專利名稱：一種重組豬釉原蛋白及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白，尤其涉及一種重組豬釉原蛋白及其制備方法。
背景技術(shù)：
釉基質(zhì)蛋白(enamel matrix proteins, EMPs)是牙齒發(fā)育到鐘狀期，由內(nèi)釉上皮細(xì)胞分化而來的成釉細(xì)胞合成和分泌一系列細(xì)胞外基質(zhì)蛋白。自1975年首次提出來自赫特威氏上皮根鞘的釉質(zhì)相關(guān)蛋白可以誘導(dǎo)牙根部無細(xì)胞性牙骨質(zhì)形成以后，體外實驗和臨床治療廣泛證實EMPs能有效促進(jìn)牙周韌帶、牙骨質(zhì)、牙槽骨再生，形成類似正常的牙周組
織的排列，達(dá)到真正的牙周再生。發(fā)育中EMPs最主要的成分-釉原蛋白(amelogenin,
Am)，也是EMPs中促進(jìn)牙周再生的主要活性成分。但Am的組成不是單一的，至少有9種成分，分子量范圍5 27kD。目前廣泛應(yīng)用于牙周再生的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用的EMPs基本為提取的豬釉基質(zhì)蛋白，其主要的成分是分子量為20kD、13kD、llkD的Am。提取的豬釉基質(zhì)蛋白主要是幾種釉原蛋白的混合成分，其提取效率及組分穩(wěn)定性影響到蛋白的功能。其次提取的豬EMPs是異源性蛋白，可能存在免疫原性的問題。目前唯一的軸基質(zhì)蛋白市售商品 Emdogaiη 的有效成分也是從豬牙胚組織中提取的軸原蛋白的衍生物。其完全依賴進(jìn)口，售價昂貴，用于基礎(chǔ)研究和臨床治療所需成本較高。目前國內(nèi)尚未見有人工合成的單一組分的豬釉原蛋白(pAm)。Am是成釉細(xì)胞中Am基因的表達(dá)產(chǎn)物。豬有兩個Am基因，分別定位于X染色體和Y染色體上。逆轉(zhuǎn)錄PCR證實主要的轉(zhuǎn)錄本來自于X染色體，Y染色體上的釉原蛋白基因也可轉(zhuǎn)錄，約占總轉(zhuǎn)錄本的10%。豬Am基因至少包括7個外顯子，存在至少有9種選擇剪切的方式，編碼的九種不同Am在組織中的含量并不相等。剪切去掉外顯子4是最常見的一種剪切方式，由它編碼的Am在發(fā)育的釉質(zhì)中最多見。研究證實成熟的豬Am的主要成分是X染色體上Am基因的翻譯產(chǎn)物——由175個氨基酸殘基組成的Mrl. 96X IO4蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種重組豬釉原蛋白及其制備方法，以及含有全長豬釉原蛋白基因的重組原核表達(dá)載體和由該重組原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株。本發(fā)明提供了一種重組豬釉原蛋白的制備方法，包括以下步驟步驟I，合成全長豬軸原蛋白基因；步驟2，構(gòu)建含有上述基因的重組原核表達(dá)質(zhì)粒PGEX4Tl_pAm ；步驟3，將步驟2獲得的重組原核表達(dá)質(zhì)粒PGEX4Tl-pAm轉(zhuǎn)化菌株E. col1. BL21 ；步驟4，誘導(dǎo)步驟3獲得的重組菌株表達(dá)融合蛋白GST-pAm ；步驟5，切除步驟4獲得的融合蛋白GST-pAm的GST標(biāo)簽蛋白，獲得重組豬釉原蛋 白 pAm。其中，步驟I中所述全長豬軸原蛋白基因的喊基序列如SEQ ID NO.1所不。優(yōu)選地，在步驟2中，構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒PGEX4Tl_pAm采用內(nèi)切酶ECoR I和Sal I，酶切引物分別為5’ -CCGGAATTCATGCCTCTACCACCTCATCCTG-3’ 和5， -ACGCGTCGACTTAATCCACTTCCTCCCG CTTG-3，。優(yōu)選地，步驟4中，通過異丙基硫代-D半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)步驟3獲得的重組菌株表達(dá)融合蛋白GST-pAm。優(yōu)選地，步驟5為純化步驟4獲得的融合蛋白GST-pAm，切除GST標(biāo)簽蛋白，獲得純化的重組豬釉原蛋白pAm。其中，步驟4獲得的融合蛋白GST-pAm通過GST親和層析純化。 優(yōu)選地，步驟5中切除GST標(biāo)簽蛋白采用凝血酶。本發(fā)明提供了一種上述方法制備的重組豬釉原蛋白。所述重組豬釉原蛋白由全長豬釉原蛋白基因(pAm基因)編碼，其中，所述全長豬釉原蛋白基因的堿基序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明提供了一種含有全長豬釉原蛋白基因的重組原核表達(dá)載體，其中，在原核表達(dá)質(zhì)粒PGEX4T1中包含有SEQ ID NO.1核苷酸序列。本發(fā)明還提供了一種上述含有全長豬釉原蛋白基因的重組原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株。使用PGEX4T系列質(zhì)粒所表達(dá)的融合蛋白帶有谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)標(biāo)記，GST本身是解毒過程中重要的轉(zhuǎn)移酶，由于其高度可溶可利用它來增加外源蛋白的可溶性，且其在大腸桿菌中可以大量表達(dá)起到一種促進(jìn)表達(dá)量提高的作用。同時在GST與多克隆位點(diǎn)之間存在可以將GST切除的蛋白酶識別位點(diǎn)，可以將GST切除。E. Co I1. BL21是專門設(shè)計用于在大腸桿菌中表達(dá)異源性蛋白的宿主菌，它可以通過改變IPTG誘導(dǎo)濃度精確控制表達(dá)水平的優(yōu)點(diǎn)，并具有Ion和ompT缺陷型特點(diǎn)，能增加蛋白穩(wěn)定性。根據(jù)研究目的的需要，首次合成全長豬釉原蛋白的編碼序列，并通過原核表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌中成功表達(dá)了融合蛋白。該發(fā)明所得的克隆表達(dá)菌株可長期保存，并隨時大量復(fù)制，能夠較為方便快捷的大量人工合成重組豬釉原蛋白(pAm)，也為將來釉原蛋白的批量化生產(chǎn)以及商品化提供了可能。


圖1為原核表達(dá)載體質(zhì)粒PGEX4T1的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為全長豬釉原蛋白基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖M為DNA模板，I為全長豬釉原蛋白基因擴(kuò)增產(chǎn)物，2為陰性對照。圖3為重組質(zhì)粒酶切鑒定電泳圖M為DNA模板；1為目的基因片段pAm, 2為質(zhì)粒PGEX4T1經(jīng)EcoR I和Sal I雙酶切樣品，3為重組質(zhì)粒經(jīng)EcoR I和Sal I雙酶切樣品。圖4為重組豬釉原蛋白SDS-PAGE凝膠電泳圖M為低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白；(為轉(zhuǎn)化了空白質(zhì)粒PGEX4T1的對照菌株誘導(dǎo)后的樣品；1飛分別為I飛號表達(dá)克隆誘導(dǎo)后的樣品，M為低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白。圖5為重組豬釉原蛋白的純化結(jié)果圖A為SDS-PAGE電泳圖，B為Western-blot鑒定圖。其中Marker為低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白，rPAm為純化后的重組豬釉原蛋白，EMD為實驗室提取的軸基質(zhì)蛋白樣品。圖6為重組豬釉原蛋白rPAm質(zhì)譜分析結(jié)果圖。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述，以更好地理解本發(fā)明。1、克隆全長豬軸蛋白基因(pAm基因)一、主要實驗材料1.主要試劑及溶液(I)小量膠回收試劑盒(天根公司)(2) PCR 試劑Taq DNA 聚合酶、IOX 擴(kuò)增緩沖液、MgCL2、10mmol/L 4XdNTP(Promeg 公司)
(3) DNA marker (天根公司)(4) 6X瓊脂糖電泳上樣液(Takara)。(5) 50XTAE 緩沖液242g Tris 堿、57.1ml 冰乙酸、IOOml O. 5mol/L EDTAPH=8.0，加雙蒸水定容至1L。2.實驗儀器(I)臺式離心機(jī)GB7676-87 (上海離心機(jī)械廠)(2) U-3000 分光光度計(Hitachi 公司)(3) 9600 — PCR 儀(PE 公司)(4)穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀DY-501 (Pharmacia公司)二、實驗方法1.引物設(shè)計(I) pAm基因的堿基序列如SEQ ID NO.1所示,具有特點(diǎn)如下1 59位包含有5’帽結(jié)構(gòu)，5’非翻譯區(qū)及啟動子等結(jié)構(gòu)，6(Tl07位編碼信號肽，108飛29位編碼全長蛋白，63(Γ778位為3’非翻譯區(qū)，包括PolyA尾，因此靶基因的擴(kuò)增范圍為108飛29位。選取pAm基因序列中不存在酶切位點(diǎn)而在質(zhì)粒中存在克隆位點(diǎn)的兩個內(nèi)切酶作為將目的基因克隆入載體中內(nèi)切酶。設(shè)計帶有酶切位點(diǎn)的引物，確保PCR產(chǎn)物在包含完整的PAm基因序列的同時引入酶切位點(diǎn)。以DNA Star軟件對pAm基因序列進(jìn)行分析，此序列108 629位間不存在酶切位點(diǎn)的內(nèi)切酶如下AatII AccI AclI AfeI AflII AflIII AgeI AhdI ApaI ApaLI ApoI AscI AseIAvail AvrII BaeI Bael’ BanII BbeI BbsI BbvCI BcgI Bcgl’ BciVI BclI BfaI BglIBglII BlpI BplI BplI’ BpmI BpulOI BsaAI BsaBI BsaHI BsaI BsaffI BsaXI BsaXI'BseMII BseRI BsiEI BsiHKAI BsiffI BsmBI BsmFI BsmI BspEI BspHI BsrBI BsrDI BsrFIBsrGI BssHII BssSI BstBI BstEII BstUI BstXI BstZ17I Bsu36I BtrIBtsI ClaIDdeI DraI DraIII DrdI EagI EarI EciI EcoICRI EcoNI Eco0109I EcoRI EcoRV FseIFspI HaeII HgaI HhaI HinPlI HincII HpaI Hpy99I HpyCH4III HpyCH4IV KasI MboIIMfeI MluI MspAlI NaeI NarI NdeI NgoMIV NheI NotI NruI NsiI NspI PacI PciI PmeIPmlI PpulOI PpuMI PshAI PsiI PspOMI PvuI PvuII RsrII SacI SacII Sail SanDI SapISau96I SbfI Seal SexAI SfiI SfoI SgfI SgrAI SmlI SnaBI SpeI SphI SrfI SspI StuISwaI TaqI TatI TfiI TscI Tsp509I TspRI TthlllI XbaI XcmI XhoI XmnI
(2)載體質(zhì)粒PGEX4T1的結(jié)構(gòu)示意圖見圖1。比較pAm基因序列中不存在的酶切位點(diǎn)和質(zhì)粒中存在的克隆位點(diǎn)后，選取EcoR I和Sal I作為將目的基因克隆入載體中內(nèi)切酶。按照上述引物設(shè)計要求設(shè)計引物如下Am-EcoR I 5’ CCG GAA TTC ATG CCT CTA CCA CCT CAT CCT G 3’；Am_Sal I 5’ACGC GTCGAC TTA ATC CAC TTC CTC CCG CTT G 3’。2.含有酶切位點(diǎn)的pAm基因的人工合成和擴(kuò)增(I)由上海旭冠生物科技發(fā)展有限公司人工合成含有酶切位點(diǎn)的pAm基因。(2) PCR 擴(kuò)增 pAm 基因以人工合成的pAm基因為模板，擴(kuò)增全長豬釉原蛋白基因。以無菌水代替DNA模板，作為陰性對照。產(chǎn)物上樣進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢驗。反應(yīng)體系如下ddH20 9.8μ1 ； IOXBuffer 2 μ I ；MgC121. 2μ I ；4dNTPs 2μ1;模板 cDNA 2 μ I ;引物 Am-EcoR I I μ I ；Am-Sal I lyl;Taq 酶 Ιμ 。反應(yīng)參數(shù)94°C，5 分鐘；(94°C，30 秒；56°C，30 秒；72°C，45秒)X 30循環(huán)；72°C，5分鐘，反應(yīng)結(jié)束。3.瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物(I)配置1. 5%瓊脂糖凝膠，凝固后放入含有TAE的電泳槽中。(2)取O. 5 μ I 6Χ點(diǎn)樣液在點(diǎn)樣板上，加入2 μ I樣品混勻。(3)上樣，80V，30min。(8)紫外燈下觀測電泳結(jié)果并拍照。4. PCR產(chǎn)物回收(割膠回收試劑盒)對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收(I)將PCR產(chǎn)物電泳條帶在紫外燈下割下含DNA的瓊脂糖塊，使其盡可能小。放入1.5ml尚心管內(nèi)，秤重(膠重=總重量一空管重量)。(2)按每IOOmg瓊脂糖加入300 μ I Buffer SI的比例加入SI液，50°C水浴10分鐘，每2分鐘搖勻一次，直至膠完全溶解。(3)加入1/3 Buffer SI體積的異丙醇，50°C水浴I分鐘，混勻。(4)將溶解的膠液轉(zhuǎn)移到吸附柱內(nèi)，15000 rpm，離心I分鐘。倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一收集管。如膠液體積大于柱容量，則離心完后，再次移液于同一柱內(nèi)，再次離心。(5)在柱內(nèi)加入500 μ I Bufferffl, 10000 rpm,離心15秒。棄去離心液,柱子重新
置于同一回收管內(nèi)。(6)在柱內(nèi)加入500 μ I BufferWl，靜置I分鐘，10000 rpm離心I分鐘。棄去離心液，柱子重新置于同一回收管內(nèi)。(7)將柱子以10000 rpm再次離心I分鐘。(8)將柱子置于一個新的1. 5ml離心管內(nèi)，柱模中央加30 μ I無菌水，50°C水浴或室溫放置2分鐘。(9) 15000rpm，離心I分鐘，收集離心液。(10)取2 μ I離心液，瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳步驟同前。5.測序鑒定目的基因?qū)Ω钅z回收的PCR產(chǎn)物送上海生物工程公司測序，并用DNA Star軟件將測序結(jié)果與Gene Bank公布的標(biāo)準(zhǔn)序列比對。
三、結(jié)果1.目的基因的鑒定瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖2所示，PCR擴(kuò)增后樣品組特異性擴(kuò)增產(chǎn)物大小約540bp，與預(yù)期所得的pAm mRNA編碼區(qū)堿基長度一致。而陰性對照無特異性產(chǎn)物。測序證實PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物與Gene Bank公布的豬釉原蛋白標(biāo)準(zhǔn)序列完全一致。I1、構(gòu)建含有pAm基因的重組原核表達(dá)質(zhì)粒PGEX4Tl_pAm一、主要實驗材料 1.原料(I) PGEX4T1 載體質(zhì)粒(GE healthcare 公司)(2)大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)菌(上海生物工程公司)2.主要試劑(I)限制性內(nèi)切酶 EcoR I，Sal I，IOXK Buffer (TakaRa 公司，大連)(2) T4 DNA Ligase (TakaRa 公司，大連)( 3 )氨芐青霉素(Roche公司)(4)氯霉素(5)小量質(zhì)粒抽提試劑盒(天根公司，北京)使用前將試劑盒中提供的RnaseA全部加入溶液P1，混勻后2 8°C保存。使用前漂洗液PW中加入4倍體積無水乙醇。(6)小量凝膠回收試劑盒(天根公司，北京)(7)液體LB培養(yǎng)基細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨10g，細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物5g，NaClIOgo上述成分配制后，加入適量雙蒸水，磁力加熱攪拌器上充分溶解，5M NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，補(bǔ)雙蒸水至1000ml。121°C高壓蒸汽滅菌20分鐘，冷卻后4°C冰箱保存。(8)固體LB培養(yǎng)基細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨10g，細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物5g，NaClIOg,瓊脂(agarose) 15g。上述成分配制后,加入適量雙蒸水,磁力加熱攪拌器上充分溶解，5M NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，補(bǔ)雙蒸水至1000ml。121 °C高壓蒸汽滅菌20分鐘，取出后在超凈工作臺中加入氨芐青霉素至終濃度為100 μ g/ml，澆制平皿，冷卻后4°C冰箱保存。3.主要儀器( I) YJ-1FB醫(yī)用凈化工作臺(吳江市凈化設(shè)備總廠)(2)臺式離心機(jī)GB7676-87 (上海離心機(jī)械廠)(3)U-3000 分光光度計(Hitachi 公司)(4) 9600 — PCR 儀(PE 公司)(5) Molecular Imager Fx 和 Quantity One 軟件(Bio-Rad 公司)(6)恒溫?fù)u床(YHZ-22江蘇太倉王秀試驗設(shè)備廠)二、實驗方法1.載體的制備PGEX4T1質(zhì)粒抽提(I)將購買的含有質(zhì)粒PGEX4T1的E.Col1.DH5a菌株用劃線法接種于含氨芐青霉素100 μ g/ml的LB固體培養(yǎng)基平皿上，37°C溫箱孵育過夜，活化菌種。(2)次日下午挑取4個單菌落接種于4支含5ml LB液體培養(yǎng)基(氨芐青霉素100 μ g/ml)的燒瓶內(nèi)，搖床內(nèi)37°C，200rpm過夜。(3)將以上菌液轉(zhuǎn)入4個1. 5ml離心管，lOOOOrpm，離心I分鐘，棄上清，吸干殘液。
(4)在離心管內(nèi)加入250 μ I溶液Ρ1，振蕩混勻。(5)加入250 μ I溶液Ρ2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)4 一 6次充分裂解菌體。(6)加入350μ I溶液Ρ3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6 — 8次，充分混勻，見白色絮狀沉淀后12000rpm,離心10分鐘。(7)柱平衡將吸附柱083放入收集管中，加入50(^1平衡液此，12000印111，離心
I分鐘。倒掉收集管中廢液。(8)小心的將步驟6中的上清吸取至吸附柱CB3中，室溫放置I 一 2分鐘，12000rpm
離心I分鐘。倒掉收集管中廢液。(9)向吸附柱CB3中加入700 μ I漂洗液PW，12000rpm離心I分鐘。倒掉收集管中廢液。(10)向吸附柱CB3中加入500 μ I漂洗液PW，12000rpm離心I分鐘。倒掉收集管
中廢液。(11)將吸附柱CB3重新放回收集管中，12000rpm離心2分鐘，除盡殘液。(12)將吸附柱CB3放入一個干凈的離心管中，向吸附膜中央加50 μ I洗脫緩沖液EB,室溫放置2分鐘。12000rpm離心2分鐘，將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。2.重組質(zhì)粒的構(gòu)建(I)目的基因pAm及質(zhì)粒PGEX4T1的雙酶切目的基因pAm與質(zhì)粒PGEX4T1分別用ECoR I和Sal I在37°C H型通用緩沖液中進(jìn)行雙酶切4h，。反應(yīng)體系見下表1、2。表I目的基因酶切反應(yīng)體系(μ I)
權(quán)利要求
1.一種重組豬釉原蛋白的制備方法，其特征在于，包括以下步驟步驟1，合成全長豬釉原蛋白基因；步驟2，構(gòu)建含有上述基因的重組原核表達(dá)質(zhì)粒PGEX4Tl-pAm ；步驟3，將步驟2獲得的重組原核表達(dá)質(zhì)粒PGEX4Tl-pAm轉(zhuǎn)化菌株E. col1. BL21 ；步驟4，誘導(dǎo)步驟3獲得的重組菌株表達(dá)融合蛋白GST-pAm ；步驟5，切除步驟4獲得的融合蛋白GST-pAm的GST標(biāo)簽蛋白，獲得重組豬釉原蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組豬釉原蛋白的制備方法，其特征在于，步驟I中所述全長豬軸原蛋白基因的喊基序列如SEQ ID NO.1所不。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組豬釉原蛋白的制備方法，其特征在于，在步驟2中，構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒PGEX4Tl-pAm采用內(nèi)切酶ECoR I和Sal I，酶切引物分別為5’_CCGGAA TTCATGCCTCTACCACCTCATCCTG-3，和 5， -ACGCG TCGACTTAATCCACTTCCTCCCGCTTG-3，。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組豬釉原蛋白的制備方法，其特征在于，步驟4中，通過異丙基硫代-β -D半乳糖苷誘導(dǎo)步驟3獲得的重組菌株表達(dá)融合蛋白GST-pAm。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組豬釉原蛋白的制備方法，其特征在于，步驟5為純化步驟4獲得的融合蛋白GST-pAm，切除GST標(biāo)簽蛋白，獲得純化的重組豬釉原蛋白pAm。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組豬釉原蛋白的制備方法，其特征在于，步驟4獲得的融合蛋白GST-pAm通過GST親和層析純化。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的重組豬釉原蛋白的制備方法，其特征在于，步驟5中切除 GST標(biāo)簽蛋白采用凝血酶。
8.—種如權(quán)利要求1所述方法制備的重組豬釉原蛋白。
9.一種含有全長豬釉原蛋白基因的重組原核表達(dá)載體，其特征在于，在原核表達(dá)質(zhì)粒 PGEX4T1中包含有SEQ ID NO.1核苷酸序列。
10.一種由權(quán)利要求9所述重組原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種重組豬釉原蛋白，由全長豬釉原蛋白基因編碼，制備方法為合成全長豬釉原蛋白基因；構(gòu)建含有上述基因的重組原核表達(dá)質(zhì)粒PGEX4T1-pAm；將獲得的重組原核表達(dá)質(zhì)粒PGEX4T1-pAm轉(zhuǎn)化菌株E.coli. BL21；誘導(dǎo)獲得的重組菌株表達(dá)融合蛋白GST-pAm；切除獲得的融合蛋白GST-pAm的GST標(biāo)簽蛋白，獲得重組豬釉原蛋白pAm。首次合成全長豬釉原蛋白的編碼序列，并通過原核表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌中成功表達(dá)了融合蛋白。該發(fā)明所得的克隆表達(dá)菌株可長期保存，并隨時大量復(fù)制，能夠較為方便快捷的大量人工合成重組豬釉原蛋白，也為將來釉原蛋白的批量化生產(chǎn)以及商品化提供了可能。
文檔編號C12N15/70GK103014050SQ20131000260
公開日2013年4月3日 申請日期2013年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月5日
發(fā)明者束蓉, 程嵐, 李希庭, 林智愷, 宋忠臣 申請人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院