本發(fā)明屬于中藥制劑檢測領(lǐng)域，涉及華蓋散顆粒指紋圖譜的測定方法。

背景技術(shù)：

中藥成分復(fù)雜，藥效部位常常不是單一成分，以某種單一成分作為質(zhì)量控制指標(biāo)已越來越不適應(yīng)中藥質(zhì)量控制的要求。因此，中藥指紋圖譜技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。

中藥指紋圖譜技術(shù)源于指紋鑒定學(xué)，利用現(xiàn)代信息技術(shù)和質(zhì)量分析手段較全面的反映了中藥所含化學(xué)成分的種類和數(shù)量。對于中藥材，指紋圖譜可以用來鑒別真?zhèn)?、評判優(yōu)劣；對于中成藥，指紋圖譜可以鑒別產(chǎn)品真?zhèn)?，評判制備工藝的合理性，有效地控制產(chǎn)品質(zhì)量。現(xiàn)階段中藥的有效成分大多數(shù)尚不明確，中藥指紋圖譜的整體性和模糊性正好適應(yīng)這一特點(diǎn)，較單一成分的質(zhì)量控制方法更具有科學(xué)性和全面性。目前國際上已認(rèn)可將中藥指紋圖譜作為中藥質(zhì)量的控制模式。高效液相色譜法具有分離效能高、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，已成為當(dāng)今指紋圖譜的主要分析手段。

華蓋散出自宋·陳師文《太平惠民和劑局方》，由麻黃、炒紫蘇子、炒苦杏仁、陳皮、蜜桑白皮、赤茯苓、炙甘草共7味藥物組成。方中以麻黃為君，辛溫解表、宣肺平喘以祛風(fēng)寒。臣以紫蘇子，辛香降氣化痰，苦杏仁辛苦溫，化痰止咳平喘，二藥共降利肺氣，祛痰止咳。佐藥陳皮辛溫，燥濕化痰、理氣行滯；桑白皮腥味甘寒，瀉肺利水平喘；茯苓健脾滲濕，杜絕生痰之源；三藥聯(lián)用共祛濕消痰。甘草為使，調(diào)和諸藥。諸藥配伍，解表與化痰并用，痰濕得消，表寒得散，諸證自愈。全方主治肺感寒邪、咳嗽上氣、胸膈煩滿、項(xiàng)背拘急、聲重鼻塞、頭昏目眩、痰氣不利、呀呷有聲，廣泛用于臨床感冒、咳嗽、哮病、喘證等肺系疾病。太極集團(tuán)重慶涪陵制藥廠有限公司研發(fā)了我國第一個(gè)華蓋散顆粒制劑。已被列為國家重大新藥創(chuàng)制科技重大專項(xiàng)。但是，目前國內(nèi)還沒有文獻(xiàn)報(bào)道對華蓋散顆粒指紋圖譜的研究。董自亮等人在《中草藥雜志》(2016，47(3):425-429)中報(bào)道了華蓋散傳統(tǒng)湯劑的指紋圖譜檢測方法，而經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)研究，該方法并非適宜華蓋散顆粒成品的質(zhì)量控制，不能系統(tǒng)、全面的反映華蓋散顆粒的內(nèi)在質(zhì)量。為保障患者用藥安全有效，發(fā)明一種控制華蓋散顆粒整體質(zhì)量的檢測方法迫在眉睫?；诖耍景l(fā)明建立了一種適應(yīng)于華蓋散顆粒的新的指紋圖譜檢測方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種華蓋散顆粒指紋圖譜的建立方法，通過該方法得到華蓋散顆粒的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，為華蓋散顆粒的質(zhì)量控制和真?zhèn)舞b別提供一種新的方法，并且該方法建立的指紋圖譜能夠較為全面的反應(yīng)中藥的物質(zhì)信息，增強(qiáng)了指紋峰的可視化比較。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

1、華蓋散顆粒指紋圖譜的測定方法，包括如下步驟：

(1)制備華蓋散顆粒樣品制備：取華蓋散顆粒，研細(xì)，加甲醇溶液，超聲溶解，冷卻，再加甲醇溶液補(bǔ)足失重，搖勻，過濾，收集濾液得華蓋散顆粒樣品；

(2)色譜檢測：將步驟(1)制得華蓋散顆粒樣品，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料的色譜柱，柱溫為27℃，流速為0.8～1.2ml/min，檢測波長為278nm，流動(dòng)相為乙腈和甲酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01％的甲酸水條件下洗脫。

本發(fā)明中，所述甲醇溶液為體積分?jǐn)?shù)50％的甲醇溶液，所述超聲為超聲至少30分鐘。

本發(fā)明中，所述甲醇溶液加入量按每克華蓋散顆粒加50ml甲醇溶液。

本發(fā)明中，步驟(1)由以下步驟代替：取華蓋散顆粒，研細(xì)，加入乙醇溶液振搖分散后，靜置過夜，離心分別收集上清和殘?jiān)恋碛靡掖既芤合礈熘翚堅(jiān)辽锨逡簾o色，離心，合并上清液，揮干溶劑，殘?jiān)眉状既芤喝芙狻?/p>

優(yōu)選的，所述甲醇溶液為體積分?jǐn)?shù)為50％的甲醇溶液，所述乙醇溶液為體積分?jǐn)?shù)75％的乙醇溶液。

優(yōu)選的，所述甲醇溶液加入量按每克華蓋散顆粒加50ml體積分?jǐn)?shù)為50％的甲醇溶液。

更優(yōu)選的，所述離心為5000r/min條件下離心5min。

本發(fā)明中，所述洗脫為梯度洗脫，具體條件為：

0～25min，乙腈：甲酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01％的甲酸水的體積比由2％﹕98％到7％﹕93％；

25～38min，乙腈：甲酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01％的甲酸水的體積比由7％﹕93％→10％﹕90％；

38～60min，乙腈：甲酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01％的甲酸水的體積比由10％﹕90％→15％﹕85％；

60～120min，乙腈：甲酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01％。

本發(fā)明公開了華蓋散顆粒指紋圖譜的測定方法，具有如下優(yōu)點(diǎn)：

(a)本發(fā)明首次公開華蓋散顆粒指紋圖譜的建立，指紋圖譜能夠較單一指標(biāo)成分控制更全面的反應(yīng)中藥的物質(zhì)信息，增強(qiáng)了指紋譜峰的整體性比較；

(b)供試品制作簡便，色譜條件容易實(shí)現(xiàn)；

(c)方法穩(wěn)定性和重現(xiàn)性均較好；

(d)有效表征了華蓋散顆粒的質(zhì)量，有利于產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)控；具有方法簡便、穩(wěn)定、精密度高、重現(xiàn)性好；可準(zhǔn)確地鑒別產(chǎn)品的真?zhèn)蝺?yōu)劣。

附圖說明

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖進(jìn)行說明：

圖1為采用不同掃描方式對華蓋散顆粒進(jìn)行hplc指紋圖譜檢測的結(jié)果；

圖2為采用不同色譜柱對華蓋散顆粒進(jìn)行hplc指紋圖譜檢測的結(jié)果；

圖3為采用不同柱溫對華蓋散顆粒進(jìn)行hplc指紋圖譜檢測的結(jié)果；

圖4為采用不同流動(dòng)相對華蓋散顆粒進(jìn)行hplc指紋圖譜檢測的結(jié)果；

圖5為采用本發(fā)明所述方法檢測華蓋散顆粒的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜；

圖6為本發(fā)明所述華蓋散顆粒與單味藥供試品溶液的色譜圖結(jié)果；

圖7為十批華蓋散顆粒樣品的指紋圖譜疊加圖，其由中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)a版生成。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。

本發(fā)明實(shí)施例儀器與試藥：

儀器：島津20a高效液相色譜儀(日本島津公司)；n-1001d-wa旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本eyela公司)；kq2200e型超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；sartorius-bs124s電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)。美國absciex公司api3000型三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(配有turboionspray離子化源以及analyst1.4數(shù)據(jù)處理系統(tǒng))；美國安捷倫公司agilent1100四元梯度泵和自動(dòng)進(jìn)樣器。

試藥：水為哇哈哈純凈水；乙腈和甲醇均為色譜純；其余試劑為分析純。

實(shí)驗(yàn)例1、色譜條件優(yōu)化

1.掃描方式的考察

對不同波長條件下華蓋散顆粒指紋圖譜進(jìn)行了比較，選擇：190～400nm全波長掃描(提取波長278nm)和278nm單波長掃描兩種掃描方式進(jìn)行比較，獲得的色譜圖結(jié)果見圖1所示。

從譜峰的分離度上看，278nm單波長掃描圖峰形較好，各峰分離度好，基線平穩(wěn)，好于190～400nm全波長掃描后提取的波長278nm圖，故選擇278nm單波長為華蓋散顆粒指紋圖譜的掃描波長。

2.色譜柱的選擇

在同一色譜條件下，選擇：thermosyncronisc18(250×4.6mm，5μm)和c18(250×4.6mm，5μm)色譜柱兩種色譜柱進(jìn)行比較，獲得的色譜圖結(jié)果見圖2所示。結(jié)果顯示，thermosyncronisc18(250×4.6mm，5μm)的分離效果較好、檢出峰多、保留時(shí)間適宜，因此選用thermosyncronisc18(250×4.6mm，5μm)色譜柱。

3.柱溫的考察

考察色譜柱溫在27℃、30℃、35℃和40℃下的譜峰行為，獲得的色譜圖結(jié)果見圖3所示。由圖3可見，隨著柱溫的升高色譜峰的保留時(shí)間提前，色譜峰的分離情況變差，華蓋散在27℃條件下分離度最佳，因此選擇的柱溫為27℃。

4.流動(dòng)相的考察

在同一色譜條件下，對乙腈-0.01％磷酸水、乙腈-0.1％磷酸水、乙腈-0.01％甲酸水、乙腈-水和甲醇-0.01％磷酸水(流動(dòng)相a﹕流動(dòng)相b的體積比由7％﹕93％→10％﹕90％；從38～60min，流動(dòng)相a﹕流動(dòng)相b的體積比由10％﹕90％→15％﹕85％；從60～120min，流動(dòng)相a﹕流動(dòng)相b的體積比由15％﹕85％→40％﹕60％)五種不同的流動(dòng)相進(jìn)行考察，獲得的色譜圖結(jié)果見圖4所示。

由流動(dòng)相考察的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，加入酸可以優(yōu)化峰形，但是隨著酸濃度的增加，色譜峰的分離度并沒有實(shí)質(zhì)性的變化，且較高的酸濃度不利于華蓋散中生物堿的分離；乙腈-0.01％磷酸水和乙腈-0.01％甲酸水色譜圖沒有明顯的差異，為了方便質(zhì)譜分析選擇乙腈-0.01％甲酸水；甲醇-0.01％磷酸水色譜峰較寬，并且若想達(dá)到較好的分離，可能需要較長的分析時(shí)間；綜上所述，選擇乙腈-0.01％甲酸水為流動(dòng)相。

5、華蓋散顆粒樣品制備的優(yōu)化

(1)供試品溶液制備方法的選擇

采用現(xiàn)有技術(shù)中的四種制備方法獲得供試品溶液，具體如下：

a、取華蓋散顆粒粉末0.25g，精密稱定，置25ml量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)50％的甲醇溶液20ml，超聲處理30min，取出，放冷，加體積分?jǐn)?shù)50％的甲醇溶液至刻度，搖勻，濾過，濾液過0.45μm微孔濾膜，即得；

b、取華蓋散顆粒樣品適量，研細(xì)，稱取0.50g，加體積分?jǐn)?shù)50％的甲醇溶液25ml，超聲30min，放冷，補(bǔ)足失重，搖勻，過濾，即得；

c、取華蓋散顆粒樣品適量，研細(xì)，稱取0.50g，加75％乙醇30ml，振搖分散后，靜置過夜，離心(5000r/min)5min，用體積分?jǐn)?shù)75％的乙醇溶液洗滌殘?jiān)辽锨逡簾o色(實(shí)際為10ml兩次洗離)，離心，合并上清液，水浴揮干溶劑，殘?jiān)皿w積分?jǐn)?shù)50％的甲醇溶液溶解并定容至25ml，搖勻，過濾，即得。

d、取華蓋散顆粒樣品適量，研細(xì)，稱取0.50g，加體積分?jǐn)?shù)75％的乙醇溶液30ml，振搖分散后，靜置過夜，離心(5000r/min)5min，用體積分?jǐn)?shù)75％的乙醇溶液洗滌殘?jiān)辽锨逡簾o色(實(shí)際為10ml兩次洗離)，離心，合并上清液，減壓濃縮至揮干溶劑，殘?jiān)皿w積分?jǐn)?shù)50％的甲醇溶液溶解并定容至25ml，搖勻，過濾，即得。

分別對上述a-d四種制備方法所得的華蓋散顆粒色圖譜按照上述優(yōu)化后的條件進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，其指紋圖譜的整體相同，b、c、d各峰型基本一致。但采用方法a時(shí)，供試品峰面積較小，需要較大的進(jìn)樣量才能達(dá)到預(yù)期的峰面積；采用方法c、d時(shí)，制備過程繁瑣，周期較長，另外方法d中，甲醇作為供試品溶劑，各色譜峰峰形較差。綜合考慮，最終選擇方法b作為華蓋散顆粒供試品溶液的制備方法。

(2)超聲處理時(shí)間的選擇

試驗(yàn)比較了在供試品溶液制備中，超聲處理的時(shí)間分別為15min、30min、45min的華蓋散顆粒指紋圖譜。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著超聲時(shí)間的延長，各色譜峰峰面積有所增加，但超聲30min與45min無差異，較佳的超聲處理時(shí)間為30min。

實(shí)驗(yàn)例2、華蓋散指紋圖譜方法驗(yàn)證

1、指紋圖譜檢測

按照上述實(shí)驗(yàn)中優(yōu)化后的檢測條件進(jìn)行華蓋散顆粒的指紋圖譜檢測，具體包括：

取華蓋散顆粒樣品適量，研細(xì)，稱取0.50g，加50％甲醇25ml，超聲30min，放冷，補(bǔ)足失重，搖勻，過濾，即得供試品溶液。

照高效液相色譜法，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料，以乙腈為流動(dòng)相a，以0.01％甲酸水為流動(dòng)相b；控制流速為0.8～1.2ml/min；柱溫27℃；檢測波長：278nm；按照如下程序進(jìn)行梯度洗脫：從0～25min，流動(dòng)相a﹕流動(dòng)相b的體積比由2％﹕98％→7％﹕93％；從25～38min，流動(dòng)相a﹕流動(dòng)相b的體積比由7％﹕93％→10％﹕90％；從38～60min，流動(dòng)相a﹕流動(dòng)相b的體積比由10％﹕90％→15％﹕85％；從60～120min，流動(dòng)相a﹕流動(dòng)相b的體積比由15％﹕85％→40％﹕60％。

吸取供試品溶液與對照品溶液10μl-20μl，注入液相色譜儀，測定。

檢測得到的華蓋散顆粒的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜詳見圖5所示，所得的華蓋散顆粒的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜包括15個(gè)共有峰，各峰號(hào)的相對保留時(shí)間分別為：(1)13.909、(2)15.798、(3)46.185、(4)48.529、(5)61.984、(6)64.327、(7)74.229、(8)75.590(甘草苷)、(9)80.881、(10)82.393、(11)84.434(橙皮苷)、(12)85.568(迷迭香酸)、(13)97.360、(14)99.703、(15)105.750。

2、精密度試驗(yàn)

取同一供試品溶液，按上述實(shí)驗(yàn)中優(yōu)化后的檢測條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜指紋圖譜，考察各共有峰與內(nèi)標(biāo)峰相對保留時(shí)間和相對峰面積，結(jié)果見表1和2所示。

表1.精密度試驗(yàn)-相對保留時(shí)間

表2精密度試驗(yàn)-相對峰面積

結(jié)果表明，相對保留時(shí)間rsd<0.2％，相對峰面積rsd<10.0％，精密度良好。

3、穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，按實(shí)驗(yàn)中優(yōu)化后的檢測條件，分別在0h、3h、6h、9h、12h和24h進(jìn)行檢測，記錄色譜指紋圖譜，考察各共有峰與內(nèi)標(biāo)峰相對保留時(shí)間和相對峰面積，結(jié)果見表3和4。

表3、穩(wěn)定性試驗(yàn)-相對保留時(shí)間

表4、穩(wěn)定性試驗(yàn)-相對峰面積

結(jié)果表明，相對保留時(shí)間rsd<0.2％，相對峰面積rsd<10.0％，穩(wěn)定性良好。

4重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次華蓋散顆粒6份，按照上述供試品制備方法6份供試品溶液，按照上述檢測方法，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜指紋圖譜，考察各共有峰與內(nèi)標(biāo)峰相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果見表5和6所示。

表5、重復(fù)性試驗(yàn)-相對保留時(shí)間

表6、重復(fù)性試驗(yàn)-相對峰面積

結(jié)果顯示，相對保留時(shí)間rsd<0.2％，相對峰面積rsd<12.0％，重復(fù)性良好。

實(shí)驗(yàn)例3、華蓋散顆粒hplc指紋圖譜色譜峰指認(rèn)

通過考察不同對照品的保留時(shí)間及紫外光譜，鑒別了華蓋散顆粒hplc指紋圖譜中8號(hào)峰(75.59min)為甘草苷、11號(hào)峰(84.434min)為橙皮苷、12號(hào)峰(85.568min)為迷迭香酸。通過光譜圖給出的光學(xué)信息發(fā)現(xiàn)，華蓋散顆粒色譜中與相應(yīng)已知參照物色譜峰的紫外光譜吻合，獲得的色譜圖結(jié)果見圖6所示，華蓋散指紋圖譜特征峰的來源分析結(jié)果見表7。

表7、華蓋散指紋圖譜特征峰的來源分析結(jié)果

實(shí)驗(yàn)例4、華蓋散顆粒hplc指紋圖譜的相似度評價(jià)

取華蓋散顆粒10批次產(chǎn)品(批號(hào)為：20160101、20160102、20160103、16050007、16050008、16060009、16060010、16070011、16080012)由太極集團(tuán)重慶涪陵制藥廠有限公司提供。

按照前述實(shí)驗(yàn)例2中提供的方法進(jìn)行指紋圖譜的檢測，獲得的色譜圖結(jié)果見圖7所示。采用中國藥典委員會(huì)推薦的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)2004a版》對hplc圖譜進(jìn)行綜合評價(jià)，相似度結(jié)果見表8。

表8、相似度結(jié)果

從表8的相似度結(jié)果中可以看出，10批華蓋散樣品與參照譜以及根據(jù)中位數(shù)法生成的對照譜之間的相似度均大于0.9，表明不同批次華蓋散樣品相似度較好。因此，將華蓋散顆粒的指紋圖譜納入其內(nèi)控質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，將其相似性定為不得小于0.90。

最后說明的是，以上優(yōu)選實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過上述優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍。