專利名稱：南美白對(duì)蝦桃拉病毒和白斑病毒多重pcr檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種南美白對(duì)蝦桃拉病毒和白斑病毒多重PCR檢測(cè)方法，屬于微生物檢測(cè)方法技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
我國沿海地區(qū)是南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖的主要產(chǎn)業(yè)區(qū)，在人工養(yǎng)殖環(huán)境中，對(duì)蝦可同時(shí)感染幾個(gè)病原體或病毒。優(yōu)質(zhì)的南美白對(duì)蝦親蝦及蝦苗主要從國外引進(jìn)，但也有可能將潛在的病毒帶入境內(nèi)。桃拉綜合癥病毒(Taura syndrome virus, TSV)和白斑癥(White spotsyndrome virus, WSSV)—直是對(duì)奸養(yǎng)殖中的主要病毒原。近年來,隨著對(duì)奸奸苗和水產(chǎn)品國際貿(mào)易增加，這兩種病毒的混合交叉感染較為普遍，因此對(duì)該病毒的進(jìn)行檢測(cè)與監(jiān)控具有十分重要的意義。對(duì)蝦病病毒檢測(cè)的方法包括組織學(xué)，原位雜交法，以及生物活性法，這些方法較為費(fèi)時(shí)費(fèi)工；而且往往只能適用于發(fā)生急性感染的蝦只，而病毒攜帶的對(duì)蝦往往不出現(xiàn)應(yīng)有的臨床癥狀和病理反應(yīng)，因此使用上述方法存在一定的局限性，加大了檢測(cè)的難度。RT-PCR技術(shù)是一種簡易有效的檢測(cè)方法，但是傳統(tǒng)的PCR方法一次只能檢測(cè)一個(gè)樣本。多重PCR是一種特殊的PCR方法，能在一個(gè)反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物，同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)目的片段。但是多重PCR檢測(cè)方法受多種因素影響，如引物的特異性、模板的質(zhì)量以及不同病毒樣本PCR的擴(kuò)增條件均能影響檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性。有基于此，做 出本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種特異性高、靈敏度高的高效南美白對(duì)蝦TSV和WSSV多重PCR檢測(cè)方法。本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下
南美白對(duì)蝦TSV和WSSV多重PCR檢測(cè)方法，包括如下步驟
(1)樣品采集；
(2)TSV的DNA和WSSV的RNA的提取，以及WSSV的逆轉(zhuǎn)錄cRNA的合成；
(3)TSV引物和WSSV引物的設(shè)計(jì)與合成；
(4)將步驟(2)的核酸和步驟(3)的引物加入PCR反應(yīng)體系，建立PCR反應(yīng)體系，并進(jìn)行多重PCR試驗(yàn)；
(5)將步驟(4)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行特異性和敏感性測(cè)試。本發(fā)明的進(jìn)一步設(shè)置如下
步驟(I)中樣品要在-80°C下進(jìn)行預(yù)處理。步驟(2)中，TSV的RNA的提取取疑似TSV發(fā)病對(duì)蝦內(nèi)臟組織約O. lg，加入ImlTrizol,在4°C下12000g離心lOmin，得上清液；將上清液在15 30°C孵育5min;加入O. 2mL氯仿，振蕩、孵育；在4°C下12000g離心15min ;將離心后的上層無色水相加入O. 5mL異丙醇，震蕩，孵育IOmin;在4°C下12000g離心lOmin，去上清，加入至少lmL75%乙醇，渦旋振蕩；在4°C下7500g離心5min，室溫晾干RNA，加入無RNase的水溶解RNA，55 — 60’C孵育lOmin，溶解，備用。步驟(2)中，TSV的cDNA的合成在PCR反應(yīng)管中加入5 μ L的上述桃拉病毒RNA模板，加入隨機(jī)引物10 20ng，70°C孵育5min后，依次加入4μ L 5XM-MLV Buffer, RNA酶抑制劑和dNTP各I μ L7M-MLV酶I μ L，最后雙蒸水補(bǔ)足20 μ L ;42°C反應(yīng)lh,然后70。。滅活M-MLV酶lOmin，立即冰浴lOmin，得到cDNA，保存于一 80°C備用。步驟(2)中，WSSV的DNA的提取取疑似WSSV發(fā)病對(duì)蝦內(nèi)臟組織共約O. lg，加入200 μ L 裂解液(O. 4Μ NaCl，IOmM Tris-HCl, 2mM EDTA, PH 8. O)研磨均勻后補(bǔ)加 100 μ L裂解液，6000g離心去雜質(zhì)及細(xì)胞碎片，取上清液；在上清液中加入30 μ L 20%SDS和3 μ L20mg/mL蛋白酶K混合均勻，在55°C溫度下培育I 2h后,加入苯酹/氯仿/異戍醇(質(zhì)量比為25:24:1)混合液，去除殘余蛋白，離心后取上清；加入與苯酚/氯仿/異戊醇混合液等體積的異丙醇，并混勻，_20°C下沉淀30min，IOOOOg在4°C離心lOmin，加75%乙醇沉淀；得到的DNA溶于20 μ L雙蒸水中，并于_20°C備用。步驟(3)中，TSVRT-PCR 檢測(cè)用的弓丨頌石-GCTTGCGTGGTGGGACTTAS ,5’ -TCAATGAGAGCTTGGTCCTGG- ；WSSV PCR 檢測(cè)用的引物5，-TCACAGGCGTATTGTCTCTCCT-3’，5’ - CACGAG TCTACCGTCACAACA TC -3’。

步驟(4)中，I μ L的TSV的RNA和WSSV的DNA分別加入PCR反應(yīng)體系12. 5μ1(2XTaq PCR MasterMix,北京艾德萊生物科技有限公司)，再分別加入TSV和WSSV引物正向及反向各O. 5μ1，加重蒸餾水至終體積25yL;擴(kuò)增條件為94°C I min，l個(gè)循環(huán)；51°C min,72°C lmin,94°C 30S，35 個(gè)循環(huán)；51°C :1 min , 72°C 5 min，l 個(gè)循環(huán)。步驟(4)中，桃拉病毒I μ L逆轉(zhuǎn)錄cDNA模板和白斑病毒I μ LDNA模板，加入PCR反應(yīng)體系25μ1 (2XTaq PCR MasterMix,北京艾德萊生物科技有限公司)，加入桃拉病毒和白斑病毒引物正向及反向各O. 5 μ L，加重蒸餾水至終體積50 μ L。另外設(shè)立陽性對(duì)照和的陰性對(duì)照。將反應(yīng)管置于PCR儀上，根據(jù)1. 4研究結(jié)果，按反應(yīng)體系⑵進(jìn)行擴(kuò)增，具體如下 94°C I min，I 個(gè)循環(huán)；51°C min，72°C lmin，94°C 30S，35 個(gè)循環(huán)；51°C :1 min ,72 °C 5min, I個(gè)循環(huán)。步驟(5)中，特異性和敏感性檢測(cè)TSV和WSSV核酸模板的樣品與對(duì)蝦其他病原核酸樣品，分別加入到PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，測(cè)其特異性；將抽提的WSSV的DNA和TSV的RNA作為模板分別測(cè)其含量后，將核酸作10倍系列稀釋，并對(duì)上述模板進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增以檢測(cè)其敏感性^fPCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1. 5%瓊脂糖凝膠電泳富集，回收目的片段，將純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。序列分析用DNASTAR 4.2 (DNASTAR Inc.)和Clustal X1. 83軟件，分析結(jié)果經(jīng)GeneDoc 2. 6. OOO編輯。本發(fā)明技術(shù)方案依據(jù)多重PCR設(shè)計(jì)原則，采用GenBank公布的WSSV和TSV全基因組序列，設(shè)計(jì)了兩對(duì)特異引物分別擴(kuò)增TSV和WSSV病毒。該兩對(duì)引物擴(kuò)增片段較小，PCR擴(kuò)增片段分別為210bp (TSV)和300bp (WSSV)，且大小差異不大，同時(shí)又能在凝膠電泳中區(qū)分出來。事實(shí)上實(shí)驗(yàn)結(jié)果也符合引物設(shè)計(jì)的原則，在合適的反應(yīng)條件下獲得了較為理想的多重PCR擴(kuò)增結(jié)果。即同時(shí)擴(kuò)增出兩個(gè)特異的WSSV和TSV條帶，且能明顯的區(qū)分。除引物設(shè)計(jì)外，篩選出適宜的PCR條件以滿足兩個(gè)片段的同時(shí)擴(kuò)增也是多重PCR成功的關(guān)鍵因素。其中以94°C1 min，l個(gè)循環(huán)；51°C lmin，72°C lmin，94°C 30S，35個(gè)循環(huán)；51°C :1 min ,72V 5 min, I個(gè)循環(huán)擴(kuò)增條件最好,在該體系下各條帶清晰,條帶密集,且所用時(shí)間較短。TSV和WSSV核酸模板與對(duì)蝦其他病原核酸樣品進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，結(jié)果含有WSSV和TSV核酸的樣品能擴(kuò)增出的相應(yīng)特異條帶，而非WSSV和TSV核酸的樣品組未見任何條帶。條帶測(cè)序結(jié)果顯示與TSV和WSSV的同源性為100%。這些研究結(jié)果表明該多重PCR具有良好的特異性。敏感性實(shí)驗(yàn)表明，該多重PCR最低能同時(shí)檢測(cè)到5 Pg的WSSV DNA和O. 5pg的TSV RNA模板，檢測(cè)出如此微量的病原DNA/RNA，說明該方法可用于病毒攜帶的無臨床癥狀的對(duì)蝦檢測(cè)。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例中RT-PCR擴(kuò)增TSV條帶；
圖2為本發(fā)明實(shí)施例中PCR擴(kuò)增WSSV條帶；
圖3為本發(fā)明實(shí)施例中TSV PCR產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果；
圖4為本發(fā)明實(shí)施例中WSSV PCR產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果；
圖5為本發(fā)明實(shí)施例中TSV和WSSV的多重PCR檢測(cè)。
具體實(shí)施例方式A.多重PCR檢測(cè)過程
(I)樣品采集
疑似TSV和WSSV感染對(duì)蝦 在紹興地區(qū)沿海岸線共5個(gè)對(duì)蝦養(yǎng)殖基地進(jìn)行對(duì)蝦樣品收集，對(duì)蝦采集時(shí)在一個(gè)地點(diǎn)的不同池塘里捕撈對(duì)蝦，然后隨機(jī)抽取一定數(shù)量的樣品，運(yùn)至紹興文理學(xué)院凍于_80°C冰箱中。(2)核酸提取
①白斑病毒DNA提取取疑似WSSV發(fā)病對(duì)蝦內(nèi)臟組織共約O.1g,加入200 μ L裂解液(O. 4Μ NaCl, IOmM Tris-HCl, 2Mm EDTA, PH 8. O)研磨均勻后補(bǔ)加 100 μ L，6000g 離心去雜質(zhì)及細(xì)胞碎片，取上清液；在上清液中加入30 μ L 20%SDS和3yL 20mg/mL蛋白酶K混合均勻，在55°C溫育I 2h ;在反應(yīng)液中加入苯酚氯仿異戊醇(25:24:1)去除殘余蛋白，離心后取上清；加入等體積異丙醇混勻，_20°C沉淀30min，IOOOOg在4°C離心lOmin，加75%乙醇沉淀；得到的DNA溶于20 μ L雙蒸水中于，-20°C備用。②桃拉病毒cDNA的合成按Promega公司試劑盒操作方法，在PCR反應(yīng)管中加入5 μ L的桃拉病毒RNA模板，加入隨機(jī)引物10 20ng，70°C孵育5min后依次加入4 μ L5 XM-MLV Buffer, RNA酶抑制劑和dNTP各I μ L，M-MLV酶I μ L，最后雙蒸水補(bǔ)足20 μ L。42°C反應(yīng)lh，然后70°C IOmin滅活M-MLV酶，立即冰浴lOmin。得到cDNA保存于一80°C。③桃拉病毒RNA提取按Invitrogen公司Trizon試劑盒操作方法,取疑似TSV發(fā)病對(duì)蟲下內(nèi)臟組織約O.1g,加入Iml Trizol, 4°C 12000g離心IOmin分；將上清液轉(zhuǎn)移至離心管中，15 30°C孵育5min;力口入O. 2mL氯仿,振蕩、孵育;4°C 12000g離心15min。將上層無色的水相轉(zhuǎn)移到離心管中；加入O. 5mL異丙醇，震蕩，孵育lOmin; 4°C 12000g離心IOmin ;去上清,加入至少lmL75%乙醇，潤旋振蕩；4°C 7500g離心5min;室溫晾干RNA,加入無RNase的水溶解RNA，55 — 60’ C孵育IOmin,溶解。(3)引物的設(shè)計(jì)和合成
根據(jù)GenBank公布的WSSV和TSV全基因組序列，分別設(shè)計(jì)TSV和WSSV的2個(gè)特異性引物，引物由上海生工合成。WSSV PCR檢測(cè)用的引物5 ’ -TCACAGGCGTA TTGTCTCTCCT -3 ’，5 ’ -CACGAG TCTACCGTCACAACA TC _3’;TSV RT-PCR 檢測(cè)用的引物5’-化77化! 7^^7^6^677^-3’
，5，-TCAA TGAGAGCTTGGTCCTGG- 。(4) PCR反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化
I μ LTSV和WSSV模板分別加入PCR反應(yīng)體系12. 5Pl(2XTaq PCR MasterMix,北京艾德萊生物科技有限公司)，再分別加入TSV和WSSV引物正向及反向各O. 5μ1，加重蒸餾水至終體積25μ L。為篩選擴(kuò)增條件，設(shè)計(jì)四種不同的反應(yīng)體系
195°C 2min,94°C 30S，68°C I min，35 個(gè)循環(huán)；68°C 2 min，I 個(gè)循環(huán)；
294°C I min, I 個(gè)循環(huán)；51°C lmin,72°C lmin,94°C 30S，35 個(gè)循環(huán)；51°C :1 min，72°C 5 min，l 個(gè)循環(huán)；
394°C 4min，50°C lmin，72°C I min，35 個(gè)循環(huán)；72°C 5 min，I 個(gè)循環(huán)；
494°C 5 min, I 個(gè)循環(huán)；94°C 45S, 55°C 45S, 72°C I min, 35 個(gè)循環(huán)；72°C lOmin, I 個(gè)循環(huán)。(5 ) TSV 和 WSSV 多重 PCR 實(shí)驗(yàn)
桃拉病毒I μ L逆轉(zhuǎn)錄cDNA 模板和白斑病毒I μ LDNA模板，加入PCR反應(yīng)體系25μ1(2XTaq PCR MasterMix,北京艾德萊生物科技有限公司)，加入桃拉病毒和白斑病毒引物正向及反向各O. 5 μ L，加重蒸餾水至終體積50 μ L0另外設(shè)立陽性對(duì)照和的陰性對(duì)照。將反應(yīng)管置于PCR儀上，根據(jù)1. 4研究結(jié)果，按反應(yīng)體系⑵進(jìn)行擴(kuò)增，具體如下94°C I min, I個(gè)循環(huán)；51°C lmin，72°C lmin，94°C 30S，35 個(gè)循環(huán)；51°C :1 min ,72°C 5 min，l 個(gè)循環(huán)。(6)多重PCR的特異性及敏感性試驗(yàn)
TSV和WSSV核酸模板的樣品與對(duì)蝦其他病原核酸樣品，分別加入到多重PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，以檢測(cè)其特異性。將抽提的WSSV DNA和TSV RNA作為模板分別測(cè)其含量后，將核酸作10倍系列稀釋，并對(duì)上述模板進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增以檢測(cè)其敏感性。(7)測(cè)序與序列分析
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1. 5%瓊脂糖凝膠電泳富集，按照試劑盒操作手冊(cè)進(jìn)行用膠回收試劑盒回收目的片段。將純化后的PCR產(chǎn)物直接送至上海英俊公司(InvitiOgen)測(cè)序。序列分析用 DNASTAR 4. 2 (DNASTAR Inc.)和 Clustal X1. 83 軟件，分析結(jié)果經(jīng) GeneDoc 2.6.000編輯。B.結(jié)果
TSV和WSSV核酸提取后，PCR反應(yīng)體系中加入相應(yīng)引物。本技術(shù)方案通過對(duì)變性和退火溫度時(shí)間和循環(huán)次數(shù)的控制，設(shè)計(jì)四種(1，2，3，4)不同的PCR反應(yīng)體系。結(jié)果顯示所有含有反應(yīng)體系均能擴(kuò)增出與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)大小相符的210bp (TSV)(圖1)和300bp (WSSV)(圖2)的兩條特異條帶。圖中阿拉伯?dāng)?shù)字0，1，2，3，4，5分別代表DNA marker，反應(yīng)條件1，2，3，4以及陰性對(duì)照。圖1，2結(jié)果顯示TSV和WSSV PCR在反應(yīng)體系2和4的條帶最為清晰，但反應(yīng)體系2用時(shí)較短。因此，TSV和WSSV最佳PCR反應(yīng)條件為94°C變性I min，I個(gè)循環(huán)；51°C 退火 lmin，72°C延伸 lmin，94°C 變性 30S，35 個(gè)循環(huán)；51°C :退火 I min，72°C延伸5min, I個(gè)循環(huán)。(I)特異性分析
TSV和WSSV核酸模板的樣品與對(duì)蝦其他病原核酸樣品，結(jié)果含有WSSV和TSV核酸的樣品能擴(kuò)增出的相應(yīng)特異條帶，而非WSSV和TSV核酸的樣品組未見任何條帶(結(jié)果未顯示)。將WSSV和TSV樣品組擴(kuò)增送檢測(cè)序后，PCR產(chǎn)物的序列如圖3 (TSV PCR序列)和圖4(WSSVPCR序列)所示，將該序列輸入NCBI的BLAST搜索軟件，結(jié)果證明序列長度分別為217bp和301bp,與TSV和WSSV的同源性為100%。(2)敏感性分析
將抽提的WSSV DNA和TSV RNA作為模板分別測(cè)其含量后，將核酸作不同倍數(shù)稀釋，并對(duì)上述模板在反應(yīng)體系2中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，該體系最低能同時(shí)檢測(cè)到約為5pg的WSSV和
O.5 pg的TSV核酸模板。(3)多重PCR檢測(cè)結(jié)果
采用WSSV的引物和TSV引物，經(jīng)過多重PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后分別得到300bp大小(WSSV)(圖5中的3和6)的和2IObp (TSV)(圖5中的4和7)大小的電泳條帶，與預(yù)期的結(jié)果一致；并且300bp的WSSV和210bp的TSV能在同一凝膠電泳中明顯區(qū)分出來(圖5中的5和8);而陰性對(duì)照I和9則沒有條帶出現(xiàn)，2為DNA marker。本實(shí)施例依據(jù)片段的長短及引物堿基的分布，設(shè)計(jì)出四種不同的PCR擴(kuò)增條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雖然四個(gè)體系中均可擴(kuò)增出目的片段，但是擴(kuò)增效率及條帶的分布存在差異，其中以 94°C1 min，I 個(gè)循環(huán)；51°C lmin，72°C lmin，94°C 30S，35 個(gè)循環(huán)；51°C :1 min，72°C 5 min, I個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增效果最好,用時(shí)短,特異性和敏感性最高，因而可快速、準(zhǔn)確，可用于病毒攜帶的無臨床癥狀的對(duì)蝦檢測(cè)。
權(quán)利要求
1.南美白對(duì)蝦桃拉病毒和白斑病毒多重PCR檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟(1)樣品采集；(2)TSV的DNA和WSSV的RNA的提取，以及WSSV的逆轉(zhuǎn)錄cRNA的合成；(3)TSV引物和WSSV引物的設(shè)計(jì)與合成；(4)將步驟(2)的核酸和步驟(3)的引物加入PCR反應(yīng)體系，建立PCR反應(yīng)體系，并進(jìn)行多重PCR試驗(yàn)；(5)將步驟(4)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行特異性和敏感性測(cè)試。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的南美白對(duì)蝦桃拉病毒和白斑病毒多重PCR檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟(1)樣品采集隨機(jī)抽取疑似TSV和WSSV感染的南美白對(duì)蝦，在_80°C下冷凍處理；(2)核酸的提取①TSV的RNA的提取取疑似TSV發(fā)病對(duì)蝦內(nèi)臟組織約O.lg，加入Iml Trizol,在4°C下12000g離心lOmin，得上清液；將上清液在15 30°C孵育5min;加入O. 2mL氯仿，振蕩、孵育；在4°C下12000g離心15min ;將離心后的上層無色水相加入O. 5mL異丙醇，震蕩，孵育IOmin;在4°C下12000g離心lOmin，去上清，加入至少lmL75%乙醇，渦旋振蕩；在4°C下7500g離心5min，室溫晾干RNA，加入無RNase的水溶解RNA，55_60°C孵育IOmin,溶解，備用;②TSV的CDNA的合成在PCR反應(yīng)管中加入5μ L的上述桃拉病毒RNA模板，加入隨機(jī)引物10 20ng，70°C孵育5min后，依次加入4 μ L 5 XM-MLV Buffer, RNA酶抑制劑和dNTP各I μ L7M-MLV酶I μ L，最后雙蒸水補(bǔ)足20 μ L ;42°C反應(yīng)lh，然后70°C滅活M-MLV酶IOmin,立即冰浴IOmin,得到cDNA,保存于一 80°C備用；③WSSV的DNA的提取取疑似WSSV發(fā)病對(duì)蝦內(nèi)臟組織共約O.1g,加入200 μ L裂解液(O. 4Μ NaCl，IOmM Tris-HCl, 2mM EDTA, PH 8. O)研磨均勻后補(bǔ)加 100 μ L 裂解液，6000g離心去雜質(zhì)及細(xì)胞碎片，取上清液；在上清液中加入30 μ L 20%SDS和3yL 20mg/mL蛋白酶K混合均勻，在55°C溫度下培育I 2h后，加入苯酚/氯仿/異戊醇(質(zhì)量比為25:24:1)混合液，去除殘余蛋白，離心后取上清；加入苯酚/氯仿/異戊醇混合液等體積異丙醇混勻，-20°C下沉淀30min，IOOOOg在4°C離心lOmin，加75%乙醇沉淀；得到的DNA溶于20 μ L雙蒸水中，并于_20°C備用；(3)TSV 的 RT-PCR 檢測(cè)弓I m -GCTTGCGTGGTGGGACTTA-Y，5’ -TCAATGAGAGCTTGGTCCTGG- ；WSSV 的 PCR 檢測(cè)引物5’ -TCACAGGCGTA TTGTCTCTCCT-2} -CACGAG TCTACCGTCACAACA TC -3’ ；(4)PCR反應(yīng)體系建立和多重PCR試驗(yàn)①Iμ L的TSV的RNA和WSSV的DNA分別加入PCR反應(yīng)體系12. 5μ1 (2 X Taq PCRMasterMix,北京艾德萊生物科技有限公司)，再分別加入TSV和WSSV引物正向及反向各O. 5μ1，加重蒸餾水至終體積25 μ L，進(jìn)行擴(kuò)增；②桃拉病毒Iμ L逆轉(zhuǎn)錄cDNA模板和白斑病毒I μ LDNA模板，加入PCR反應(yīng)體系25μ1，加入桃拉病毒和白斑病毒引物正向及反向各O. 5 μ L，加重蒸餾水至終體積50μ L，另外設(shè)立陽性對(duì)照和的陰性對(duì)照，將反應(yīng)管置于PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增；(5)特異性和敏感性測(cè)試TSV和WSSV核酸模板的樣品與對(duì)蝦其他病原核酸樣品，分別加入到PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，測(cè)其特異性；將抽提的WSSV的DNA和TSV的RNA作為模板分別測(cè)其含量后，將核酸作10倍系列稀釋，并對(duì)上述模板進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增以檢測(cè)其敏感性；將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1. 5%瓊脂糖凝膠電泳富集，回收目的片段，將純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的南美白對(duì)蝦桃拉病毒和白斑病毒多重PCR檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(4)中，擴(kuò)增條件為94°C 5 11^11，1個(gè)循環(huán)；941455，551455，721 I min，35 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin, I個(gè)循環(huán)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的南美白對(duì)蝦桃拉病毒和白斑病毒多重PCR檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(4)中，擴(kuò)增條件為94°C I min，l 個(gè)循環(huán)；51°C lmin,72°C lmin，94°C 30S，35 個(gè)循環(huán)；51°C :1 min , 72°C 5 min,l 個(gè)循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種南美白對(duì)蝦桃拉病毒和白斑病毒多重PCR檢測(cè)方法，屬于微生物檢測(cè)方法技術(shù)領(lǐng)域。包括如下步驟(1)樣品采集；(2)TSV的DNA和WSSV的RNA的提取，以及WSSV的逆轉(zhuǎn)錄cRNA的合成；(3)TSV引物和WSSV引物的設(shè)計(jì)與合成；(4)將步驟(2)的核酸和步驟(3)的引物加入PCR反應(yīng)體系，建立PCR反應(yīng)體系，并進(jìn)行多重PCR試驗(yàn)；(5)將步驟(4)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行特異性和敏感性測(cè)試。本發(fā)明南美白對(duì)蝦桃拉病毒和白斑病毒多重PCR檢測(cè)方法可用于病毒攜帶的無臨床癥狀的對(duì)蝦檢測(cè)，具有特異性高、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK103060471SQ20131000170
公開日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2013年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月5日
發(fā)明者金立方, 余招鋒, 倪堅(jiān) 申請(qǐng)人:紹興文理學(xué)院