasedonlysinesynthesisregulation.Molecular&cellularproteomics:MCP12,1995-2005)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)結(jié)果一致性好，結(jié)果如圖1所示。該結(jié)果表明，SILAC技術(shù)用于定量金黃色葡萄球菌差異蛋白質(zhì)組時(shí)，具有優(yōu)良的穩(wěn)定性和高的重復(fù)性。[0057]上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)?！局鳈?quán)項(xiàng)】1.一種利用精氨酸標(biāo)記細(xì)菌的SILAC培養(yǎng)基，包括無(wú)機(jī)鹽、碳源、氮源，其特征在于:還包括脯氨酸和重穩(wěn)定同位素標(biāo)記精氨酸。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用精氨酸標(biāo)記細(xì)菌的SILAC培養(yǎng)基，其特征在于:還包括甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、絲氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、蘇氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、組氨酸。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用精氨酸標(biāo)記細(xì)菌的SILAC培養(yǎng)基，其特征在于：所述的甘氨酸的含量為100~400mg/L;所述的丙氨酸的含量為100~400mg/L;所述的纈氨酸的含量為100~400mg/L;所述的亮氨酸的含量為100~400mg/L;所述的異亮氨酸的含量為100~400mg/L;所述的苯丙氨酸的含量為100~400mg/L;所述的色氨酸的含量為100~400mg/L;所述的絲氨酸的含量為100~400mg/L;所述的酪氨酸的含量為100~400mg/L;所述的半胱氨酸的含量為100~400mg/L;所述的蛋氨酸的含量為100~400mg/L;所述的天冬酰胺的含量為100~400mg/L;所述的谷氨酰胺的含量為100~400mg/L;所述的蘇氨酸的含量為100~400mg/L;所述的天冬氨酸的含量為100~400mg/L;所述的谷氨酸的含量為100~400mg/L;所述的組氨酸的含量為100~400mg/L;所述的賴氨酸的含量為100~400mg/L。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用精氨酸標(biāo)記細(xì)菌的SILAC培養(yǎng)基，其特征在于:還包括檸檬酸、硫胺素、尼克酸、泛酸、生物素、Tris堿。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用精氨酸標(biāo)記細(xì)菌的SILAC培養(yǎng)基，其特征在于:所述無(wú)機(jī)鹽為氯化鈣、氯化鉀、氯化鈉、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硫酸錳、硫酸亞鐵;所述碳源為葡萄糖；所述氮源為硫酸銨。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用精氨酸標(biāo)記細(xì)菌的SILAC培養(yǎng)基，其特征在于:所述脯氨酸的濃度為200~400mg/L。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用精氨酸標(biāo)記細(xì)菌的SILAC培養(yǎng)基，其特征在于:所述重穩(wěn)定同位素標(biāo)記精氨酸的濃度為30~400mg/L。8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的利用精氨酸標(biāo)記細(xì)菌的SILAC培養(yǎng)基，其特征在于:所述氯化鈣的濃度為16.58mg/L，所述氯化鉀的濃度為3000mg/L，所述氯化鈉的濃度為9500mg/L，所述硫酸鎂的濃度為633mg/L，所述磷酸二氫鉀的濃度為140mg/L，所述硫酸錳·H20的濃度10mg/L，所述梓檬酸的濃度為6mg/L，所述硫胺素的濃度為2mg/L，所述尼克酸的濃度為2mg/L，所述泛酸的濃度為2mg/L，所述生物素的濃度為2mg/L，所述硫酸亞鐵·7H20的濃度為6mg/L，所述硫酸銨的濃度為4000mg/L，所述葡萄糖的濃度為5000mg/L，所述Tris-base的濃度為12100mg/L;所述甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、絲氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、蘇氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸氨酸、組氨酸、脯氨酸、重穩(wěn)定同位素標(biāo)記精氨酸的濃度均為200mg/L。9.根據(jù)權(quán)利要求1~8任一項(xiàng)所述利用精氨酸標(biāo)記細(xì)菌的SILAC培養(yǎng)基，其特征在于:所述的細(xì)菌為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞桿菌和鮑曼不動(dòng)桿菌中的至少一種。10.權(quán)利要求1~8任意一項(xiàng)所述的利用精氨酸標(biāo)記細(xì)菌的SILAC培養(yǎng)基在標(biāo)記細(xì)菌蛋白質(zhì)組中的應(yīng)用?！疚臋n編號(hào)】C12R1/125GK106047752SQ201610391015【公開(kāi)日】2016年10月26日【申請(qǐng)日】2016年6月2日【發(fā)明人】孫雪松,韓俊隆,易淑紅【申請(qǐng)人】暨南大學(xué)