專利名稱：用于確定柳枝稷生態(tài)型的srap特異性分子標(biāo)記引物及柳枝稷生態(tài)型檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及用于確定柳枝稷生態(tài)型的SRAP特異性分子標(biāo)記引物及柳枝稷生態(tài)型檢測方法。
背景技術(shù)：
隨著人類社會的發(fā)展，能源需求逐年增加。同時，消費(fèi)礦物燃料所導(dǎo)致的大氣污染、全球氣候變暖等一系列的環(huán)境問題日益嚴(yán)重，所以人類迫切需求可再生清潔能源。生物質(zhì)能源是可再生能源，具有可貯藏性及連續(xù)轉(zhuǎn)化的特征，成為最有前景的替代能源。
柳枝稷(Panicumvirgatum)為禾本科(Gramineae)黍?qū)?Panicum)多年生暖季型叢生禾草，具有適應(yīng)性強(qiáng)，較高的產(chǎn)量潛力和較強(qiáng)的耐旱耐脊能力等特點(diǎn)，對環(huán)境友好。 柳枝稷是一種C4植物，生產(chǎn)力高，根系發(fā)達(dá)，耐瘠薄、洪澇和干旱，能夠抵抗多種病蟲害，易于收割貯存。柳枝稷作為能源草，其細(xì)胞壁可被消化為糖類并隨之發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇，成本低。此外，利用柳枝稷生產(chǎn)清潔能源可獲得顯著能量回報(bào)，大幅減少排放到大氣中的碳，研究者普遍認(rèn)為柳枝稷是目前最理想的生物燃料作物之一。
但是，柳枝稷在長期的進(jìn)化過程中，形 成了許多生態(tài)型和變種，主要的兩種生態(tài)型為高地生態(tài)型，主要分布在美國中部和北部地區(qū)，適應(yīng)干旱環(huán)境，莖桿較細(xì)，分枝多，在半干旱環(huán)境中生長良好；低地生態(tài)型，主要分布于潮濕地帶，諸如漫灘、平原，植株高大，莖桿粗壯，成束生長。據(jù)報(bào)道低地生態(tài)型品種都是四倍體，高地生態(tài)型品種多為四倍體或八倍體。低地型柳枝稷比高地型柳枝稷更高大，兩種生態(tài)型在光合作用、抗旱性及對水分和氮的有效利用率方面存在差異。
從性狀上看，低地型柳枝稷更適合被開發(fā)為生物燃料乙醇的能源植物；而高地型在抗寒性方面表現(xiàn)好于低地型。因此，柳枝稷生態(tài)型類別的鑒定工作極為重要。
然而，對于柳枝稷的生態(tài)型類別的鑒定通常采用的方法是等待植株成熟之后進(jìn)行形態(tài)觀察，但這種方法須觀察植株外形，如植物的根、莖及分枝情況等，且必須等到植株長至一定大小。其鑒定周期長，種植成本高；再者，植株的許多形態(tài)學(xué)特征往往隨著生長條件的不同而發(fā)生變化；而且許多鑒別特征不具有較強(qiáng)的特殊性，導(dǎo)致分類困難，且存在較大的人為操作誤差，所需要的周期較長，且存在較大的系統(tǒng)誤差。
隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，特別是分子標(biāo)記和基因標(biāo)記技術(shù)的建立和成熟，為發(fā)展簡便、快速、準(zhǔn)確的種質(zhì)鑒定技術(shù)提供了有效手段。SRAP即相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性 (Sequence related amplified polymorphism),是一種新型的基于 PCR 的分子標(biāo)記方法， 也稱基于序列擴(kuò)增多態(tài)性(Sequence based amplif iedpolymorphism, SBAP)。該標(biāo)記方法通過獨(dú)特的雙引物設(shè)計(jì)對基因的ORFs (Open reading frames)的特定區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增上游引物長17bp，對外顯子區(qū)域進(jìn)行特異擴(kuò)增，下游引物長18bp，對內(nèi)含子區(qū)域、啟動子區(qū)域進(jìn)行特異擴(kuò)增。因不同個體以及物種的內(nèi)含子、啟動子與間隔區(qū)長度不同而產(chǎn)生多態(tài)性。該標(biāo)記具有簡便、高效、產(chǎn)率高、重復(fù)性好、易測序、便于克隆目標(biāo)片段等特點(diǎn)，目前已成功地應(yīng)用于作物遺傳多樣性分析、遺傳圖譜的構(gòu)建、重要性狀的標(biāo)記以及相關(guān)基因的克隆等方面。 但是，目前尚無關(guān)于柳枝稷的SRAP標(biāo)記研究的報(bào)道。發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種用于確定柳枝稷生態(tài)型的SRAP 特異性分子標(biāo)記引物及柳枝稷生態(tài)型檢測方法，利用高地型柳枝稷中所特有的特異性標(biāo)記實(shí)現(xiàn)柳枝稷生態(tài)型的早期鑒定。
本發(fā)明提供了一種SRAP引物組，由具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的下游引物組成。
本發(fā)明還提供了具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO: 2所示核苷酸序列的下游引物組成的引物組在鑒定柳枝稷生態(tài)型中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了由具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的下游引物組成的SRAP引物組在鑒定柳枝稷生態(tài)型中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供的引物在進(jìn)行柳枝稷生態(tài)型鑒定中具有良好的準(zhǔn)確性。SRAP技術(shù)最早在蕓薹屬作物中開發(fā)出來，目前尚無關(guān)于柳枝稷的SRAP標(biāo)記研究的報(bào)道。本發(fā)明采用SRAP 技術(shù)對柳枝稷的生態(tài)型進(jìn)行鑒定，可實(shí)現(xiàn)柳枝稷生態(tài)型的早期鑒定，提高檢測效率，排除傳統(tǒng)鑒定方法中不確定的人為因素對鑒定結(jié)果的影響。
另外，本發(fā)明提供了一種柳枝稷生 態(tài)型檢測試劑盒，其包括Taq酶和用于柳枝稷生態(tài)型鑒定的SRAP引物組；
其中，用于柳枝稷生態(tài)型鑒定的SRAP引物組包括具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的下游引物。
優(yōu)選地，柳枝稷生態(tài)型檢測試劑盒中的Taq酶采用GoTaq酶。
優(yōu)選地，柳枝稷生態(tài)型檢測試劑盒中還包括303bp的分子量標(biāo)記。
本發(fā)明還提供了一種鑒定柳枝稷生態(tài)型的特異性分子標(biāo)記，具有如SEQ ID N03 所示的核苷酸序列。
本發(fā)明還提供了一種柳枝稷生態(tài)型的檢測方法，該方法包括以下步驟
步驟1:用具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ IDNO :2所示核苷酸序列的下游引物對柳枝稷基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；
步驟2 :取擴(kuò)增產(chǎn)物電泳，根據(jù)電泳的結(jié)果鑒定柳枝稷的生態(tài)型；若擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果中呈現(xiàn)303bp的特異性條帶，則所測柳枝稷為高地型；若擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果中未呈現(xiàn)303bp的特異性條帶，則所測柳枝稷為低地型。
其中，303bp的特異性條帶的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。
該序列即為柳枝稷生態(tài)型的特異性標(biāo)記，該特異性分子標(biāo)記在所有高地型材料中出現(xiàn)而不在低地型材料中出現(xiàn)，對該序列進(jìn)行序列分析結(jié)果表明，該序列不能翻譯成氨基酸序列。
優(yōu)選地，柳枝稷生態(tài)型的檢測方法中的擴(kuò)增所采用的程序?yàn)?br> 94°C 預(yù)變性 5min ；
94°C變性 Imin，35O 復(fù)性 lmin，72°C延伸 lmin，共 5 個循環(huán)；
94°C 變性 Imin，50 O 復(fù)性 lmin，72°C 延伸 Imin，共 35 個循環(huán)；
72O延伸 IOmin。
優(yōu)選地，柳枝稷生態(tài)型的檢測方法中的擴(kuò)增所采用的體系包括柳枝稷基因組 DNA、Taq酶、具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的上游引物、具有SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的下游引物、dNTPs、MgCl2、滅菌水。
更優(yōu)選地，Taq酶采用GoTaq酶；最優(yōu)選地，Taq酶采用購自Promega公司的2XGoTaq Green Master Mix 預(yù)混 Taq 酶。
更優(yōu)選地，取滅菌水將具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的上游引物溶解為溶液， 使其終濃度以摩爾濃度計(jì)為 ο μ mol/L ;取滅菌水將具有SEQ ID NO 2所示核苷酸序列的下游引物溶解為溶液，使其終濃度以摩爾濃度計(jì)為10 μ mol/L。
更優(yōu)選地，柳枝稷基因組DNA溶解于滅菌水中，質(zhì)量-體積濃度為20ng/ μ L。
最優(yōu)選地，柳枝稷生態(tài)型的檢測方法中的擴(kuò)增所采用的體系包括
柳枝稷基因組DNA溶液2 μ L ;
2 X GoTaq Green Master Mix10 μ L ；
具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的上游引物溶液 IyL;
具有SEQ ID NO 2所示核苷酸序列的下游引物溶液 IyL;
滅菌水6 μ L ;
另外，在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，對擴(kuò)增產(chǎn)物電泳的介質(zhì)采用瓊脂糖凝膠。
優(yōu)選地，瓊脂糖凝膠中的瓊脂糖的含量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)為2%。
本發(fā)明提供了用于確定柳枝稷生態(tài)型的SRAP特異性分子標(biāo)記引物及柳枝稷生態(tài)型檢測方法，本發(fā)明提供的SRAP引物組由具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的下游引物組成。采用本發(fā)明提供的引物及利用SRAP 技術(shù)，則可以利用植物組織準(zhǔn)確的對柳枝稷的生態(tài)型進(jìn)行鑒定，從而實(shí)現(xiàn)柳枝稷生態(tài)型的早期鑒定。而且，這種鑒定方法操作簡單，周期短，對柳枝稷生態(tài)型的鑒定非?？旖轀?zhǔn)確，提高了檢測效率，且避免了傳統(tǒng)方法中不確定的人為因素對鑒定結(jié)果的影響。實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明提供的引物用于柳枝稷生態(tài)型鑒定的準(zhǔn)確度可達(dá)到100%。


圖1示SRAP特異性分子標(biāo)記鑒定結(jié)果，其中泳道f 12為低地型柳枝稷的SRAP特異性分子標(biāo)記鑒定結(jié)果，泳道13 24為高地型柳枝稷的SRAP特異性分子標(biāo)記鑒定結(jié)果，泳道25為DNA分子量標(biāo)記。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明提供了一種用于確定柳枝稷生態(tài)型的SRAP特異性分子標(biāo)記引物及柳枝稷生態(tài)型檢測方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
本發(fā)明提供了一種SRAP引物組，由具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的下游引物組成。
本發(fā)明還提供了具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO: 2所示核苷酸序列的下游引物組成的引物組在鑒定柳枝稷生態(tài)型中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了由具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的下游引物組成的SRAP引物組在鑒定柳枝稷生態(tài)型中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供的引物組中，上游引物長17bp，下游引物長18bp，在對柳枝稷的生態(tài)型進(jìn)行鑒定時，能夠表現(xiàn)出良好的準(zhǔn)確性。從而達(dá)到在柳枝稷生長發(fā)育早期對其生態(tài)型進(jìn)行鑒定的目的。
另外，本發(fā)明提供了一種柳枝稷生態(tài)型檢測試劑盒，其包括Taq酶和用于柳枝稷生態(tài)型鑒定的SRAP引物組；
其中，用于柳枝稷生態(tài)型鑒定的SRAP引物組包括具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的下游引物。
為了達(dá)到更好的擴(kuò)增效果，柳枝稷生態(tài)型檢測試劑盒中的Taq酶采用GoTaq酶。
為方便使用，柳枝稷生態(tài)型檢測試劑盒中還包括303bp的分子量標(biāo)記。
本發(fā)明還提供了一種鑒定柳枝稷生態(tài)型的特異性分子標(biāo)記，具有如SEQ ID NO 3 所示的核苷酸序列。
本發(fā)明還提供了一種柳枝稷生態(tài)型的檢測方法，該方法包括以下步驟首先，用具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的下游引物對柳枝稷基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；然后，取擴(kuò)增產(chǎn)物電泳，根據(jù)電泳的結(jié)果鑒定柳枝稷的生態(tài)型；擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果中若呈現(xiàn)303bp的特異性條帶，則柳枝稷為高地型；若擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果中未呈現(xiàn)303bp的特異性條帶，則柳枝稷為低地型。
其中，303bp的特異性條帶的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。
該序列即為柳枝稷生態(tài)型的特異性標(biāo)記，該特異性分子標(biāo)記在所有高地型材料中出現(xiàn)而不在低地型材料出現(xiàn)，對該序列進(jìn)行序列分析表明，該序列不能翻譯成氨基酸序列。
為使擴(kuò)增效果更佳，柳枝稷生態(tài)型的檢測方法中的擴(kuò)增所采用的程序?yàn)?br> 94°C 預(yù)變性 5min ；
94°C變性 Imin，35O 復(fù)性 lmin，72°C延伸 lmin，共 5 個循環(huán)；
94°C變性 lmin,50°C復(fù)性 lmin, 72。。延伸 lmin,共 35 個循環(huán)；
72O延伸 IOmin。
為達(dá)到更好的擴(kuò)增效果，柳枝稷生態(tài)型的檢測方法中的擴(kuò)增所采用的體系包括 柳枝稷基因組DNA、Taq酶、具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的上游引物、具有SEQ ID NO: 2所示核苷酸序列的下游引物、dNTPs、MgCl2、滅菌水。
為提高擴(kuò)增效率，Taq酶采用GoTaq酶；為進(jìn)一步提高擴(kuò)增效率，Taq酶采用購自 Promega 公司的 2XGoTaq Green Master Mix 預(yù)混 Taq 酶。
為方便使用，取滅菌水將具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的上游引物溶解為溶液，使其終濃度以摩爾濃度計(jì)為 ο μ mol/L ;取滅菌水將具有SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的下游引物溶解為溶液，使其終濃度以摩爾濃度計(jì)為IO μ mo I /L。
為方便使用，柳枝稷基因組DNA溶解于滅 菌水中，質(zhì)量-體積濃度為20ng/yL。
為達(dá)到最佳的擴(kuò)增效果，柳枝稷生態(tài)型的檢測方法中的擴(kuò)增所采用的體系包括
柳枝稷基因組DNA溶液2 μ L ;
2 X GoTaq Green Master Mix10 μ L ；
具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的上游引物溶液IyL;
具有SEQ ID NO 2所示核苷酸序列的下游引物溶液IyL;
滅菌水6 μ L ;
在本發(fā)明的實(shí)施例中，柳枝稷基因組DNA溶液的中柳枝稷基因組DNA的質(zhì)量-體積濃度為20ι^/μ ;具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的上游引物溶液和具有SEQ ID NO: 2所示核苷酸序列的下游引物溶液的濃度皆為10 μ mol/L。
另外，在本發(fā)明的實(shí)施例中，對擴(kuò)增產(chǎn)物電泳的介質(zhì)采用瓊脂糖凝膠。
瓊脂糖凝膠電泳中采用的瓊脂糖凝膠中的瓊脂糖的含量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)為2%。
瓊脂糖凝膠電泳中采用的染料為溴乙錠。
瓊脂糖凝膠電泳中采用的電泳緩沖液為Tris-硼酸緩沖液。
本發(fā)明提供了用于確定柳枝稷生態(tài)型的SRAP特異性分子標(biāo)記引物及柳枝稷生態(tài)型檢測方法，本發(fā)明提供的SRAP引物組由具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的下游引物組成。采用本發(fā)明提供的引物及利用SRAP 技術(shù) ，則可以利用植物組織準(zhǔn)確的對柳枝稷的生態(tài)型進(jìn)行鑒定，從而實(shí)現(xiàn)柳枝稷生態(tài)型的早期鑒定。而且，這種鑒定方法操作簡單、周期短，對柳枝稷生態(tài)型的鑒定非?？旖轀?zhǔn)確。提高了檢測效率，且避免了傳統(tǒng)方法中不確定人為因素對鑒定結(jié)果的影響，實(shí)踐表明，本發(fā)明提供的引物用于柳枝稷生態(tài)型鑒定的準(zhǔn)確度可達(dá)到100%。
本發(fā)明采用的藥品、試劑皆為市售品，皆可于市場購得。
下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明
實(shí)施例1柳枝稷生態(tài)型的SRAP特異性分子標(biāo)記鑒定
收集柳枝稷種質(zhì)資源共計(jì)24份，并種植大田，待到成熟期根據(jù)柳枝稷植株成熟時的形態(tài)學(xué)特征，對柳枝稷的生態(tài)型進(jìn)行鑒定。鑒定結(jié)果表明，收集到的種質(zhì)資源中，高地形資源12份，低地型資源12份。
對待鑒定的植株，每份種質(zhì)隨機(jī)選取12個單株的幼嫩葉片剪碎，用于柳枝稷生態(tài)型的鑒定。
首先，采用植物基因組DNA提取試劑盒提取柳枝稷基因組DNA。提取的DNA用O. 8% 的瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)進(jìn)行純度和濃度的檢測，并根據(jù)檢測結(jié)果將樣品稀釋成20ng/y L，在4°C下保存?zhèn)溆谩?br> 將SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物和SEQ ID NO: 2所示核苷酸序列的下游引物分別稀釋，至濃度為IOpmol/μ L。具體操作方法為取2(^1^濃度為20(^11101/^1^的引物原液，加入新的1.5mL離心管內(nèi)；再加入380 μ L無菌水，充分混勻。
然后，分別配制24份種質(zhì)資源的SRAP-PCR的反應(yīng)體系，每個種質(zhì)資源的反應(yīng)體系中各組分的量為
該種質(zhì)資源柳枝稷基因組DNA溶液2 μ L ;
2 X GoTaq Green Master Mix10 μ L ；
具有SEQ ID NO 1所示核苷酸序列的上游引物溶液I μ L ;
具有SEQ ID NO 2所示核苷酸序列的下游引物溶液I μ L ;
滅菌水6 μ L ；
每個SRAP-PCR反應(yīng)體系為20 μ L，共計(jì)24個反應(yīng)體系。
將配制好的24個反應(yīng)體系依次加入96孔PCR板上，每孔20 μ L體系，振蕩PCR板，使各組分充分混勻，然后低速短暫離心^fPCR板放到PCR儀器中，設(shè)定程序進(jìn)行擴(kuò)增；
SRAP-PCR反應(yīng)程序?yàn)?br> 94°C預(yù)變性5min ；
94°C變性lmin ；
35°C復(fù)性lmin ；
72°C延伸lmin ；
共5個循環(huán)；
94°C變性lmin ；
50°C復(fù)性lmin ；
72°C延伸lmin ；
共35個循環(huán)；
最后72°C延伸IOmin0
將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，具體為采用2. 0%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，用終濃度為O. lmg/mL的溴化乙錠(EB)對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行染色，120V電壓(5V/cm)在 O. 5XTBE緩沖液中電泳約1. 5h，電泳結(jié)束后凝膠在凝膠成像系統(tǒng)(Bio-rad)中照相并保存。
電泳結(jié)果如圖1所示，對電泳結(jié)果進(jìn)行分析。如果出現(xiàn)303bp的特異性條帶則為高地型，如果不出現(xiàn)此條帶則為低地型。分析結(jié)果表明，24份種質(zhì)資源中，12份高地形種質(zhì)中皆出現(xiàn)303bp的特異性條帶，12份低地型種質(zhì)中皆不出現(xiàn)303bp的特異性條帶。SRAP特異性分子標(biāo)記鑒定結(jié)果與傳統(tǒng)方法鑒定結(jié)果完全吻合，準(zhǔn)確率可達(dá)到100%。
實(shí)施例2柳枝稷生態(tài)型鑒定試劑盒用于鑒定柳枝稷生態(tài)型
采用本發(fā)明提供的柳枝稷生態(tài)型檢測試劑盒鑒定柳枝稷生態(tài)型，試劑盒中包括 2XGoTaq Green Master Mix預(yù)混Taq酶、用于柳枝稷生態(tài)型鑒定的SRAP引物組和303bp 的分子量標(biāo)記。其中，303bp的分子量標(biāo)記具有SEQ ID NO: 3所不核苷酸序列，引物組由具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO: 2所示核苷酸序列的下游引物組成，將上下游引物分別稀釋至濃度為IOpmol/ μ L，依次命名為A液、B液，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> 采用植物基因組DNA提取試劑盒提取待鑒定柳枝稷的基因組DNA。將提取的DNA 用O. 8%的瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)進(jìn)行純度和濃度的檢測，并根據(jù)檢測結(jié)果將樣品稀釋成20ng/ μ L,在4 C下保存?zhèn)溆谩?br> 取試劑盒中的Taq酶，配制反應(yīng)體系，體系中各組分的量為
待測柳枝稷基因組DNA溶液 2 μ L ;
試劑盒中的Taq酶IOyL;
A 液IyL;
B 液IyL;
滅菌水6yL;
反應(yīng)體系為20 μ L0
將配制好的反應(yīng)體系加入PCR板上，每孔20 μ L體系，振蕩PCR板，使各組分充分混勻，然后低速短暫離心^fPCR板放到PCR儀器中，設(shè)定程序進(jìn)行擴(kuò)增；
反應(yīng)程序?yàn)?br> 94°C預(yù)變性5min ；
94°C變性lmin ；
35°C復(fù)性lmin ；
72°C延伸lmin ；
共5個循環(huán)；
94°C變性lmin ；
50°C復(fù)性lmin ；
72°C延伸lmin ；
共35個循環(huán)；
最后72°C延伸10min。
將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，具體為采用2. 0%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，用終濃度為O. lmg/mL的溴化乙錠(EB)對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行染色，將擴(kuò)增產(chǎn)物上樣于瓊脂糖凝膠，在一個新的點(diǎn)樣孔加入試劑盒中提供的303bp的分子標(biāo)記，120V電壓(5V/cm)在 O. 5XTBE緩沖液中電泳約1. 5h，電泳結(jié)束后凝膠在凝膠成像系統(tǒng)(Bio-rad)中照相并保存。
對電泳結(jié)果進(jìn)行分析，如果待鑒定 柳枝稷的基因組擴(kuò)增產(chǎn)物泳道出現(xiàn)具有SEQ ID 勵:3所示核苷酸序列的3036 的特異性條帶則為高地型；如果待鑒定柳枝稷的基因組擴(kuò)增產(chǎn)物泳道不出現(xiàn)具有SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的303bp的特異性條帶則為低地型。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種SRAP引物組，其特征在于，由具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的下游引物組成。
2.如權(quán)利要求1所述的SRAP引物組在鑒定柳枝稷生態(tài)型中的應(yīng)用。
3.一種柳枝稷生態(tài)型檢測試劑盒，其特征在于，其包括Taq酶和用于柳枝稷生態(tài)型鑒定的SRAP引物組；其中，所述用于柳枝稷生態(tài)型鑒定的SRAP引物組包括具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的下游引物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的柳枝稷生態(tài)型檢測試劑盒，其特征在于，所述Taq酶為GoTaq酶。
5.一種鑒定柳枝稷生態(tài)型的特異性分子標(biāo)記，其特征在于，具有如SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列。
6.一種柳枝稷生態(tài)型的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟步驟1:用具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO 2所示核苷酸序列的下游引物對柳枝稷基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；步驟2 :取所述擴(kuò)增產(chǎn)物電泳，根據(jù)所述電泳的結(jié)果鑒定所述柳枝稷的生態(tài)型；所述擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果中呈現(xiàn)303bp的特異性條帶，所述柳枝稷為高地型；所述擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果中不呈現(xiàn)303bp的特異性條帶，所述柳枝稷為低地型；其中，所述303bp的特異性條帶的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟I中所述擴(kuò)增的程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min ；94°C變性Imin，35O復(fù)性lmin，72°C延伸lmin，共5個循環(huán)；94°C變性Imin，50 O復(fù)性lmin，72°C延伸Imin，共35個循環(huán)；72°C延伸 lOmin。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟I中所述擴(kuò)增的體系包括所述柳枝稷基因組DNA、Taq酶、所述具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的上游引物、所述具有SEQ ID NO 2所示核苷酸序列的下游引物、dNTPs、MgCl2、滅菌水。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述電泳的介質(zhì)采用瓊脂糖凝膠。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述瓊脂糖凝膠中的瓊脂糖的含量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)為2%。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及用于確定柳枝稷生態(tài)型的SRAP特異性分子標(biāo)記引物及柳枝稷生態(tài)型檢測方法。本發(fā)明提供了一種SRAP引物組，該引物組由具有SEQ ID NO1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO2所示核苷酸序列的下游引物組成，并提供了一種柳枝稷生態(tài)型檢測方法用具有SEQ ID NO1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQID NO2所示核苷酸序列的下游引物對柳枝稷基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；取擴(kuò)增產(chǎn)物電泳，根據(jù)電泳的結(jié)果鑒定柳枝稷的生態(tài)型。本發(fā)明提供的鑒定方法操作簡單，周期短，提高了檢測效率，且避免了傳統(tǒng)方法中不確定的人為因素對鑒定結(jié)果的影響。
文檔編號C12Q1/68GK102994499SQ20131000242
公開日2013年3月27日 申請日期2013年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月5日
發(fā)明者黃琳凱, 張新全, 楊盛婷, 張瑜, 曾兵, 蔣曉梅, 季楊 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)