本發(fā)明屬于免疫檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種微流控芯片熒光免疫快速檢測(cè)試劑盒及其制備和檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

近年來(lái)微流控芯片(microfluidicchips)技術(shù)發(fā)展迅速,在醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用得到不斷擴(kuò)展。微流控芯片是指采用微細(xì)加工技術(shù),將微通道網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)及其他功能元件集成在數(shù)平方厘米的基片上,通過(guò)對(duì)微通道中的流體進(jìn)行控制,以實(shí)現(xiàn)進(jìn)樣、稀釋、混合、反應(yīng)、分離、檢測(cè)等多種功能的微全分析系統(tǒng),具有微型化、集成化、分析速度快、試劑消耗少等顯著優(yōu)點(diǎn)。

免疫標(biāo)記技術(shù)是以抗原抗體特異性反應(yīng)為基本原理，采用熒光素、同位素或酶等示蹤物質(zhì)標(biāo)記抗體(或抗原)進(jìn)行抗原-抗體反應(yīng)，通過(guò)對(duì)免疫復(fù)合物中的標(biāo)記物的測(cè)定，達(dá)到對(duì)免疫反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)的目的。

免疫標(biāo)記技術(shù)按檢測(cè)反應(yīng)體系的物理狀態(tài)分為均相免疫反應(yīng)和非均相免疫反應(yīng)。

非均相免疫反應(yīng)是指將抗原或抗體固定在固相載體（微孔板或?yàn)V紙）表面,通過(guò)特異性免疫反應(yīng),將所需檢測(cè)的抗體或抗原結(jié)合在固相表面,繼經(jīng)清洗,即可實(shí)現(xiàn)抗原抗體復(fù)合物與游離的抗原、抗體之間的物理分離。通常使用的免疫層析法、酶聯(lián)免疫法、板式化學(xué)發(fā)光法均為非均相免疫分析方法。

“微流控芯片免疫分析抗體固定方法比較”（《中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)》2015年第1期）、“微流控芯片免疫分析技術(shù)及其研究進(jìn)展”（《檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)》2007第22卷第4期）等文獻(xiàn)報(bào)道利用微流控芯片通道壁為固相載體來(lái)包被抗體（或抗原）的方法，就是一種簡(jiǎn)便的微流控芯片與微孔板免疫技術(shù)相結(jié)合的非均相免疫分析方法。

專利“雙層微流控芯片器件及其在免疫檢測(cè)中的用途”（cn102749433）使用了微流控技術(shù)與傳統(tǒng)的免疫標(biāo)記技術(shù)（非均相）相結(jié)合。使用上下兩個(gè)微流控芯片，分別通入抗原和抗體，通過(guò)抽真空，使抗原和抗體分別富集在聚酯膜上并發(fā)生免疫反應(yīng)。該專利有以下不足：（1）所用的抗原和抗體試劑仍需分別保存在試劑瓶中（與傳統(tǒng)方法相同），試驗(yàn)過(guò)程中通過(guò)抽真空驅(qū)動(dòng)液體流動(dòng)、混合、反應(yīng)，不能使反應(yīng)集成化；（2）所用固相載體—聚酯膜代替微孔板（或試紙），成本高；（3）聚酯膜孔徑影響抗原或抗體的富集；（3）非均相反應(yīng)是在固相載體的表面進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)不充分，靈敏度和重復(fù)性受到限制。

均相免疫反應(yīng)是指抗原和抗體在同一介質(zhì)（液態(tài)體系）中進(jìn)行的免疫反應(yīng)。目前應(yīng)用較廣的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫方法就是均相免疫反應(yīng)，即將抗體（或抗原）偶聯(lián)在包裹了磁微粒的微球上，在反應(yīng)過(guò)程中將這種偶聯(lián)了抗體（或抗原）的磁微球懸浮在反應(yīng)液中，使得這種磁微球抗體（或抗原）與溶液中待測(cè)物質(zhì)充分接觸，使免疫反應(yīng)更加充分、完全。在外加磁場(chǎng)作用下，將免疫反應(yīng)形成的復(fù)合物與未結(jié)合的其它物質(zhì)分離。該方法由于采用了均相反應(yīng)體系，使反應(yīng)的精密度和重復(fù)性進(jìn)一步提高。但該技術(shù)需要匹配大型檢測(cè)儀器，檢測(cè)費(fèi)用大，耗時(shí)時(shí)間長(zhǎng)，試劑和樣品用量大。

“基于磁珠技術(shù)的微流控生物芯片系統(tǒng)的研究”（《上海交通大學(xué)》2007年）是將免疫磁珠置于微流控通道中，由于受流體流動(dòng)速度以及抗原和抗體只有一過(guò)性接觸的影響，抗原和抗體不能保證充分、徹底反應(yīng)。

微流控技術(shù)、磁微粒免疫技術(shù)與熒光免疫技術(shù)相結(jié)合技術(shù)研究目前還沒有更多的文獻(xiàn)報(bào)道。

因此，研制一種方便、快捷、高通量、靈敏度高、集成化高、適合工業(yè)化生產(chǎn)的微流控芯片均（液）相熒光免疫快速檢測(cè)試劑盒是目前亟待解決的問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種微流控芯片熒光免疫快速檢測(cè)試劑盒，該試劑盒以熒光物質(zhì)為標(biāo)記物，以磁性微球?yàn)椴东@物，試劑用量少，集成化高，所有試劑均事先固化于芯片中；標(biāo)記熒光微球和捕獲磁珠固化簡(jiǎn)便、易復(fù)溶、易懸?。豢稍谙鄬?duì)閉合的空間內(nèi)進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，無(wú)交叉污染，不污染環(huán)境。具有高效率、高通量、高靈敏度、快速、靈敏、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：一種微流控芯片熒光免疫快速檢測(cè)試劑盒,其特征在于：該試劑盒含有微流控芯片，所述微流控芯片包括一條或多條檢測(cè)單元，所述檢測(cè)單元位于微流控芯片的半徑軸上，以微流控芯片中心點(diǎn)發(fā)散排列，所述檢測(cè)單元自芯片中心點(diǎn)向邊緣依次排列有加樣槽、熒光探針槽、反應(yīng)檢測(cè)槽和廢液槽，以及相互連接的微通道；所述熒光探針槽底部固化有熒光探針，該熒光探針是聚苯乙烯熒光（flu）微球偶聯(lián)抗體（或抗原或二抗）的復(fù)合物；所述反應(yīng)檢測(cè)槽中固化有捕獲磁珠微球，該捕獲磁珠微球是聚苯乙烯磁珠微球偶聯(lián)抗體（或抗原或二抗）的復(fù)合物。

所述微流控芯片只有加樣槽通過(guò)加樣孔與外界相通，其余槽均是封閉的。

所述加樣槽、熒光探針槽、反應(yīng)檢測(cè)槽和廢液槽的容積相等或不相等，相鄰兩個(gè)槽的間距相等或不相等。

所述微流控芯片的驅(qū)動(dòng)力為離心力。

所述的聚苯乙烯熒光微球的直徑為10～300nm，優(yōu)選50～200nm；聚苯乙烯熒光微球內(nèi)包裹熒光物質(zhì)，所述熒光物質(zhì)包括羅丹明、異硫氰酸熒光素、藻紅蛋白、鑭系元素（釤sm、銪eu、釓gd、鋱tb等）、量子點(diǎn)等；所述聚苯乙烯磁珠微球的直為1～10um，優(yōu)選2um～5um，微球內(nèi)包裹超順磁四氧化三鐵微粒(mag)，微粒平均直徑10nm。

所述微流控芯片是由上下兩塊板（a板、b板）鍵合而成，所述微流控芯片的材料為石英、玻璃或pdms、pmma、ps、pc、coc、cop等高聚物，所述微流控芯片的形狀為圓形或外接圓的多邊形。

所述微流控芯片中心位置有一與離心機(jī)轉(zhuǎn)軸相匹配的固定孔，所述微流控芯片的厚度為4mm～10mm，直徑為50～200mm，優(yōu)選80～100mm，所述槽表面可以是圓形、橢圓形、水滴形或其他不規(guī)則形，槽的容積為5～200ul。

所述檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)樣本為全血、血清、血漿、唾液、痰液、淚液、尿液或其他人體分泌物，以及上述液體的提取液或稀釋液或洗脫液；所述檢測(cè)試劑盒可同時(shí)進(jìn)行1個(gè)樣品的多因子分別檢測(cè)，也可同時(shí)進(jìn)行多個(gè)樣品的1個(gè)或多個(gè)因子的分別檢測(cè)。

一種微流控芯片熒光免疫快速檢測(cè)試劑盒的制備方法,該方法包括如下步驟。

（1）制備a板和b板。

a板和b板含有相互對(duì)應(yīng)的一條或多條檢測(cè)單元，a板上的檢測(cè)單元含有加樣孔、熒光探針槽上部分、反應(yīng)檢測(cè)槽上部分和廢液槽上部分，以及相互連接的通道，b板上的檢測(cè)單元含有與a板相對(duì)應(yīng)的的加樣槽、熒光探針槽下部分、反應(yīng)檢測(cè)槽下部分和廢液槽下部分。

（2）熒光探針聚苯乙烯熒光微球的制備。

取包裹熒光物質(zhì)的聚苯乙烯熒光微球經(jīng)洗滌、超聲、攪拌處理后,與抗體1（或抗原1或二抗）偶聯(lián)，加入bsa緩沖液對(duì)熒光微球作封閉處理，即得“抗體（或抗原或二抗）-熒光微球”[ab1（ag1）-flu]。

（3）捕獲抗體2（或抗原2或二抗）磁性微球的制備。

取聚苯乙烯磁性微球經(jīng)洗滌、超聲、攪拌處理后,與抗體2（或抗原2或二抗）混合，加入bsa緩沖液對(duì)微球作封閉處理,即得“捕獲抗體（或抗原或二抗）-磁性微球”[ab2(ag2)-mag]。

（4）將“抗體1（或抗原1或二抗）-熒光微球”與“捕獲抗體2（或抗原2或二抗）-磁性微球””各1～20ul分別加入到b板的熒光探針槽和反應(yīng)檢測(cè)槽中，37°c干燥固化。

（5）采用超聲鍵合機(jī)將芯片a、b板鍵合成一塊完整的芯片。

（6）用特殊粘合封口膜將樣品孔封閉，封鋁箔袋中，即得。

一種微流控芯片熒光免疫快速檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法,該方法包括如下步驟。

(1)待測(cè)物質(zhì)溶液加入到加樣孔中，通過(guò)離心驅(qū)動(dòng)待測(cè)溶液到達(dá)至熒光探針槽并溶解探針微球，待測(cè)物質(zhì)與相應(yīng)的抗體1(或抗原1或二抗)特異性結(jié)合，形成抗原-抗體-熒光微球(flu-ab-ag)復(fù)合物。

（2）在離心驅(qū)動(dòng)下，繼續(xù)將熒光探針槽中的復(fù)合物等溶液全部輸送至反應(yīng)檢測(cè)槽中，并溶解反應(yīng)檢測(cè)槽中捕獲抗體磁珠微球，溶液中的抗原-抗體-熒光微球1(flu-ab-ag)復(fù)合物與捕獲抗體2（或抗原2或二抗）-磁性微球發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，形成“熒光微球-抗體1-抗原-抗體2-磁珠微球”的雙抗體夾心磁性復(fù)合物(flu–ab1-ag–ab2-mag)或“熒光微球-抗原1-抗體-抗原2-磁珠微球”的雙抗原夾心磁性復(fù)合物(flu–ag1-ab-ag2-mag)，并懸浮在溶液中。

（3）在外加磁場(chǎng)的作用下，磁性復(fù)合物被吸附在反應(yīng)檢測(cè)槽的底部，在離心驅(qū)動(dòng)下，將不含磁性微球的溶液輸送到廢液槽，磁性熒光復(fù)合物則留在檢測(cè)槽的底部。

（4）通過(guò)加樣孔加入清洗緩沖液，離心，清洗反應(yīng)檢測(cè)槽中的磁性熒光復(fù)合物，加入外磁場(chǎng)，離心去除清洗液，反復(fù)操作。

（5）通過(guò)熒光檢測(cè)儀檢測(cè)，以一定波長(zhǎng)的光照射反應(yīng)檢測(cè)槽中的磁性熒光復(fù)合物，檢測(cè)熒光微球的發(fā)光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度與待測(cè)物濃度呈相關(guān)性。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)。

（1）以熒光物質(zhì)為標(biāo)記物，以磁性微球?yàn)椴东@物，試劑用量少，集成化高。

（2）所有試劑均事先固化于芯片中，省卻傳統(tǒng)試劑盒大量試管的使用，并省卻反復(fù)取樣操作。

（3）固化的聚苯乙烯熒光微球和聚苯乙烯磁珠微球當(dāng)樣品溶液或清洗緩沖液流經(jīng)時(shí)易復(fù)溶并懸浮于液體中。

（4）樣品需樣量極少，單個(gè)指標(biāo)僅需要10ul。

（5）檢測(cè)時(shí)間短，操作簡(jiǎn)單。加入樣品后，放入檢測(cè)儀，5～10分鐘即可完成全部自動(dòng)檢測(cè)。

（6）全封閉系統(tǒng)，可以進(jìn)行最少1個(gè)樣本的檢測(cè)，不污染其余的檢測(cè)單元。

（7）可以進(jìn)行多樣本或多因子同時(shí)檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的高通量。

（8）均相反應(yīng)體系使檢測(cè)結(jié)果靈敏度高（10^-15mol/ml）、精密度高（cv＜5%）、重復(fù)性更高（cv＜5%）。

附圖說(shuō)明

附圖1為微流控芯片熒光免疫試劑盒的檢測(cè)單元結(jié)構(gòu)示意圖。

圖中，1:加樣孔，2:加樣槽，3:熒光探針槽，4:反應(yīng)檢測(cè)槽，5：廢液槽，

6：微通道。

附圖2為微流控芯片熒光免疫試劑盒的微流控芯片內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖。

附圖3為3樣本、4因子微流控芯片熒光免疫試劑盒的微流控芯片結(jié)構(gòu)示意圖。

附圖4為微流控芯片熒光免疫試劑盒的熒光免疫檢測(cè)原理示意圖。

附圖5為本發(fā)明與羅氏磁微粒電化學(xué)發(fā)光試劑盒一致性的比較結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

以下是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。

實(shí)施例1：n端腦鈉肽前體（nt-probnp）微流控芯片熒光免疫試劑盒試劑（多種樣本，1項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)試劑盒）的制備及檢測(cè)。

1、制備a板和b板。

制備a板和b板，二者均含有相互對(duì)應(yīng)12條檢測(cè)單元，a板上的檢測(cè)單元含有加樣孔、熒光探針槽上部分、反應(yīng)檢測(cè)槽上部分和廢液槽上部分，以及相互連接的通道，b板上的檢測(cè)單元含有與a板相對(duì)應(yīng)的的加樣槽、熒光探針槽下部分、反應(yīng)檢測(cè)槽下部分和廢液槽下部分。

2、標(biāo)記抗體熒光微球的制備。

取直徑為100nm的聚苯乙烯包裹量子點(diǎn)（qd，熒光探針）的熒光微球經(jīng)洗滌、超聲、攪拌處理后,與nt-probnp單克隆抗體1偶聯(lián)，偶聯(lián)反應(yīng)后形成“標(biāo)記抗體1-熒光微球”,加入bsa緩沖液對(duì)熒光微球作封閉處理，得“熒光標(biāo)記的nt-probnp單克隆抗體1微球”(qd-ab1)。

3、捕獲抗體磁性微球的制備。

取直徑為5um的聚苯乙烯磁性微球經(jīng)洗滌、超聲、攪拌處理后,與nt-probnp單克隆抗體2混合，偶聯(lián)反應(yīng)形成“捕獲抗體2-磁性微球”,加入bsa緩沖液對(duì)微球作封閉處理,得到用于捕獲的“nt-probnp單克隆抗體2-磁性微球”（ab2-mag）。

4、將“量子點(diǎn)標(biāo)記的nt-probnp單克隆抗體1微球”與“nt-probnp單克隆抗體2-磁性微球”各10ul分別加到b板的熒光探針槽和反應(yīng)檢測(cè)槽中，37°c干燥固化1小時(shí)。

5、采用超聲鍵合機(jī)將芯片a、b板鍵合成一塊完整的芯片，芯片結(jié)構(gòu)如圖2；芯片直徑80mm，厚度6mm，每個(gè)芯片上有12組相同的檢測(cè)單元。

6、封口，用特殊粘合封口膜將樣品孔封閉，封鋁箔袋中，貯存。

7、檢測(cè)，取出包裝完好的微流控芯片試劑盒，撕開樣品孔的封口膜，放入自制的全自動(dòng)液相微流控芯片熒光分析檢測(cè)儀的芯片室內(nèi)，機(jī)器自動(dòng)采集全血樣品加入微流控芯片的加樣槽中，自動(dòng)離心、清洗、檢測(cè)、打印結(jié)果，全部檢測(cè)10分鐘完成。

8、檢測(cè)結(jié)果與重復(fù)，見下表。

檢測(cè)結(jié)果與羅氏磁微粒電化學(xué)發(fā)光試劑盒一致性的比較結(jié)果。

對(duì)兩種方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行線性回歸分析，建立線性回歸方程：y=a+bx。相關(guān)系數(shù)r值＞0.90。由結(jié)果可知，兩種方法的檢測(cè)結(jié)果有很好的相關(guān)性，見圖5。

實(shí)施例2：術(shù)前4項(xiàng)（乙肝表面抗原/丙肝抗體/人類免疫缺陷病毒抗體/梅毒螺旋體抗體）聯(lián)檢試劑盒（3份樣本、4項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)檢試劑盒）的制備及檢測(cè)。

1、標(biāo)記抗體（或抗原）熒光微球的制備:取直徑為200nm的聚苯乙烯包裹銪金屬螯合物（eu，熒光探針）的熒光微球經(jīng)洗滌、超聲、攪拌處理后,分別與①乙肝表面抗體1②丙肝重組抗原1③人類免疫缺陷病毒重組抗原1④梅毒螺旋體重組抗原1進(jìn)行偶聯(lián)，偶聯(lián)反應(yīng)后分別形成4種熒光微球標(biāo)記物，備用。

2、捕獲抗體（或抗原）微球的制備:取直徑為3um的聚苯乙烯磁性微球經(jīng)洗滌、超聲、攪拌處理后,分別與①乙肝表面抗體2②丙肝重組抗原2③人類免疫缺陷病毒重組抗原2④梅毒螺旋體重組抗原2進(jìn)行偶聯(lián)，偶聯(lián)反應(yīng)后形成4種捕獲抗體（或抗原）磁性微球，備用。

3、以聚甲基丙烯酸甲酯（pmma）為材料，芯片直徑100mm，a、b板均由3組結(jié)構(gòu)相同的微通道組成3組檢測(cè)單元，每組檢測(cè)單元又由4組結(jié)構(gòu)相同的微結(jié)構(gòu)組成，可以同時(shí)、分別進(jìn)行3樣本的各4種指標(biāo)的同時(shí)檢測(cè)，芯片結(jié)構(gòu)如圖3所示。

4、分別將4種標(biāo)記抗體（或抗原）熒光微球固化于b板的每組相對(duì)應(yīng)的熒光探針槽底部，37°c干燥固化40分鐘。

5、分別將4種捕獲抗體（或抗原）磁珠微球固化于b板的每組相對(duì)應(yīng)的反應(yīng)檢測(cè)槽底部，37°c干燥固化40分鐘。

6、采用超聲鍵合機(jī)將芯片a、b板鍵合成一塊完整的芯片，芯片厚度5mm。

7、封口，用特殊粘合封口膜將各樣品孔封閉，封鋁箔袋中，貯存。

8、檢測(cè)，取出包裝完好的微流控芯片試劑盒，撕開樣品孔的封口膜，放入自制的全自動(dòng)液相微流控芯片熒光分析檢測(cè)儀的芯片室內(nèi)，機(jī)器自動(dòng)采集全血樣品加入微流控芯片的加樣孔中，自動(dòng)離心、清洗、檢測(cè)、打印結(jié)果。全部檢測(cè)10分鐘完成。

結(jié)果比較:本試劑盒與雅培architect-i2000system微粒子化學(xué)發(fā)光試劑盒（乙肝表面抗原、丙肝抗體、人類免疫缺陷病毒抗體、梅毒螺旋體抗體4種）比較，見表2。

表2熒光免疫法和化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)檢測(cè)結(jié)果比較。

由結(jié)果可知，hbsag、anti-tp、anti-hiv、anti-hcv比對(duì)結(jié)果為陽(yáng)性符合率為100%，陰性符合率為100%，k=1。兩種方法檢測(cè)結(jié)果具有高度的一致性。