miR-21及其抑制劑在制備促進(jìn)牙周組織再生藥物中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了miR?21在制備促進(jìn)牙周組織再生的藥物中的應(yīng)用，以及miR?21抑制劑在制備促進(jìn)牙周組織再生的藥物中的應(yīng)用，所述miR?21抑制劑是指miR?21的反義核酸，或具有miR?21反義核酸序列的重組質(zhì)?；虿《据d體，或抑制miR?21表達(dá)的化學(xué)合成物。本發(fā)明還公開了一種藥物組合物，所述藥物組合物含有有效量的所述miR?21抑制劑，以及藥學(xué)上可接受的載體。miR?21及其抑制劑在制備相關(guān)藥物中具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說明】
m i R-21及其抑制劑在制備促進(jìn)牙周組織再生藥物中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及miR-21及其抑制劑在制備促進(jìn)牙周組織再生藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 牙齒缺失修復(fù)及牙周組織再生是口腔醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)和目標(biāo)之一?，F(xiàn)階段，臨床 大多數(shù)利用義齒(如固定義齒、活動(dòng)義齒及種植義齒等)修復(fù)牙齒缺失，恢復(fù)患者口腔的功 能和容貌。但運(yùn)些修復(fù)手段僅達(dá)到歴復(fù)體修復(fù)，卻無法達(dá)到真正意義上的生物修復(fù)。近年 來，關(guān)于牙齒干細(xì)胞及組織工程技術(shù)的研究進(jìn)展給牙齒和牙周組織生物學(xué)再生帶來了新的 福音。特別是2004年Seo等利用單細(xì)胞克隆技術(shù)，從牙周膜中成功分離、鑒定出了一種新的 成體干細(xì)胞即牙周膜干細(xì)胞，為口腔生物修復(fù)提供了新希望。運(yùn)類干細(xì)胞是一種口腔臨床 中易于獲得的間充質(zhì)來源的成體干細(xì)胞;也是一類具有多向分化潛能和自我更新能力的間 充質(zhì)干細(xì)胞。它可表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志物，具備自我更新及多向分化能力;可表現(xiàn) 出很高的增殖和克隆形成能力。在體外經(jīng)過適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)能夠形成骨、軟骨、神經(jīng)、脂肪、血管 等多種組織;可潛在分化為成骨細(xì)胞或成牙骨質(zhì)細(xì)胞，并能在體內(nèi)移植后形成牙骨質(zhì)-牙周 膜-牙槽骨樣結(jié)構(gòu)物，為牙齒和牙周組織生物再生提供了可能。
[0003] microRNA(miRNA，miR)是作為一類大小約18-25個(gè)核巧酸長度(bp)的非編碼單鏈 RNA分子，廣泛存在于真核生物體內(nèi)，具有細(xì)胞特異性和組織特異性，是在轉(zhuǎn)錄后水平來調(diào) 控基因表達(dá)的重要因子。miRNAs基因 W單拷貝、多拷貝或基因簇等多種形式存在于基因組 中，而且絕大部分落于基因間隔區(qū)（inter genic region, IGR)，它們的轉(zhuǎn)錄獨(dú)立于其他的 基因，具有本身的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，成熟的miRNA結(jié)合到與其互補(bǔ)的mRNA的位點(diǎn)通過堿基配對(duì) 調(diào)控基因表達(dá)。miRNA是在細(xì)胞核內(nèi)形成前體，在胞漿內(nèi)經(jīng)Dicer酶作用，產(chǎn)生成熟的miRNA， 成熟的miRNA與mRNA的非編碼區(qū)結(jié)合抑制mRNA翻譯成蛋白從而發(fā)揮調(diào)控作用，參與生命過 程的重要進(jìn)程，包括細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖與調(diào)亡、生物發(fā)育、疾病的發(fā)生、發(fā)展等，并在復(fù)雜 組織的再生活動(dòng)中有重要作用。目前，已有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)miRNA參與調(diào)控成骨細(xì)胞分化。 Mizuno等發(fā)現(xiàn)在BMP-4誘導(dǎo)小鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞ST2分化為成骨細(xì)胞的過程中，過表達(dá)miR- 12化可降低細(xì)胞增殖從而抑制ST2細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。Luzi等研究表明miR-2fe在誘導(dǎo)的 人脂肪組織衍生的干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的后期發(fā)揮抑制效應(yīng)。Huang等研究結(jié)果提示 miR-204/211通過抑制Runx2蛋白翻譯來減少其表達(dá)，從而阻止間充質(zhì)祖細(xì)胞和BMSC向成骨 分化。miR-141和miR-200a則是通過對(duì)骨生成轉(zhuǎn)錄因子D1巧的翻譯抑制參與成骨細(xì)胞分化 過程。研究還發(fā)現(xiàn)了一些正性調(diào)控成骨分化的miRNA，miR-29b和miR-210已被證實(shí)在成骨細(xì) 胞分化中具有正調(diào)控作用。隨著對(duì)miRNAs研究的不斷深入，其在牙齒間充質(zhì)干細(xì)胞成骨向 分化中的作用也逐漸被掲示。化ng等研究發(fā)現(xiàn)miR-146a通過下調(diào)NF-KB信號(hào)通路促進(jìn)牙周 膜干細(xì)胞的成骨向分化。Zhou等則發(fā)現(xiàn)伊班麟酸鹽誘導(dǎo)牙周膜干細(xì)胞成骨向分化的過程 中，11111?-18曰，11111?-133曰，11111?-141及11111?-19曰均發(fā)生了改變，參與了調(diào)控過程。
[0004] miR-21是一類具有多種調(diào)控功能的miRNA，通過pubmed數(shù)據(jù)庫查閱關(guān)于miR21的相 關(guān)研究(截至到2016年3月），發(fā)現(xiàn)miR21的研究主要集中在腫瘤、屯、血管、免疫、遺傳類疾病 等領(lǐng)域。如在化La細(xì)胞中抑制miR-21時(shí)細(xì)胞增長明顯;在乳腺癌中miR-21呈高表達(dá)，且反義 miR-21寡核巧酸抑制細(xì)胞生長和腫瘤的增長;在屯、臟肥大鼠中miR-21在屯、肌細(xì)胞顯著增 高，敲除miR-21可抑制屯、肌細(xì)胞的肥大。
[0005] 發(fā)明人在前期研究中發(fā)現(xiàn)，牙齒矯正的過程中，miR-21能夠正向調(diào)控由于機(jī)械拉 伸誘導(dǎo)的牙周膜干細(xì)胞成骨向分化。然而，上述的研究主要集中于miRNA對(duì)牙周膜干細(xì)胞成 骨向分化的影響，但分化增殖后能否附著于牙根，即能否與牙本質(zhì)或已有的牙骨質(zhì)實(shí)現(xiàn)連 接，從而實(shí)現(xiàn)牙周組織的再生，目前還未有系統(tǒng)的深入研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的在于提供miR-21及其抑制劑在制備促進(jìn)牙周組 織再生藥物中的應(yīng)用。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：
[000引本發(fā)明的第一方面，提供miR-21在制備促進(jìn)牙周組織再生藥物中的應(yīng)用。
[0009] 上述應(yīng)用中，所述牙周組織再生具體為牙槽骨再生。
[0010] 本發(fā)明的第二方面，提供miR-21抑制劑在制備促進(jìn)牙周組織再生藥物中的應(yīng)用。
[0011] 上述應(yīng)用中，miR-21抑制劑包括了括抗劑、下調(diào)劑、阻滯劑、阻斷劑等。任何可W降 低miR-21的活性、抑制miR-21的表達(dá)或抑制miR-21的轉(zhuǎn)錄和加工的物質(zhì)均可用于本發(fā)明。
[0012] 作為優(yōu)選的，所述miR-21抑制劑是指miR-21的反義核酸，或具有miR-21反義核酸 序列的重組質(zhì)?；虿《据d體，或抑制miR-21表達(dá)的化學(xué)合成物。
[0013] 所述miR-21的反義核酸如沈Q ID NO. 1所示。
[0014] anti-miR21:5，-CCGGTTCAACATCAGTCTGATAAGCTATTTTTG-3,（沈Q ID N0.1)
[0015] 上述應(yīng)用中，所述牙周組織再生具體為牙槽骨再生。
[0016] 本發(fā)明的第Ξ方面，提供一種藥物組合物，所述藥物組合物含有有效量的所述 miR-21抑制劑，W及藥學(xué)上可接受的載體。
[0017] 所述"有效量"是指可對(duì)人和/或動(dòng)物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動(dòng)物所接 受的量。
[0018] 所述"藥學(xué)上可接受的載體"為常規(guī)的給藥載體，包括各種賦形劑或稀釋劑等。
[0019] miR-21作為一種重要的調(diào)控分子，本發(fā)明人對(duì)此進(jìn)行了長期的研究，前期研究發(fā) 現(xiàn)miR-21能夠WACVR2B作為祀基因，調(diào)控由于機(jī)械拉伸誘導(dǎo)的牙周膜干細(xì)胞成骨向分化， 其中，miR-21的表達(dá)量上調(diào)能夠促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞的成骨向分化。然而，由牙周膜干細(xì)胞成 骨向分化后能否實(shí)現(xiàn)牙周組織再生，目前仍不清楚。而且作為miR-21調(diào)控的祀基因有多種， 不同的祀基因相應(yīng)的調(diào)控不同的信號(hào)通路，調(diào)控過程十分復(fù)雜。在沒有相應(yīng)祀基因和信號(hào) 通路研究的基礎(chǔ)上，是很難對(duì)miR-21的應(yīng)用方向進(jìn)行推測(cè)的。本發(fā)明人通過miR-21調(diào)控牙 周膜干細(xì)胞體內(nèi)組織再生的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-21能夠抑制體內(nèi)牙周組織再生;相反， 下調(diào)miR-21能夠促進(jìn)體內(nèi)牙周組織的再生;并通過生物信息學(xué)祀點(diǎn)預(yù)測(cè)，確定SMAD5是miR- 21 調(diào)控牙周組織再生的祀基因。
[0020] 本發(fā)明的有益效果：
[0021] 本發(fā)明提供了一種miR-21及其抑制劑的用途，用于在體內(nèi)促進(jìn)牙周組織再生，可 W通過改變miR-21的基因表達(dá)來達(dá)到預(yù)防和/或治療牙周疾病的目的。miR-21及其抑制劑 在制備相關(guān)藥物中具有廣闊的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0022] 圖1:上調(diào)或下調(diào)miR21后體內(nèi)組織再生能力的變化；
[0023] 圖2:上調(diào)或下調(diào)miR21后體內(nèi)組織再生能力及SMAD5的表達(dá)變化。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，應(yīng)該說明的是，下述說明僅是為了解釋本 發(fā)明，并不對(duì)其內(nèi)容進(jìn)行限定。
[0025] 實(shí)施例1 :miR-21調(diào)控牙周膜干細(xì)胞體內(nèi)組織再生的機(jī)制研究
[0026] 實(shí)驗(yàn)方法如下：
[0027] 1.質(zhì)粒構(gòu)建
[0028] 根據(jù) miR-21 序列化 sa-miR-21，UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA)設(shè)計(jì)引物，引物由上海 吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)公司合成并純化。退火后連接至線性化的pGenesil-1質(zhì)粒(購自武漢市 晶賽生物工程技術(shù)有限公司），構(gòu)建miR-21的表達(dá)載體Lenti-miR21(過表達(dá))及anti-miR21 (沉默)慢病毒，分別用來增強(qiáng)、抑制miR-21的表達(dá)。
[0029] miR-21
[0030] Silencing：
[0031] anti-miR21:5，-CCGGTTCAACATCAGTCTGATAAGCTATTTTTG-3,（沈Q ID NO.l)
[0032] Overexpression：
[0033] Lenti-miR21:5，-CGGCCGCGACTCTAGTTATCAAATCCTGCCTGACTG-3,（沈Q ID N0.2)
[0034] Vector：pGC-LV-GFP〇
[00巧]2.將慢病毒Lenti-miR21、anti-miR21及相應(yīng)空載體分別轉(zhuǎn)染牙周膜干細(xì)胞
[0036] 采用酶消化法培養(yǎng)裸鼠的牙周膜干細(xì)胞，將生長旺盛的第二或第Ξ代牙周膜干細(xì) 胞接種在60mm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)成分為α-ΜΕΜ培養(yǎng)基(含15 %胎牛血清，2mmol/L谷氨酷胺，100U/ ml青霉素，100μg/ml鏈霉素）。分別將慢病毒Lenti-miR21、anti-miR21及相應(yīng)空載體轉(zhuǎn)染牙 周膜干細(xì)胞。
[0037] 3.牙周膜干細(xì)胞+HA/TCP復(fù)合體體內(nèi)回植
[0038] 裸鼠隨機(jī)分為5組：（l)Lenti-miR空載體轉(zhuǎn)染牙周膜干細(xì)胞+HA/TCP組；（2)Lenti- miR21(過表達(dá))轉(zhuǎn)染牙周膜干細(xì)胞+HA/TCP組；（3)anti-miR空載體轉(zhuǎn)染牙周膜干細(xì)胞+HA/ TCP組；（4)anti-miR21(沉默)轉(zhuǎn)染牙周膜干細(xì)胞+HA/TCP組；（5)正常不加誘導(dǎo)的培養(yǎng)牙周 膜干細(xì)胞+HA/TCP組?；刂?w后，分別處死裸鼠。組織學(xué)觀察：處死動(dòng)物獲取標(biāo)本，固定，脫 巧，進(jìn)行肥染色，觀察組織再生情況。結(jié)果如圖1所示。
[0039] 由圖1可W看出，H&E染色顯示體內(nèi)回植8w后，上調(diào)miR21抑制體內(nèi)牙周組織再生， 下調(diào)miR21促進(jìn)體內(nèi)牙周組織再生能力的變化。
[0040] 實(shí)施例2:生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)miR-21調(diào)控牙周組織再生的祀基因
[0041 ] 用生物信息學(xué)的方法，通過miRNA祀基因預(yù)測(cè)軟件(MiRanda、TargetScan、PicTa;r) 在線服務(wù)站點(diǎn)，預(yù)測(cè)出miR-21參與調(diào)控的祀基因。所參考的數(shù)據(jù)庫網(wǎng)址如下：
[0042] MiRanda http://www.microrna.org；
[0043] Tar邑etScan http://www.t曰rgetsc曰η.org；
[0044] PicTar http://pictar.bio.nyu.edu；
[0045] 根據(jù)GO功能分析，預(yù)測(cè)出13個(gè)與成骨分化功能相關(guān)的miR-21的祀基因（如表1所 示）。經(jīng)PCR驗(yàn)證后，篩選出4個(gè)表達(dá)差異最明顯的祀基因：IL6R、SMAD5、CDK6、S0X2。
[0046] 表1:
[0047]
[004引 W往研究表明，SMAD5是轉(zhuǎn)化生長因子-0(transfo;rming growth facto;r-0，TGF- β)家族細(xì)胞質(zhì)內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。SMD5屬于受體激活型SMAD，它在BMPs誘導(dǎo)成骨的信 號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著不可忽視的作用。SMAD5可W將TGF-β信號(hào)直接迅速的從細(xì)胞膜傳入細(xì)胞核 內(nèi)，從而使BMP的誘導(dǎo)成骨信號(hào)迅速的從受體向細(xì)胞核祀基因傳遞，調(diào)控細(xì)胞的成骨分化。
[0049] 為進(jìn)一步證明SMAD5是miR-21調(diào)控牙周組織再生的祀基因，我們進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)：
[0050] 1.質(zhì)粒構(gòu)建(方法同實(shí)施例1);
[0化1] 2.將慢病毒Lenti-miR21、anti-miR21及相應(yīng)空載體分別轉(zhuǎn)染牙周膜干細(xì)胞(方法 同實(shí)施例1);
[0052] 3.牙周膜干細(xì)胞+HA/TCP復(fù)合體體內(nèi)回植
[0053] 裸鼠隨機(jī)分為5組(分組同前），回植8w后，分別處死裸鼠。組織學(xué)觀察:處死動(dòng)物獲 取標(biāo)本，固定，脫巧，進(jìn)行免疫組化染色，觀察組織再生情況及SMAD5著色(棟褐色)情況。結(jié) 果如圖2所示。
[0化4]由圖2可W看出，免疫組化染色顯示體內(nèi)回植8w后，上調(diào)miR21后，SMAD5表達(dá)降低， 牙周組織再生能力減弱；下調(diào)miR21后，SMAD5表達(dá)升高，牙周組織再生能力增強(qiáng)。
[0化5] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SMAD5是miR-21調(diào)控牙周組織再生的祀基因；經(jīng)檢測(cè)驗(yàn)證后，確認(rèn) SMAD5是miR-21調(diào)控牙周組織再生的祀基因。
[0056]上述雖然結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行了描述，但并非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范 圍的限制，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白，在本發(fā)明的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員不 需要付出創(chuàng)造性勞動(dòng)即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護(hù)范圍W內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. miR-21在制備促進(jìn)牙周組織再生藥物中的應(yīng)用。2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述牙周組織再生是牙槽骨再生。 3. miR-21抑制劑在制備促進(jìn)牙周組織再生藥物中的應(yīng)用。4. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述miR-21抑制劑是指miR-21的反義核酸， 或具有miR-21反義核酸序列的重組質(zhì)?；虿《据d體，或抑制miR-21表達(dá)的化學(xué)合成物。5. 如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述miR-21的反義核酸如SEQ ID NO. 1所示。6. 如權(quán)利要求3、4或5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述牙周組織再生是牙槽骨再生。7. -種藥物組合物，所述藥物組合物含有有效量的權(quán)利要求4所述miR-21抑制劑，以及 藥學(xué)上可接受的載體。8. 如權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥學(xué)上可接受的載體為常規(guī)的給 藥載體，包括賦形劑或稀釋劑。9. 包含權(quán)利要求7或8所述的藥物組合物的臨床制劑。
【文檔編號(hào)】A61K45/00GK105878264SQ201610410689
【公開日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2016年6月13日
【發(fā)明人】魏福蘭, 馮程, 楊雙艷, 張?jiān)掠?
【申請(qǐng)人】山東大學(xué)