本發(fā)明屬于化學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，尤其是一種ase-hplc法測(cè)定威靈仙中齊墩果酸含量的方法。

背景技術(shù)：

2015年版藥典方法：取本品粉末(過(guò)四號(hào)篩)約4g，精密稱定，置索氏提取器中，加乙酸乙酯適量，加熱回流3小時(shí)，棄去乙酸乙酯液，藥渣揮干溶劑，連同濾紙筒轉(zhuǎn)移至錐形瓶中，精密加入稀乙醇50ml，稱定重量，加熱回流1小時(shí)，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液25ml，置水浴上蒸干，殘?jiān)?mol/l鹽酸溶液30ml使溶解，加熱回流2小時(shí)。立即冷卻，移入分液漏斗中，用水10ml分次洗滌容器，洗液并入分液漏斗中。加乙酸乙酯振搖提取3次，每次15ml，合并乙酸乙酯液，70℃以下濃縮至近干，加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

該方法提取時(shí)間長(zhǎng)，且對(duì)技術(shù)人員的專業(yè)水平要求較高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述不足，本發(fā)明旨在提供一種ase-hplc法測(cè)定威靈仙中齊墩果酸含量的方法，該方法提取時(shí)間短、重復(fù)性好，且檢測(cè)精度高。

為了實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)效果，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是這樣的：一種ase-hplc法測(cè)定威靈仙中的齊墩果酸含量的方法，依次包括下述步驟：

步驟1：采用ase法萃取威靈仙粉末，并收集甲醇萃取液；

步驟2：采用hplc法測(cè)定甲醇萃取液中的齊墩果酸的含量；

其中，步驟1所述的萃取依次包括用乙酸乙酯在80℃下去脂，在120℃下乙醇提取。

優(yōu)選地，所述的步驟1包括下述子步驟：

步驟s1：將威靈仙粉碎，過(guò)三號(hào)篩，取1g與1g石英砂混合；

步驟s2：將混合物裝于放有濾膜、1g硅藻土的ase萃取池中，加石英砂至與池口平行；

步驟s3：用乙酸乙酯去脂，再用乙醇提??；

步驟s4：蒸干，將沉淀用30ml鹽酸溶解，加熱回流2h；

步驟s5：冷卻，移入分液漏斗中，加45ml乙酸乙酯提取，濃縮；

步驟s6：將步驟s5所得的濃縮物加甲醇溶解，并加甲醇定容至10ml，離心，取上清液。

優(yōu)選地，步驟s3所述的去脂參數(shù)為：壓力為1500psi，溫度為80℃，萃取時(shí)間為3min，循環(huán)次數(shù)為2次，沖洗體積為100％，吹掃時(shí)間為60s。

優(yōu)選地，步驟s3所述的提取參數(shù)為：壓力為1500psi，溫度為120℃，萃取時(shí)間為5min，循環(huán)次數(shù)為3次，沖洗體積為100％，吹掃時(shí)間為60s。

優(yōu)選地，步驟s4所述的鹽酸濃度為2mol/l。

優(yōu)選地，所述的步驟5具體為：冷卻，移入分液漏斗中，提取加乙酸乙酯提取3次，每次15ml，收集3次提取液，濃縮。

優(yōu)選地，步驟2所述的hplc法的檢測(cè)參數(shù)為：色譜柱為thermoacclaimc30；柱溫為20℃；

流速為0.5ml/min；流動(dòng)相為乙腈-水；檢測(cè)波長(zhǎng)為205nm。

優(yōu)選地，所述的色譜柱的規(guī)格為2.1*150mm，3μm。

優(yōu)選地，所述的流動(dòng)相為體積比等于62：38的乙腈-水。

本發(fā)明與傳統(tǒng)方法相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明曾對(duì)快速溶劑萃取使用的溶劑進(jìn)行考察，《中國(guó)藥典》使用乙酸乙酯除雜，采用稀乙醇提取齊墩果酸結(jié)合物再水解成齊墩果酸，雜質(zhì)較少，故對(duì)使用乙酸乙酯、正己烷作為除雜溶劑，甲醇、稀乙醇、乙醇作為提取溶劑進(jìn)行了溶劑考察，結(jié)果顯示乙酸乙酯除雜，稀乙醇提取齊墩果酸后采用2mol/l鹽酸水解后的含量與2015年版《中國(guó)藥典》含量一致，且雜質(zhì)峰基本相同，故采用與藥典一致的提取溶劑。期間我們?cè)嚥捎靡宜嵋阴コs，采用5％氨水稀乙醇、3％磷酸稀乙醇作為提取和水解溶液作為儀器的萃取罐內(nèi)進(jìn)行水解提取，提取效果不佳，故單獨(dú)采用藥典的2mol/l鹽酸溶液雜儀器外進(jìn)行水解。

在除雜過(guò)程中，藥典方法加入乙酸乙酯回流3h，時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，我們采用了多次萃取除雜的方式，發(fā)現(xiàn)80℃，提取3min，2次即可達(dá)到除去大部分雜質(zhì)，再多的提取時(shí)間和次數(shù)已經(jīng)無(wú)明顯影響，而相對(duì)高的溫度會(huì)是齊墩果酸結(jié)果降低，故最終確定最佳除雜工藝組合為提取溫度80℃，提取時(shí)間3min，提取次數(shù)2次。提取過(guò)程中采用120℃。提取5min，提取3次即可達(dá)到與藥典含量接近，更多的提取時(shí)間、溫度、次數(shù)對(duì)結(jié)果已經(jīng)無(wú)明顯影響。最終確定最佳提取工藝組合為提取溫度120℃，提取時(shí)間5min，提取次數(shù)3次。

附圖說(shuō)明

圖1為以齊墩果酸對(duì)照品的濃度(μg/ml)-峰面積進(jìn)行的線性回歸圖；

圖2為齊墩果酸對(duì)照品溶液的色譜圖；

圖3為采用藥典方法提取所得的供試品溶液的色譜圖；

圖4為采用ase法提取所得的供試品溶液的色譜圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的權(quán)利要求做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的任何限制，任何在本發(fā)明權(quán)利要求保護(hù)范圍內(nèi)所做的有限次修改，仍在本發(fā)明的權(quán)利要求保護(hù)范圍內(nèi)。

實(shí)施例1

1、儀器設(shè)備及試劑

1.1儀器：

電子分析天平(xa205du)、ase350快速溶劑萃取儀(美國(guó)dionex公司)、thermou3000uhplc液相色譜儀

1.2試劑：

水：符合gb/t6682規(guī)定的一級(jí)水；

甲醇(ch4o)：色譜純；

乙醇(c2h60)、乙酸乙酯(c4h8o2)：分析純；

石英砂：2mm。

2、方法

2.1對(duì)照品溶液的制備

取齊墩果酸對(duì)照品適量，精密稱定，加流動(dòng)相制成每1ml含1mg的溶液，即得。

2.2供試品溶液的制備

2.2.12015年版藥典方法

取本品粉末(過(guò)四號(hào)篩)約4g，精密稱定，置索氏提取器中，加乙酸乙酯適量，加熱回流3小時(shí)，棄去乙酸乙酯液，藥渣揮干溶劑，連同濾紙筒轉(zhuǎn)移至錐形瓶中，精密加入稀乙醇50ml，稱定重量，加熱回流1小時(shí)，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液25ml，置水浴上蒸干，殘?jiān)?mol/l鹽酸溶液30ml使溶解，加熱回流2小時(shí)。立即冷卻，移入分液漏斗中，用水10ml分次洗滌容器，洗液并入分液漏斗中。加乙酸乙酯振搖提取3次，每次15ml，合并乙酸乙酯液，70℃以下濃縮至近干，加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.2.2快速溶劑萃取法(ase)制備供試品方法

樣品經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過(guò)三號(hào)篩，約1g，精密稱定，與適量石英砂混合均勻，待用，在預(yù)先放好過(guò)濾膜的10ml萃取池中先加入1g硅藻土，后加入混合均勻的樣品，再加入適量石英砂，輕輕振搖使之與池口在同一水平線下2mm處，擰緊萃取池上蓋。萃取(包括除雜和提取2步，見ase條件方法)結(jié)束后，置水浴上蒸干，殘?jiān)?mol/l鹽酸溶液30ml使溶解，加熱回流2小時(shí)。立即冷卻，移入分液漏斗中，用水10ml分次洗滌容器，洗液并入分液漏斗中。加乙酸乙酯振搖提取3次，每次15ml，合并乙酸乙酯液，70℃以下濃縮至近干，加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，在15000r/min下離心3min，取上清液，進(jìn)入lc測(cè)定即得。

2.2.3對(duì)照品溶液的制備

取威靈仙對(duì)照品適量，精密稱定，加流動(dòng)相制成每1ml含1mg的溶液，即得。

2.3ase萃取條件

去脂參數(shù)為：壓力為1500psi，溫度為80℃，萃取時(shí)間為3min，循環(huán)次數(shù)為2次，沖洗體積為100％，吹掃時(shí)間為60s。

提取參數(shù)為：壓力為1500psi，溫度為120℃，萃取時(shí)間為5min，循環(huán)次數(shù)為3次，沖洗體積為100％，吹掃時(shí)間為60s。

2.4色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

a)儀器：thermo雙三元液相(u-3000)；

b)色譜柱：thermoacclaimc30，2.1*150mm，3μm

c)柱溫：20℃；

d)流速：0.5ml/min；

e)流動(dòng)相：乙腈-水(62：38)；

f)檢測(cè)波長(zhǎng)：205nm；

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；理論板數(shù)按齊墩果酸峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

2.5測(cè)定法

照高效液相色譜法(通則0512)測(cè)定；

分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。

2.6標(biāo)準(zhǔn)限值要求

本品按干燥品計(jì)算，含齊墩果酸(c30h48o3)不得少于0.30％。

2.7計(jì)算(外標(biāo)法)

式中cr—對(duì)照品溶液濃度，單位為微克每升(mg/l)；

ax—供試品的峰面積；

ar—對(duì)照品峰面積。

注意：

使用前萃取池底部應(yīng)拆卸清理干凈，否則容易引起壓力不穩(wěn)；

萃取池底部的濾紙應(yīng)在密封圈內(nèi)，否則引起滲漏；

萃取池裝樣時(shí)松緊適中，太松容易導(dǎo)致提取液過(guò)多；

開機(jī)前檢查氣瓶氣壓是否達(dá)到1mpa；

使用結(jié)束后清理干凈，萃取池要及時(shí)晾干(容易生銹)。

3、結(jié)果

3.1線性關(guān)系

取齊墩果酸對(duì)照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1ml含齊墩果酸1mg的溶液，然后分別精密吸取該溶液0.1μl、0.2μl、0.5μl、0.8μl、1.0μl進(jìn)入lc測(cè)定，并依照上述方法測(cè)定，結(jié)果詳見表1。

以濃度(μg/ml)-峰面積進(jìn)行線性回歸，求得回歸方程y＝0.00084x+0.03077，r＝0.99991。齊墩果酸在108.4～1084μg/ml范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，詳見圖1。

表1線性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

取相同批號(hào)的樣品(批號(hào)：150410(z))1.0g，共6份，精密稱定，按ase提取方法提取供試品溶液，進(jìn)樣量為1μl，以上述的色譜條件平行試驗(yàn)，測(cè)得樣品中齊墩果酸的含量見表2，rsd為2.0％，結(jié)果表明ase提取方法重復(fù)性良好。

表2

3.3精密度和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取齊墩果酸對(duì)照品溶液(1.084mg/ml)，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，峰面積rsd為0.5％，表明儀器精密度良好。

取同一供試品溶液，室溫下放置，分別于0，1，3，6，12h依法測(cè)定。結(jié)果黃芪甲苷峰面積的rsd為1.5％，表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

3.4樣品采用藥典方法與sae方法含量測(cè)定結(jié)果(3批)

表3可以看出采用ase儀器1、ase儀器2和藥典方法提取后的結(jié)果以及ase儀器之間的重復(fù)性均良好。

表3

4、討論：

4.1ase提取溶劑的選擇：

試驗(yàn)中，曾對(duì)快速溶劑萃取使用的溶劑進(jìn)行考察，《中國(guó)藥典》使用乙酸乙酯除雜，采用稀乙醇提取齊墩果酸結(jié)合物再水解成齊墩果酸，雜質(zhì)較少，故對(duì)使用乙酸乙酯、正己烷作為除雜溶劑，甲醇、稀乙醇、乙醇作為提取溶劑進(jìn)行了溶劑考察，結(jié)果顯示乙酸乙酯除雜，稀乙醇提取齊墩果酸后采用2mol/l鹽酸水解后的含量與2015年版《中國(guó)藥典》含量一致，且雜質(zhì)峰基本相同，故采用與藥典一致的提取溶劑。期間我們?cè)嚥捎靡宜嵋阴コs，采用5％氨水稀乙醇、3％磷酸稀乙醇作為提取和水解溶液作為儀器的萃取罐內(nèi)進(jìn)行水解提取，提取效果不佳，故單獨(dú)采用藥典的2mol/l鹽酸溶液再儀器外外進(jìn)行水解。

4.2ase提取條件的優(yōu)化

在除雜過(guò)程中，藥典方法加入乙酸乙酯回流3h，時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，我們采用了多次萃取除雜的方式，發(fā)現(xiàn)80℃，提取3min，2次即可達(dá)到除去大部分雜質(zhì)，再多的提取時(shí)間和次數(shù)已經(jīng)無(wú)明顯影響，而相對(duì)高的溫度會(huì)是齊墩果酸結(jié)果降低，故最終確定最佳除雜工藝組合為提取溫度80℃，提取時(shí)間3min，提取次數(shù)2次。提取過(guò)程中采用120℃。提取5min，提取3次即可達(dá)到與藥典含量接近，更多的提取時(shí)間、溫度、次數(shù)對(duì)結(jié)果已經(jīng)無(wú)明顯影響。最終確定最佳提取工藝組合為提取溫度120℃，提取時(shí)間5min，提取次數(shù)3次。

以上所述的僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡在本發(fā)明的精神和原則范圍內(nèi)所做的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。