專利名稱：疫苗組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒載體，包括編碼HIV多肽的寡核苷酸，更具體地，其中所述病毒載體是腺病毒。具體而言，此類腺病毒是非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物腺病毒，諸如猿猴腺病毒(simianadenovirus)，更具體地，是黑猩猩腺病毒。具體而言，本發(fā)明涉及包括HIV多核苷酸序列的腺病毒載體，該序列編碼多種不同的HIV抗原，例如，兩種或三種或者更多種HIV抗原。本發(fā)明進(jìn)一步涉及制備所述病毒載體的方法，涉及通過本方法所制備的病毒載體，并涉及所述載體在醫(yī)藥，尤其是在預(yù)防性或者治療性疫苗接種方面的用途。HIV-1是導(dǎo)致獲得性免疫缺陷綜合征(the acquired immunedef iciencysyndrome,AIDS)的主要原因，該病癥被認(rèn)為是世界上的主要健康問題之一。盡管在世界范圍內(nèi)已進(jìn)行了廣泛的研究，但生產(chǎn)疫苗的努力至今尚未獲得成功。HIV-1是反轉(zhuǎn)錄病毒科的一種RNA病毒。HIV基因組編碼至少九種蛋白，其被劃分為三個(gè)種類:主要的結(jié)構(gòu)蛋白Gag、Pol和Env,調(diào)控蛋白Tat和Rev,以及輔助蛋白(accessory proteins) Vpu、Vpr、Vif和Nef。HIV基因組顯示了所有反轉(zhuǎn)錄病毒的5' LTR-gag-pol-env-LTR3'組織方式。腺病毒是一種雙鏈DNA病毒，基因組大小大約36kb，由于其具有在多種靶組織中獲得高效基因轉(zhuǎn)移的能力以及巨大的轉(zhuǎn)基因容量而被廣泛地用于基因轉(zhuǎn)移。按常規(guī)，腺病毒的El基因缺失，并用轉(zhuǎn)基因盒替換，該 轉(zhuǎn)基因盒由所選的啟動(dòng)子、感興趣基因的cDNA序列和polyA信號(hào)組成，從而產(chǎn)生復(fù)制缺陷型重組病毒。腺病毒具有典型的二十面體衣殼形態(tài)，其包括三種主要的蛋白，六鄰體(hexon)
(II)、五鄰體基底(penton base) (III)和具圓柄的纖維(IV)，以及大量的其它次要蛋白V1、VII1、IX、IIIa 和 IVa2 (Russell ff.C.2000, Gen Virol, 81:2573-2604)。該病毒的基因組是線性雙鏈DNA，5'末端與末端蛋白共價(jià)結(jié)合，所述5'末端具有反向末端重復(fù)序列(invertedterminal repeats, ITRs)。病毒DNA與高堿性蛋白VII以及被命名為mu小肽緊密結(jié)合。另一種蛋白，V，與此DNA-蛋白復(fù)合體包裝在一起，并通過蛋白VI提供了一種連接至衣殼的結(jié)構(gòu)鏈。此病毒同樣包含病毒編碼的蛋白酶，其對(duì)于加工一些結(jié)構(gòu)蛋白以產(chǎn)生出成熟的傳染性病毒而言是必要的。100種以上不同血清型的腺病毒已被分離出來，其感染不同種類的哺乳動(dòng)物，其中51種是人類起源的。此類人類起源的腺病毒實(shí)例為Ad1、Ad2、Ad4、Ad5、Ad6、AdlU Ad24、Ad34、Ad35。人類的血清型根據(jù)一些生物學(xué)、化學(xué)、免疫學(xué)和結(jié)構(gòu)標(biāo)準(zhǔn)已被劃分為六個(gè)亞類(A-F)[第一頁(yè)，W004018627]。盡管基于Ad5的載體已在大量的基因治療試驗(yàn)中被廣泛地使用，但是由于自然感染而在總體人群中預(yù)先存在的免疫性，使得Ad5以及其它C組腺病毒載體的使用可能受到限制。Ad5以及其它C組成員容易成為血清陽(yáng)性率最高的血清型之一。對(duì)現(xiàn)有載體的免疫性可能由于在治療期間暴露于該載體而得以發(fā)展。此類對(duì)血清陽(yáng)性載體的預(yù)先存在的或者發(fā)展的免疫性可能會(huì)限制基因治療或者接種疫苗努力的功效。因此，在尋找能夠規(guī)避宿主免疫反應(yīng)的基因遞送系統(tǒng)時(shí)，可選的腺病毒血清型構(gòu)成了非常重要的靶標(biāo)?？蛇x血清型的一種此類范圍是非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的腺病毒，尤其是黑猩猩腺病毒。參見美國(guó)專利6，083，716，其描述了兩種黑猩猩腺病毒的基因組。已表明黑猩猩("Pan"或"C")腺病毒載體如同人腺病毒載體一樣有效地誘導(dǎo)對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)(Fitzgerald et al.J.1mmunol.170:1416)。HIV Tat和Nef蛋白是早期蛋白，即它們是在感染的早期，在缺乏結(jié)構(gòu)蛋白的情況下表達(dá)。Nef基因編碼一種早期的輔助性HIV蛋白，其已被表明具有若干種活性。例如，已知Nef蛋白能夠引起CD4，HIV受體，從細(xì)胞表面的清除，盡管此功能的生物學(xué)重要性還有爭(zhēng)議。此外，Nef與T細(xì)胞的信號(hào)通路相互作用并誘導(dǎo)了一種活化狀態(tài)，此狀態(tài)反過來可以促進(jìn)更有效的基因表達(dá)。一些HIV分離物在此區(qū)域內(nèi)具有突變，其致使它們無法編碼功能蛋白并導(dǎo)致其在體內(nèi)復(fù)制和致病過程中嚴(yán)重受損。Gag基因是由全長(zhǎng)RNA翻譯而來，以產(chǎn)生一種前體多聚蛋白，其隨后被剪切成3_5種衣殼蛋白；基質(zhì)蛋白、衣殼蛋白和核酸結(jié)合蛋白以及蛋白酶。(Fundamental Virology,Fields BN, Knipe DM and HowleyM 19962.Fields Virology vol 21996)。Gag基因產(chǎn)生出55-千道爾頓(kD)的Gag前體蛋白，也被稱為p55，其由未經(jīng)剪接的病毒mRNA表達(dá)。在翻譯過程中，p55的N末端被豆蘧?；?，這引發(fā)了其與細(xì)胞膜胞質(zhì)面的結(jié)合。膜結(jié)合的Gag多聚蛋白募集了病毒基因組RNA的兩個(gè)拷貝，以及其它病毒蛋白和細(xì)胞蛋白，這引發(fā)了病毒顆粒從感染細(xì)胞的表面出芽。出芽后，在病毒成熟期間P55被病毒編碼的蛋白酶(Pol基因的產(chǎn)物)切割為四種更小的蛋白，被命名為MA(基質(zhì)matrix[pl7])、CA (衣殼 capsid[p24])、NC(核殼體 nucleocapsid[p9])和 ρ6.(4)。

除三種主要的Gag蛋白(pl7，p24and p9)之外，所有Gag前體都含有若干個(gè)其它區(qū)域，其被切割下來并作為各種大小的肽保留在病毒粒子中。這些蛋白具有不同的作用，例如P2蛋白被提出在調(diào)節(jié)蛋白酶活性方面具有作用，并且有助于對(duì)蛋白水解加工進(jìn)行正確的時(shí)間選擇。MA多肽來源于p55的N-端，豆蘧酰化末端。大多數(shù)MA分子保持連接于病毒粒子脂雙層的內(nèi)表面，使該病毒顆粒穩(wěn)定。一套(subset)MA在病毒粒子更深層的內(nèi)部被募集，在其中它成為復(fù)合物的一部分，該復(fù)合物護(hù)送病毒DNA至細(xì)胞核。這些MA分子促進(jìn)了病毒基因組的核轉(zhuǎn)運(yùn)，因?yàn)镸A上的親細(xì)胞核信號(hào)被細(xì)胞的核輸入機(jī)器所識(shí)別。此現(xiàn)象使HIV能夠感染不發(fā)生分裂的細(xì)胞，對(duì)反轉(zhuǎn)錄病毒而言是一種不尋常的特性。p24(CA)蛋白構(gòu)成病毒顆粒的圓錐形核心。親環(huán)蛋白A(CyclophilinA)已被證實(shí)與p55的p24區(qū)域相互作用，導(dǎo)致其整合入HIV顆粒中。Gag與親環(huán)蛋白A之間的相互作用是必不可少的，因?yàn)橥ㄟ^環(huán)孢菌素A破壞這種相互作用抑制了病毒的復(fù)制。Gag的NC區(qū)負(fù)責(zé)特異性地識(shí)別所謂HIV包裝信號(hào)。該包裝信號(hào)由定位于病毒RNA5'末端附近的四個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)組成，并且足以介導(dǎo)將異源RNA整合進(jìn)HIV-1病毒粒子中。NC通過由兩個(gè)鋅指基元介導(dǎo)的相互作用而結(jié)合于包裝信號(hào)。NC同樣有助于反轉(zhuǎn)錄過程。p6多肽區(qū)介導(dǎo)p55Gag和輔助蛋白Vpr之間的相互作用，導(dǎo)致Vpr被整合入裝配中的病毒粒子。p6區(qū)同樣含有所謂的晚期結(jié)構(gòu)域(Iatedomain)，其是出芽的病毒粒子從感染細(xì)胞中有效釋放所必需的。Pol基因編碼三種具有病毒早期感染所需活性的蛋白，反轉(zhuǎn)錄酶RT、蛋白酶以及使病毒DNA整合入細(xì)胞DNA所需的整合酶蛋白。Pol的初級(jí)產(chǎn)物被病毒粒子的蛋白酶切割以產(chǎn)生氨基末端的RT肽，其含有DNA合成所需的活性(RNA和DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶，核糖核酸酶H)，以及羧基末端的整合酶蛋白。HIV RT是全長(zhǎng)RT(p66)與剪切產(chǎn)物(P51)的異源二聚體，其缺少羧基末端核糖核酸酶整合酶結(jié)構(gòu)域。RT是反轉(zhuǎn)錄病毒基因組所編碼的最高度保守的蛋白之一。RT的兩種主要活性是DNA Pol和核糖核酸酶H。RT的DNA Pol活性可互換地(interchangeably)使用RNA和DNA作為模板，而且如同所有已知的DNA聚合酶一樣，無法從頭啟始DNA合成，而是需要預(yù)先存在的分子作為引物(RNA)。當(dāng)進(jìn)行DNA合成時(shí)，所有RT蛋白所固有的核糖核酸酶H活性在復(fù)制早期去除RNA基因組的過程中發(fā)揮著基本的作用。它從所有RNA-DNA雜合體分子中選擇性地降解RNA。在結(jié)構(gòu)上，聚合酶和核糖核酸酶H占據(jù)了 Pol中分開且不相重疊的結(jié)構(gòu)域，占Pol三分之二
的氨基酸。p66的催化亞基被折疊成5個(gè)不同的亞結(jié)構(gòu)域。其氨基末端23是具有具RT活性的部分。其羧基末端是核糖核酸酶H的結(jié)構(gòu)域。在感染宿主細(xì)胞后，反轉(zhuǎn)錄病毒的R`NA基因組被反轉(zhuǎn)錄酶拷貝成線性的dsDNA,所述反轉(zhuǎn)錄酶存在于傳染性顆粒中。整合酶(在SkalkaAM' 99Adv in Virus Res52271-273中綜述)識(shí)別病毒DNA的末端，修整它們并陪伴病毒DNA至宿主染色體位點(diǎn)以催化整合。宿主DNA中的許多位點(diǎn)可以是整合的靶標(biāo)。盡管整合酶足以催化體外整合，但它并不是唯一與病毒DNA體內(nèi)結(jié)合的蛋白，從被感染的細(xì)胞中分離出來的大的蛋白-病毒DNA復(fù)合物被稱為整合前復(fù)合物(pre integrationcomplex)。這有助于通過子代病毒基因組來獲取宿主細(xì)胞的基因。整合酶由三個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域組成，N末端結(jié)構(gòu)域、催化核心和C末端結(jié)構(gòu)域。催化核心結(jié)構(gòu)域包含了所有聚核苷?；D(zhuǎn)移化學(xué)所需的條件。病毒載體，特別是含有多個(gè)外源基因的腺病毒載體并非總是容易制備。可能存在載體穩(wěn)定性方面的問題，以及獲得插入基因有效表達(dá)方面的困難。特別是，包含一種以上或者兩種以上HIV多核苷酸的腺病毒尚未被成功制備出來，所述多核苷酸可以被用于疫苗中。非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物腺病毒可以從黑猩猩的腸系膜淋巴結(jié)中分離。黑猩猩腺病毒與人腺病毒亞型C十分相似，使得El缺失型病毒能夠在HEK 293細(xì)胞中復(fù)制。但黑猩猩腺病毒與更常見的人類血清型(Ad2和Ad5)在系統(tǒng)發(fā)生上不同。Pan 6與Pan' s 5、7和9相關(guān)度更低，且在血清學(xué)上不同。存在某些大小方面的限制，其與將異源DNA插入腺病毒相關(guān)。人類腺病毒具有包裝多達(dá)105%或者野生型基因組長(zhǎng)度的能力。(Bett et all993，J Virol 67(10)，5911-21)。對(duì)人類腺病毒更低的包裝限制已被表明為野生型基因組長(zhǎng)度的75% (Parks etal 1995，J Virol 71 (4)，3293-8)。對(duì)于尋找對(duì)抗HIV的有效疫苗仍存在需求。
本發(fā)明提供了缺失一個(gè)或多個(gè)區(qū)域的腺病毒載體，該載體包括編碼至少三種HIV抗原或者其免疫原性衍生物或免疫原性片段的一條或多條多核苷酸，其中所述載體能夠在哺乳動(dòng)物宿主中表達(dá)所述抗原或者片段或衍生物，并且其中所述缺失的大小以及所述一條或多條HIV多核苷酸的大小是這樣的，其使得所述載體基因組的全長(zhǎng)是野生型病毒基因組長(zhǎng)度的85至105%。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，由所述一條或多條多核苷酸編碼的HIV抗原可以是Gag、Nef和Pol。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，Pol可以只包括RT部分。在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，編碼所述HIV抗原的一條或多條多核苷酸可以被安排為按Gag、RT、Nef的順序進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，即Gag部分位于所產(chǎn)生的融合蛋白的N-末端。整個(gè)載體基因組的大小可以是例如野生型病毒基因組大小的90至100%，或者野生型病毒基因組大小的95至100%。在一種實(shí)施方式中，所述載體的全部大小可以是野生型病毒基因組大小的大約96%。用于包含 在根據(jù)本發(fā)明的腺病毒載體中的特定HIV抗原是Pol、Nef和Gag或者它們的免疫原性衍生物或免疫原性片段。此類腺病毒載體可以與藥學(xué)上可接受的賦形劑、載體、稀釋劑或者佐劑一起配制以生產(chǎn)免疫原性組合物，包括適于治療和/或預(yù)防HIV感染和AIDS的藥物或疫苗組合物。本發(fā)明中所使用的腺病毒不同于人類群體中流行的天然存在的(prevalentnaturally occurring)血清型,諸如Ad2和Ad5,的腺病毒。這就避免了誘發(fā)針對(duì)所述載體的強(qiáng)大的免疫反應(yīng)，其通過中和抗體以及影響毒性而阻斷了載體的攝入，從而限制了以后施用相同血清型的功效。因此，該腺病毒載體可以是腺病毒，其并非是流行的天然存在的人類病毒血清型。從動(dòng)物中分離的腺病毒含有免疫學(xué)上不同的衣殼、六鄰體、五鄰體和纖維組分，但它們?cè)谙到y(tǒng)發(fā)生學(xué)上密切相關(guān)。特別地，所述病毒可以是非人類的腺病毒，諸如猿猴病毒，并且尤其是黑猩猩腺病毒，諸如Pan 5、6、7或者9。此類品系的實(shí)例在W003/000283中被描述，并可從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(the American Type CultureCollection), 10801UniversityBoulevard, Manassas, Virginia 20110-2209以及其他來源獲得。理想的黑猩猩腺病毒株系是 Pan 5[ATCCVR-591]、Pan 6 [ATCC VR-592]和 Pan 7 [ATCC VR-593]。其它合適的腺病毒包括，但不限于，黑猩猩腺病毒C I和C68(Pan9)，其在美國(guó)專利N0.6，083, 716中被加以描述；以及猿猴腺病毒包括，但不限于SVl [VR-195] ；SV25[SV-201] ；SV35 ；SV15 ；SV-34 ；SV-36 ；SV-37和狒狒腺病毒[VR-275]等。Pan 5(也被稱為C5)、Pan 6(也被稱為C6)、Pan7(也被稱為07)、5￥1、5￥25和SV39的序列已被加以描述[W003/046124，2003年6月5日公布]。還參見國(guó)際專利公布號(hào)W004/16614,其描述了雜種腺病毒載體和由猿猴腺病毒SA18構(gòu)建的載體。黑猩猩腺病毒由于缺少對(duì)目標(biāo)種群中的腺病毒預(yù)先存在的免疫性，尤其是缺少交叉中和抗體而被認(rèn)為是優(yōu)于人類腺病毒血清型。與某些候選的人類腺病毒載體在目標(biāo)種群中35%的交叉反應(yīng)相比，黑猩猩腺病毒與預(yù)先存在的中和抗體反應(yīng)的交叉反應(yīng)在目標(biāo)種群中僅為2%。所述黑猩猩腺病毒不同于更常見的人類亞型Ad2和Ad5，但與人類亞組E的Ad4更密切的相關(guān)，Ad4并非流行的亞型。Pan 6與Pan 5、7和9相關(guān)度更低。本發(fā)明的腺病毒可以是復(fù)制缺陷型。這意味著其與野生型病毒相比，在非互補(bǔ)細(xì)胞中具有減弱的復(fù)制能力。這可以通過使病毒突變，例如通過使涉及復(fù)制的基因缺失，例如使Ela、Elb、E3或E4基因缺失而產(chǎn)生。根據(jù)本發(fā)明所述的腺病毒載體可以是包括功能性El缺失的復(fù)制缺陷型腺病毒。因此，根據(jù)本發(fā)明所述的腺病毒載體可以由于缺乏表達(dá)腺病毒Ela和Elb的能力，即在Ela和Elb中被功能性缺失而是復(fù)制缺陷型的。重組的腺病毒也可以在其它基因中包含功能性缺失[參見WO 03/000283]，例如在E3或E4基因中的缺失。腺病毒延遲早期基因(delayedearly gene)E3可以從構(gòu)成重組病毒一部分的猿猴腺病毒序列中被去除。E3的功能不是生產(chǎn)重組腺病毒顆粒所必需的。因此，替換此基因產(chǎn)物的功能以包裝在本發(fā)明中有用的重組猿猴腺病毒并不是必需的。在一項(xiàng)特殊的實(shí)施方式中，該重組(猿猴)腺病毒含有功能性缺失的El和E3基因。此類載體的構(gòu)建過程在Roy et al.,Human GeneTherapy 15:519-530,2004中被加以描述。重組腺病毒同樣可以被構(gòu)建為含有功能性缺失的E4基因，盡管保留E40RF6的功能可能是理想的。根據(jù)本發(fā)明的腺病毒載體也可以含有延遲早期基因E2a的缺失。缺失同樣可以在猿猴腺病毒基因組的晚期基因LI至L5的任何一個(gè)中進(jìn)行。同樣地，中期基因(intermediategenes) IX和Iva中的缺失可能是有用的。其它缺失可以在其它結(jié)構(gòu)性或非結(jié)構(gòu)性腺病毒基因中進(jìn)行。以上缺失可以被單個(gè)使用，即用于本發(fā)明的腺病毒序列可以只含有El的缺失。作為另一種選擇，能夠有效破壞整個(gè)基因或者其一部分的生物學(xué)活性的缺失可以以任何組合方式使用。例如在一種示例性的載體中，腺病毒序列可以含有El基因和E4基因的缺失，或者El、E2a和E3基因的缺失，或者El和E3基因的缺失(諸如Ela和Elb的功能性缺失，以及E3的至少一部分的缺失)，或者El、E2a和E4基因的缺失，帶有或不帶有E3的缺失等等。此類缺失可以是這些基因的部分缺失或全部缺失，并可以與其它突變方式，諸如溫度敏感型突變組合使用以取得所期望的結(jié)果。所述腺病毒載體可以在任何合適的細(xì)胞系中制備，在該細(xì)胞系中所述病毒能夠復(fù)制。特別地，可以使用互補(bǔ) 細(xì)胞系(complementing cel 11 ines),該細(xì)胞系提供了病毒載體中失去的因子，該失去的因子導(dǎo)致了受損的復(fù)制特征。例如，互補(bǔ)細(xì)胞系可以表達(dá)E1、或者El和E3、或者El、E3和E4。沒有限制地，此類細(xì)胞系可以是HeLa[ATCC AccessionN0.CCL 2]、A549[ATCC Accession N0.CCL 185],HEK 293、KB[CCL17]、Detroit[e.g.，Detroit510，CCL 72]和W1-38[CCL 75]細(xì)胞等。這些細(xì)胞系均可從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(theAmerican Type CultureCollection),10801University Boulevard, Manassas, Virginia
20110-2209獲得。其它合適的親代細(xì)胞系可以從其它來源獲得，諸如PER.C6 細(xì)胞，如通過以ECACC n0.96022940保藏于應(yīng)用微生物學(xué)與研究中心(theCentre for AppliedMicrobiology and Research, CAMR, UK)的歐洲動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(the EuropeanCollection of Animal Cell Cultures, ECACC)的細(xì)胞所代表的。本發(fā)明在另一方面提供了一種腺病毒載體，包含以Gag、RT、Nef順序編碼至少HIV抗原RT、Nef和Gag或者它們的免疫原性衍生物或免疫原性片段的一條或多條多核苷酸，換言之，腺病毒載體包含編碼至少HIV抗原RT、Nef和Gag或者它們的免疫原性衍生物或免疫原性片段的一條或多條多核苷酸，其被如此排布以使得它們按Gag、RT、Nef的順序被轉(zhuǎn)錄。例如，根據(jù)本發(fā)明所述的腺病毒載體可以包括編碼Gag或者其免疫原性衍生物或免疫原性片段的多核苷酸，其被融合于編碼RT或者其免疫原性衍生物或免疫原性片段的多核苷酸序列，其被融合于Nef或者其免疫原性衍生物或免疫原性片段，并在單個(gè)異源啟動(dòng)子的控制下，其中該基因的Gag部分存在于所述多核苷酸的5'末端。在本發(fā)明的另一種備選的實(shí)施方式中，所述三種抗原中的每一種均通過其自身的啟動(dòng)子進(jìn)行表達(dá)，每一種所述的啟動(dòng)子可以是相同的或不同的。在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，三種抗原中的兩種形成融合物，連接于單個(gè)啟動(dòng)子，而第三種抗原被連接于第二個(gè)啟動(dòng)子上，該第二個(gè)啟動(dòng)子可以與第一個(gè)啟動(dòng)子相同或不同。例如，Gag和RT可以被連接于第一啟動(dòng)子，而Nef可以被連接于第二啟動(dòng)子。編碼至少三種HIV抗原或者它們的免疫原性衍生物或免疫原性片段的一條或多條多核苷酸可以被插入任何腺(Adeno)缺失區(qū)，例如插入E I缺失區(qū)。盡管編碼抗原的兩條或多條多核苷酸可以連接為融合形式，但所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可以表達(dá)為融合蛋白，或者可以表達(dá)為分離的蛋白產(chǎn)物，或者可以表達(dá)為融合蛋白，然后被分解為更小的亞基。在一方面，本發(fā)明提供了一種由根據(jù)本發(fā)明的載體所表達(dá)的融合蛋白，例如，人體內(nèi)產(chǎn)生的融合蛋白。被包括在根據(jù)本發(fā)明的載體中的編碼例如Nef、Gag或RT的一條或多條HIV序列可以針對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，例如使它/它們?cè)谄涿艽a子使用方面與高表達(dá)的人類基因相類似。這些HIV序列的密碼子優(yōu)化在WO 03/025003中被進(jìn)一步加以描述。例如，在根據(jù)本發(fā)明的腺病毒載體中，編碼Gag和/或RT的多核苷酸可以如上面所討論的進(jìn)行了密碼子優(yōu)化。根據(jù)本發(fā)明的腺 病毒載體中的Gag序列可以不包括Gag p6多肽編碼序列。用于本發(fā)明的Gag序列的具體實(shí)例包括pl7和/或p24編碼序列。RT序列可以編碼突變以使任何反轉(zhuǎn)錄酶活性基本失活。一種具體的失活突變包括將W色氨酸229置換為K (賴氨酸)，參見W003/025003。如上所述，RT基因是HIV基因組中更大的Pol基因的組分。應(yīng)當(dāng)理解，包括在根據(jù)本發(fā)明的腺病毒載體中的RT編碼序列可以存在于Pol的范圍(context)中，或者是至少編碼RT的Pol片段。Pol的此類片段保留了 Pol的主要CTL表位。在一個(gè)具體的實(shí)例中，RT僅以RT的p51或者p66片段而被包括在內(nèi)。任選地，用于本發(fā)明的Nef序列被截短以去除編碼N末端區(qū)的序列，即去除30至85個(gè)氨基酸，例如60至85個(gè)氨基酸，尤其是N末端的65個(gè)氨基酸(后一種截短方式在此被稱為trNef)。備選地或額外地，Nef可以被修飾以去除一個(gè)或多個(gè)肉豆蘧?；稽c(diǎn)(myristylation sites)。例如,Gly 2肉豆蘧?；稽c(diǎn)可以通過缺失或置換而被去除。備選地或額外地，Nef可以通過缺失或置換Leu 174和Leu 175中的一個(gè)或兩個(gè)而被修飾以改變此雙亮氨酸基序(dileucine motif)。在⑶4的下調(diào)過程中,此雙亮氨酸基序的重要性在例如 Bresnahan P.A.et al (1998) Current Biology, 8 (22):1235-8 中被加以描述。根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)建物可以包括Gag、Pol和Nef，其中存在這些天然抗原的至少75%，或至少90%或至少95%，例如96%的CTL表位。在根據(jù)本發(fā)明的包括pl7/p24Gag、p66RT和如上所定義的截短的Nef的構(gòu)建物中，存在天然Gag、Pol和Nef抗原的96%的CTL表位。
本發(fā)明的一種實(shí)施方式提供了一種腺病毒載體，包括按Gag、RT、Nef順序編碼pl7、p24 (優(yōu)化的)Gag、p66RT (優(yōu)化的)、截短的Nef (缺少編碼末端氨基酸1-85-" trNef"的核苷酸)的一條或多條多核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)建物包括:1.P17, p24 (密碼子經(jīng)優(yōu)化)Gag-p66RT(密碼子經(jīng)優(yōu)化)_截短的Nef ；2.截短的Nef_p66RT (密碼子經(jīng)優(yōu)化)-pl7，p24 (密碼子經(jīng)優(yōu)化)Gag ；3.截短的Nef_pl7，p24(密碼子經(jīng)優(yōu)化)Gag_p66RT (密碼子經(jīng)優(yōu)化)；4.p66RT (密碼子經(jīng)優(yōu)化)-pl7, p24 (密碼子經(jīng)優(yōu)化)Gag-截短的Nef ；5.p66RT (密碼子經(jīng)優(yōu)化)-截短的Nef-pl7，p24 (密碼子經(jīng)優(yōu)化)Gag ；6.pl7,p24(密碼子 經(jīng)優(yōu)化)Gag-截短的Nef-p66RT (密碼子經(jīng)優(yōu)化)。本發(fā)明的一種或多種多核苷酸可以含有接頭序列，其存在于編碼Gag、RT和Nef的序列之間。此類接頭序列可以是，例如，長(zhǎng)度達(dá)20個(gè)氨基酸。在一個(gè)具體實(shí)例中，它們可以是I至10個(gè)氨基酸，或者I至6個(gè)氨基酸，例如2至4個(gè)氨基酸。本發(fā)明的多核苷酸可以包含進(jìn)一步的HIV序列。特別是，它們可以包括HIV env蛋白或者它們的免疫原性衍生物或免疫原性片段。env的適當(dāng)形式是gpl20、gpl40和gpl60。其它適當(dāng)?shù)腍IV序列包括但不限于Tat、Rev、Vpu、Vpr和Vif。因此,本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種腺病毒載體，包括按Gag、RT、Nef的順序編碼HIV抗原RT、Nef和Gag或者它們的免疫原性衍生物或免疫原性片段以及HIV env蛋白或者它們免疫原性衍生物或免疫原性片段的一個(gè)或多個(gè)多核苷酸。此外，本發(fā)明包括一種免疫原性組合物，其包括根據(jù)本發(fā)明的腺病毒載體與第二種腺病毒載體的組合，所述第二種腺病毒載體包括編碼一種或多種HIV抗原的一個(gè)或多個(gè)多核苷酸。應(yīng)當(dāng)理解，對(duì)于包括在本發(fā)明中的所有HIV序列而言，它們并非必須代表編碼全長(zhǎng)蛋白或天然蛋白的序列。免疫原性衍生物，諸如截短的或以其它方式改變的，例如突變的蛋白也可以被考慮，編碼至少一種HIV表位，例如CTL表位(一般是至少8個(gè)氨基酸的肽)的片段，也可以被考慮。只要所編碼的寡肽或多肽表現(xiàn)出HIV抗原性，也就是說主要的CTL表位由該寡肽或多肽保留下來，那么編碼至少8個(gè)，例如8-10個(gè)氨基酸或者長(zhǎng)度達(dá)20、50、60、70、100、150或200個(gè)氨基酸的片段的多核苷酸被認(rèn)為是屬于本發(fā)明的范疇。主要的CTL表位在此被定義為能夠引起體內(nèi)免疫反應(yīng)的那些表位。由根據(jù)本發(fā)明所述的多核苷酸序列編碼的HIV多肽分子可以代表至少50%天然蛋白長(zhǎng)度的片段，該片段可以包含突變，但其保留了至少一種HIV表位并表現(xiàn)出HIV抗原性。此類HIV抗原性可以通過例如測(cè)量抗體或者細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)而被加以測(cè)量。類似地，根據(jù)本發(fā)明的免疫原性衍生物必須表現(xiàn)出HIV抗原性。免疫原性衍生物可以提供一些超過天然蛋白的潛在優(yōu)勢(shì)，諸如減少或去除天然蛋白的功能，該功能在疫苗抗原中是不想要的，諸如酶活性(RT)、或者CD4下調(diào)作用(Nef)。所述多核苷酸序列可以是針對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞而進(jìn)行了密碼子優(yōu)化的，根據(jù)本文所述的本發(fā)明密碼子優(yōu)化的方面進(jìn)行。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種制備根據(jù)本發(fā)明所述的載體的方法，包括步驟:a)提供腺病毒載體；b)提供質(zhì)粒,其攜帶可操作地連接于適當(dāng)啟動(dòng)子的所述HIV抗原序列；
c)用所述質(zhì)粒和所述載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞；d)經(jīng)過足夠的時(shí)間使重組能夠發(fā)生；并e)回收攜帶所述HIV抗原序列的重組病毒載體。在另一方面，本發(fā)明提供了一種在哺乳動(dòng)物中引發(fā)免疫反應(yīng)的方法，該方法包括向哺乳動(dòng)物施用適當(dāng)量的根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物。本發(fā)明可以特別涉及HIV-1。此處所述的構(gòu)建物可以來源于任何HIV分化枝(clade),例如分化枝B或分化枝C,尤其是分化枝B。用于根據(jù)本發(fā)明的腺病毒載體的啟動(dòng)子可以是來自HCMV IE基因的啟動(dòng)子，例如其中，包含外顯子I的所述HCMV IE基因的5'非翻譯區(qū)被包括在內(nèi)，如WO 02/36792中所述。所述藥物組合物可以按足夠的量施用，以轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞并提供足夠水平的基因轉(zhuǎn)移與表達(dá)，從而提供治療益處，其無不適副作用或者具有醫(yī)學(xué)上可接受的生理效應(yīng)，其可以由醫(yī)藥領(lǐng)域的技術(shù)人員來確定。常規(guī)的藥學(xué)上可接受的給藥途徑包括，但不限于，直接遞送至視網(wǎng)膜以及其它眼內(nèi)遞送方法，直接遞送至肝臟，吸入，鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、氣管內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、直腸、經(jīng)口的以及其它腸胃外的給藥途徑。如需要，給藥途徑可以進(jìn)行組合，或者根據(jù)基因產(chǎn)物或病癥來加以調(diào)整。給藥途徑主要決定于所治療病癥的性質(zhì)。所述病毒載體的劑量將主要決定于這些因素，諸如所治療的病癥、患者的年齡、體重和健康狀況，因此，可以在患者之間有所變化。例如所述病毒載體的成人或獸醫(yī)的治療有效劑量一般范圍是大約100 μ L至大約IOOmL的載體，其含有濃度大約IxlO6至大約IxlO15個(gè)病毒顆粒、大約IxlO11至大約IxlO13個(gè)病毒顆粒、或者大約IxlO9至大約IxlO12個(gè)病毒顆粒。劑量范圍將決定于動(dòng)物的大小和給藥途徑。例如，對(duì)于單個(gè)部位，合適的人用或獸用肌內(nèi)注射劑量(對(duì)于大約80kg的動(dòng)物)是在每毫升大約IxlO9至大約5xl012個(gè)顆粒。任選地，可以采用多部位的給藥方式。在另一實(shí)例中，對(duì)于經(jīng)口的制劑，合適的人用或獸用劑量可以是范圍大約IxlO11至大約IxlO15個(gè)顆粒。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)給藥途徑以及重組載體所應(yīng)用的治療或免疫應(yīng)用來調(diào)整這些劑量。所述治療產(chǎn)物的表達(dá)水平，或者對(duì)于免疫原而言，循環(huán)抗體的水平，可以被監(jiān)測(cè)以確定劑量給藥頻率。確定給藥頻率的時(shí)間安排的其它方法對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言將是顯而易見的。
所述藥物組合物的施用可以采用一次單劑量或一次以上單劑量的形式，例如作為相同的含多核苷酸腺病毒的重復(fù)劑量，或者按異源"激發(fā)-強(qiáng)化(prime-boost)"的疫苗接種制度。異源激發(fā)-強(qiáng)化制度在激發(fā)和強(qiáng)化過程中采用了不同形式疫苗的給藥，其每一種可以包括兩次或多次給藥。激發(fā)組合物和強(qiáng)化組合物通常將含有至少一種共同的抗原，盡管沒有必要是同一形式的抗原，但可以是不同形式的同一抗原。使用本發(fā)明所述載體的激發(fā)強(qiáng)化制度可以采用異源DNA和腺病毒載體的激發(fā)強(qiáng)化形式，例如裸DNA激發(fā)給藥，隨后以腺病毒載體強(qiáng)化，或者例如，腺病毒載體激發(fā)，隨之以一種或多種裸DNA強(qiáng)化。此類DNA強(qiáng)化可以通過肌內(nèi)或皮內(nèi)DNA給藥的方式，或者粒子加速技術(shù)來進(jìn)行遞送。備選地，此類激發(fā)強(qiáng)化制度可包括例如根據(jù)本發(fā)明的蛋白和腺病毒載體，其中激發(fā)劑量包括該蛋白，強(qiáng)化劑量包括該腺病毒載體，或者例如，其中激發(fā)劑量包括腺病毒載體，而強(qiáng)化劑量包括蛋白。實(shí)施例實(shí)施例1E1/E3缺失的Pan 6和Pan 7腺病毒的構(gòu)建1.重組型El-缺失SV-25載體的形成構(gòu)建一質(zhì)粒，其含有除工程化的El缺失以外的完整的SV-25基因組。在El缺失的部位，限制性內(nèi)切酶1-CeuI和P1-SceI的識(shí)別位點(diǎn)被插入，其使得來自穿梭質(zhì)粒的轉(zhuǎn)基因能夠被插入，其中，這兩個(gè)酶識(shí)別位點(diǎn)位于轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒側(cè)翼。含有限制性位點(diǎn)Swa1-SnaB1-Spe1-Afn1-EcoRV-SwaI的合成接頭被克隆進(jìn)用EcoRI和NdeI切開的pBR322中。通過使兩種合成寡聚物SV25T(5，-MT TTA MT ACG TAGCGC ACT AGT CGC GCT MG CGC GGA TAT CAT TTAAA-3’)和 SV25B(5’-TAT TTA AAT GAT ATC CGC GCT TAA GCG CGA CTA GTG CGC TAC GTATTTA-3，)一起退火并將其插入用EcoRI和NdeI消化的pBR322來完成此過程。Ad SV25的左端(bpI至1057)被克隆進(jìn)SnaBI和SpeI位點(diǎn)間的上述接頭中。Ad SV25的右端(bp28059至31042)被克隆進(jìn)AfIII和EcoRV位點(diǎn)間的接頭中。然后將腺病毒El如下所述從被克隆的左端的 EcoRI 位點(diǎn)(bp 547)至 XhoI (bp 2031)切下。將來自 pShuttle (Clontech)的由PCR生成的1-Ceul-P1-SceI盒在EcoRI和SpeI位點(diǎn)間插入。然后，將Ad SV_25(bp2031至12185)的10154bp XhoI片段插入SpeI位點(diǎn)。所產(chǎn)生的質(zhì)粒用HindIII消化，并通過插入18344bp Ad SV-25HindIII 片段(bpll984 至 30328)來完成此構(gòu)建物(Psv25)，從而生成 El缺失的腺病毒SV25的完整分子克隆，其適合于生成重組型腺病毒。任選地，所需轉(zhuǎn)基因被插入新創(chuàng)的PSV25載體質(zhì)粒的1-CeuI和P1-SceI位點(diǎn)。為生成攜帶標(biāo)記基因的AdSV25,先前被克隆進(jìn)質(zhì)粒pShuttle (Clontech)的GFP (綠色熒光蛋白)表達(dá)盒用限制性酶1-CeuI和P1-SceI切開，并連接進(jìn)用相同的酶消化的pSV25(或者此處所述的另一種Ad黑猩猩質(zhì)粒)中。將所產(chǎn)生的質(zhì)粒(PSV25GFP)用SwaI消化以分離細(xì)菌質(zhì)粒骨架，并轉(zhuǎn)染進(jìn)El互補(bǔ)細(xì)胞系HEK 293。大約10天后，觀察到細(xì)胞病理效應(yīng)，表明復(fù)制型病毒的存在。表達(dá)GFP的基于Ad SV25的腺病毒載體的成功生成是通過將來自轉(zhuǎn)染培養(yǎng)物的上清應(yīng)用于新鮮細(xì)胞培養(yǎng)物而被證實(shí)的。第二次被感染的細(xì)胞的存在是通過觀察細(xì)胞群體中的綠色熒光來確定的。2.E3缺失的Pan-6和Pan_7載體的構(gòu)建為增強(qiáng)所述腺病毒載體的克隆容量，可以使E3缺失，因?yàn)榇藚^(qū)域編碼了對(duì)于培養(yǎng)中的病毒的繁殖所不需要的基因。為此，E3-缺失版本的Pan-5、Pan-6, Pan-7和C68已被制成。(含E31-9的3.5kb Nru-AvrII片段被缺失)。Pan6基載體中的E3缺失El-缺失的pPan6_pkGFP分子克隆用SbfI和Not I消化以分離19.3kb的片段并在Sbf I位點(diǎn)上連接回去。所產(chǎn)生的構(gòu)建物pPan6-Sbf 1-E3用Eco 47III和Swa I處理，生成pPan6-E3。最后，來自pPan6_pkGFP的Sbf I消化的21kb Sbf I片段被亞克隆進(jìn)pPan6-E3 以生成帶有 E3 的 4kb 缺失的 pPan6_E3_pkGFP。E3缺失的Pan7載體相同的策略被用于獲得Pan 7中的E3缺失。首先，將跨越E3區(qū)的5.8kb Avr II片段亞克隆入pSL-1180中，隨后通過Nru I消化使E3缺失。將產(chǎn)生的質(zhì)粒用Spe I和AvrII處理以獲得4.4kb的片段并將其在Avr II位點(diǎn)克隆進(jìn)pPan7_pkGFP以分別替換出原來的含E3的Avr II片段。最終的pPan7_E3-pkGFP構(gòu)建物含有3.5kb的E3-缺失。對(duì)于這些以及其它Pan腺病毒血清型中El、E3和E4缺失的構(gòu)建過程的完整描述在W003/0046124中給出。進(jìn)一步的信息也可以在Human Gene Therapy 15:519-530 (W003/046124)中獲得。實(shí)施例2Gag、RT、Nef 序列的構(gòu)建在W003/025003中全文描述。質(zhì)粒p73i_Tgrn1.質(zhì)粒:？73卜6尺吧克隆#19( 17/ 24(0 0/1 1'(0 0廿他0-修復(fù)型感興趣的基因:來自HIV-1分化枝B株系HXB2的密碼子優(yōu)化的Gag的pl7/p24部分、密碼子優(yōu)化的RT和截短的Nef基因,位于1wa長(zhǎng)HCMV啟動(dòng)子(1wa length HCMV promoter) +外顯子I的下游，并位于兔β_珠蛋白多聚腺苷酸化信號(hào)的上游。含有來源于質(zhì)粒P 17/24trNefl的trNef基因的質(zhì)粒包含PCR錯(cuò)誤，其使得Nef末端的19個(gè)氨基酸發(fā)生R到H的氨基酸變化。這是由PCR誘變加以糾正的，糾正后的NefPCR被粘合至來自P7077-RT3的密碼子優(yōu)化的RT，該粘合片段用ApaI和BamHI切開，并被克隆入 Apal/BamHI 切開的 p7 3i_GRN。引物:PCR coRT 來自 p7077_RT3，使用引物:(聚合酶=PWO(Roche)始終。正義:U1GAATTCGCGGCCGCGATGGGCCCCATCAGTCCCATCGAGACCGTGCCGGTGAAGCTGAAACCCGGGATAScoRT-NefGGTGTGACTGGAAAACCCACCATCAGCACCTTTCTAATCCCCGC循環(huán):％°C(30 秒)，然后 2O 個(gè)循環(huán) (30 秒)、55°C (30 秒)、72°C (180 秒)，然后72 °C (120秒)并保持在4°C。1.7kb PCR產(chǎn)物經(jīng)過凝膠純化。PCR 5' Nef 來自 pl7/24trNefl，使用引物:正義:S-NefATGGTGGGTTTTCCAGTCACACC反義:ASNef-G:GATGAAATGCTAGGCGGCTGTCAAACCTC循環(huán):95°C(30 秒)，然后 15 個(gè)循環(huán) 95°C (30 秒)、55°C (30 秒)、72°C (60 秒)，然后72 °C (120秒)并保持在4°C。PCR 3' Nef 來自 P 17/24trNefl，使用引物:正義:SNEF-G
GAGGTTTGACAGCCGCCTAGCATTTCATC反義:AStrNef (反義)CGCGGATCCTCAGCAGTTCTTGAAGTACTCC
循環(huán):95°C(30 秒)，然后 15 個(gè)循環(huán) 95 °C (30 秒)、55°C (30 秒)、72°C (60 秒)，然后72 °C (120秒)并保持在4°C。該P(yáng)CR產(chǎn)物經(jīng)過凝膠純化。最初用5' (S-Nef)和3' (AstrNef)引物將兩條Nef產(chǎn)物粘合。循環(huán):95°C(30 秒)，然后 15 個(gè)循環(huán) 95 °C (30 秒)、55°C (30 秒)、72°C (60 秒)，然后72°C (180秒)并保持在4°C。該P(yáng)CR產(chǎn)物被PCR清潔，并使用Ul和AstrNef引物將其粘合至所述RT產(chǎn)物:循環(huán):95°C(30 秒)，然后 20 個(gè)循環(huán) 95°C (30 秒)、55°C (30 秒)、72°C (180 秒)，然后72°C (180秒)并保持在4°C。2.1kb產(chǎn)物經(jīng)過凝膠純化，并用ApaI和BamHI切開。質(zhì)粒p73I_GRN同樣用ApaI和BamHI切開,凝膠純化，并與Apa1-BamRT3trNef連接以重新生成p 17/p24 (opt) /RT (opt)trNef基因。2.質(zhì)粒:p731-RT w229k(失活的 RT)感興趣的基因:生成失活的RT基因，位于1wa長(zhǎng)HCMV啟動(dòng)子+外顯子I的下游，并位于兔β-珠蛋白多聚腺苷酸化信號(hào)的上游。由于對(duì)活性HIV RT種類在治療性疫苗方面的使用的顧慮，該基因的失活是令人期望的。這是通過該RT (來源于P731-GRN2)氨基酸位置229由Trp至Lys (R7271pl_28)的PCR誘變而獲得的。引物:PCR 5' RT+突變，使用引物:(聚合酶=PWO(Roche)始終)正義:RT3_u:lGAAT TCGCGGCCGCGATGGGCCCCATCAGTCCCATCGAGACCGTGCCGGTGAAGCTGAAACCCGGGAT反義:AScoRT-Trp229LysGGAGCTCGTAGCCCATCTTCAGGAATGGCGGCTCCTTCT循環(huán):1χ[94. (30 秒)]15x[94°C (30 秒)/55°C (30 秒)/72°C (60 秒)]Ix[72。。(180 秒)]PCR凝膠純化PCR 3' RT+突變，使用引物:反義:RT3_1:1GAATTCGGATCCTTACAGCACCTTTCTAATCCCCGCACTCACCAGCTTGTCGAC
CTGCTCGTTGCCGC反義:ScoRT_Trp229LysCCTGAAGATGGGCTACGAGCTCCATG循環(huán):Ix[94°C (30 秒)]15x[94°C (30 秒)/55°C (30 秒)/72°C (60 秒)]Ix[72。。(180 秒)]PCR凝膠純化將該P(yáng)CR產(chǎn)物凝膠純化，并用5' (RT3-U1)和3' (RT3-L1)引物粘合RT的5'和 末端。循環(huán):1χ[94. (30 秒)]15x[94°C (30 秒)/55°C (30 秒)/72°C (120 秒)]Ix[72。。(180 秒)]將此PCR產(chǎn)物凝膠純化，并使用NotI和BamHI限制性位點(diǎn)將其克隆進(jìn)p7313ie中，以生成P731-RT w229k。(參見

圖13)3.質(zhì)粒:p731-Tgrn感興趣的基因:來自HIV-1分化枝B株系HXB2的密碼子優(yōu)化的Gag的p 17/p24部分、密碼子優(yōu)化的RT和截短的Nef基因，位于Icwa長(zhǎng)HCMV啟動(dòng)子+外顯子I的下游，并位于兔β -珠蛋白多聚腺苷酸化信號(hào)的上游。含有活性形式RT的三重融合構(gòu)建物可能無法被管理當(dāng)局所接受用于人類用途，因此RT的失活是通過將來自p731-RT w229k的NheI和ApaI切割片段插入Nhel/Apal切割的p731-GRN2#19 (圖14)而獲得的。這導(dǎo)致在RT的位置229上的W — K的改變。Tgrn質(zhì)粒插入片段的全序列在圖7中表示。這包含了 pl7p24 (opt)Gag、p66RT (opt并失活)以及截短的Nef?？蛇x的Gag、RT和Nef構(gòu)建物如下:trNef-p66RT (opt) -p 17, p24 (opt)Gag,trNef-p 17, p24 (opt)Gag-p66RT (opt),p66RT (opt) -pl7, p24 (opt)Gag-trNef,p66RT(opt)-trNef-p 17, p24 (opt)Gag,p 17, p24(opt)Gag-trNef_p66RT(opt)。這些構(gòu)建物的全序列分別在圖8至12中提供。實(shí)施例3
Gag、RT、Nef序列插入腺病毒。將GRN表達(dá)盒亞克隆入pShuttle質(zhì)粒。通過Sph I和EcoR I雙重消化，將由啟動(dòng)子、cDNA和多聚腺苷酸化信號(hào)構(gòu)成的完整的表達(dá)盒從ρΤ-GRN構(gòu)建物分離出來。Sph I/EcoR I片段的Sph I末端用Klenow填平，并被克隆進(jìn)pShuttle質(zhì)粒的EcoR I和Mlu I位點(diǎn),其中Mlu I末端是平端。
在克隆過程中，一個(gè)額外的側(cè)翼序列變得與HIV表達(dá)盒相關(guān)聯(lián)。此序列已知為Cer序列，并且不具有已知的功能。將GRN表達(dá)盒轉(zhuǎn)移入Pan6和Pan7載體的E1/E3-缺失的分子克隆。通過1-Ceu I和P1-Sce I消化,從pShuttle回收該表達(dá)盒,并將其克隆進(jìn)Pan6和Pan7載體分子克隆的相同位點(diǎn)。重組克隆經(jīng)綠/白篩選鑒定并通過大量限制性酶分析加以證實(shí)。重組病毒的營(yíng)救與繁殖。C6和C7載體的分子克隆用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶(分別為PmeI和PacI)處理以釋放出完整的線性載體基因組，并用磷酸鈣法轉(zhuǎn)染進(jìn)293細(xì)胞。當(dāng)觀察到轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的全部細(xì)胞病理效應(yīng)時(shí)，收獲粗制病毒裂解液并逐漸擴(kuò)大至293細(xì)胞的大規(guī)模感染(1χ10θ9個(gè)細(xì)胞)。通過標(biāo)準(zhǔn)的CsCl沉淀法純化來自大規(guī)模感染物的病毒。此外,pShuttle質(zhì)?？梢酝ㄟ^用EcoRI和XmnI切割而被進(jìn)一步修剪以去除3'接頭序列并減少該質(zhì)粒大小以制成pShuttleGRNc。使用上述方法,此修飾的質(zhì)粒可以被用于生成額外的Pan7病毒(C7-GRNc)。其它構(gòu)建物類似地插入Pan 6和Pan 7腺病毒。不過帶有p66RT (opt)-trNef-p17, p24(opt)Gag插入片段的Pan 6未被成功制備。實(shí)施例4 小鼠免疫原性模型一系列含有重排的HIV抗原RT、Nef和Gag (RGN、NRG、NGR、GRN和GNR)插入片段的Pan6和Pan7載體被檢測(cè)了其體內(nèi)初級(jí)免疫反應(yīng)。進(jìn)行了三組實(shí)驗(yàn)以檢測(cè)Pan6病毒，進(jìn)行了兩組實(shí)驗(yàn)以檢測(cè)Pan7病毒。每種腺病毒按50 μ I體積IxlO8個(gè)粒子的劑量，肌內(nèi)施用于Balb/c(K2d)小鼠的單個(gè)后肢。由于此劑量先前已被表明能誘導(dǎo)優(yōu)良水平的細(xì)胞免疫反應(yīng)(未公開)而被選用。表I概括了在這些實(shí)驗(yàn)中比較的腺病毒。表I
權(quán)利要求
1.一種腺病毒載體，包括編碼至少Hiv抗原RT、Nef和Gag或者它們的免疫原性片段的一種或多種多核苷酸，所述多核苷酸被如此安排以便使它們按照Gag、RT、Nef的順序被轉(zhuǎn)錄，其特征在于所述病毒是El和/或E3缺失的Pan6或Pan7腺病毒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腺病毒載體，其中所述RT是被截短的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腺病毒載體，其中所述Nef是被截短的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的腺病毒載體，其中所述Gag只是pl7和p24。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的腺病毒載體，其中所述的一種或多種HIV多核苷酸的大小使得所述載體的總體大小為所述病毒大小的90至100%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的腺病毒載體，其中編碼所述HIV抗原的多核苷酸序列被安排為融合形式。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腺病毒載體，包括下列多核苷酸構(gòu)建物: P17，p24 (密碼子經(jīng)優(yōu)化)Gag-p66RT (密碼子經(jīng)優(yōu)化)-截短的Nef。
8.一種免疫原性組合物，包括權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的病毒載體和藥學(xué)上可接受的載體或佐劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至 7任一項(xiàng)所述的腺病毒載體的用途，其被用于制備治療或預(yù)防HIV感染的藥物。
10.備權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)所述的載體的方法，包括步驟: a)提供腺病毒載體； b)提供攜帶所述HIV抗原序列的質(zhì)粒，所述序列可操作地連接于合適的啟動(dòng)子； c)用所述質(zhì)粒和所述載體一起轉(zhuǎn)染細(xì)胞； d)給予充足的時(shí)間使重組發(fā)生；以及 e)回收攜帶所述HIV抗原序列的重組病毒載體。
11.根據(jù)權(quán)利要求8的免疫原性組合物在制備用于在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生免疫反應(yīng)的藥物中用途。
12.按權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)所述的載體表達(dá)的融合蛋白。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的融合蛋白，其在人體內(nèi)產(chǎn)生。
全文摘要
本發(fā)明涉及病毒載體，其包括編碼HIV多肽的寡核苷酸，更具體地，其中所述病毒是腺病毒。具體而言，此類腺病毒是非人類的靈長(zhǎng)類動(dòng)物腺病毒，諸如猿猴腺病毒，更具體地，黑猩猩腺病毒。具體而言，本發(fā)明涉及腺病毒載體，其包括編碼多種不同HIV抗原的HIV多核苷酸序列，例如兩種或三種或者更多種的HIV抗原。本發(fā)明進(jìn)一步涉及制備所述病毒載體的方法，涉及由此方法制備的病毒載體，并涉及所述載體在醫(yī)藥，尤其是在預(yù)防性或治療性疫苗接種方面的用途。
文檔編號(hào)C12N15/66GK103088060SQ20131000234
公開日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2006年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月12日
發(fā)明者P.F.埃爾特爾, J.P.蒂特, C.A.范維利 申請(qǐng)人:葛蘭素集團(tuán)有限公司