本發(fā)明屬于水產(chǎn)品質(zhì)量安全領(lǐng)域，具體涉及水產(chǎn)品中苯并咪唑及噻唑類(lèi)殘留藥物的快速提取方法及LC-MS-MS檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，大規(guī)模的寄生蟲(chóng)病害不斷發(fā)生，大量的抗蟲(chóng)藥應(yīng)用到水產(chǎn)養(yǎng)殖中。由于標(biāo)簽外用和不遵守休藥期，造成了嚴(yán)重的藥物殘留。大部分抗寄生蟲(chóng)藥具有一定的毒性，例如臨床試驗(yàn)表明，大多數(shù)苯并咪唑類(lèi)藥物具有制致畸和致突變的作用。在使用此類(lèi)藥物的過(guò)程中也曾出現(xiàn)過(guò)嚴(yán)重的不良反應(yīng)，例如過(guò)敏性休克、嚴(yán)重麻疹和腦炎綜合癥，已受到各國(guó)的廣泛關(guān)注。2004年，我國(guó)藥品不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)中心首次通報(bào)了“甲苯咪唑等三種咪唑類(lèi)驅(qū)蟲(chóng)藥引起腦炎綜合征的概述”，引起了社會(huì)的廣泛關(guān)注。噻唑類(lèi)抗寄生蟲(chóng)藥，并沒(méi)有批準(zhǔn)應(yīng)用在水產(chǎn)動(dòng)物中，但是此類(lèi)藥物在實(shí)際生產(chǎn)中也存在違規(guī)使用。其中左旋咪唑違規(guī)使用較為嚴(yán)重，應(yīng)該嚴(yán)格控制此藥在水產(chǎn)動(dòng)物中的使用。這些藥物在水產(chǎn)品中的大量殘留，對(duì)人類(lèi)生命健康存在巨大的潛在威脅。因此在各個(gè)國(guó)家都作為食品殘留監(jiān)控對(duì)象，制定了嚴(yán)格的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)近些年來(lái)，苯并咪唑類(lèi)和噻唑類(lèi)藥物的殘留檢測(cè)技術(shù)不斷發(fā)展，主要方法有酶聯(lián)免疫法、氣相色譜法、液相色譜法和液質(zhì)譜聯(lián)用法。由于操作方便簡(jiǎn)單，檢測(cè)限和定量限都較低，液質(zhì)聯(lián)用法廣泛應(yīng)用到殘留檢測(cè)中。目前這些檢測(cè)方法中使用的提取方法仍然停留在液液提取和固相萃取方面，需要耗費(fèi)大量的人力和很長(zhǎng)的時(shí)間進(jìn)行樣品處理，而且處理方法中用到大量的有機(jī)試劑，產(chǎn)生大量的廢液和廢氣，給環(huán)境造成污染。本發(fā)明中采用簡(jiǎn)便快速的分散固相萃取方法，提供了一整套樣品處理、流動(dòng)相優(yōu)化和質(zhì)譜檢測(cè)方法。本方法中樣品量大約是以前方法的三分之一，加入去水、分層劑和有機(jī)試劑大大減少，方法中優(yōu)化了左旋咪唑、甲苯咪唑及代謝物和阿苯達(dá)唑及代謝物的檢測(cè)方法，選取了最佳的流動(dòng)相和質(zhì)譜檢測(cè)條件，得到了良好的精密度和準(zhǔn)確度。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種水產(chǎn)品中苯并咪唑及噻唑類(lèi)殘留藥物的快速提取及LC-MS-MS檢測(cè)方法，采用簡(jiǎn)便快速的分散固相萃取方法提取樣品，選取了最佳的流動(dòng)相和質(zhì)譜檢測(cè)條件，檢測(cè)結(jié)果精密度和準(zhǔn)確度良好。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：水產(chǎn)品中苯并咪唑及噻唑類(lèi)殘留藥物的快速提取及LC-MS-MS檢測(cè)方法，其步驟是：1)提?。悍Q(chēng)取水產(chǎn)品肌肉樣品，加入內(nèi)標(biāo)氘代阿苯達(dá)唑和氘代甲苯咪唑，再加入去水劑硫酸鎂和氯化鈉、提取溶液乙腈進(jìn)行漩渦，離心后取上清液；2)凈化：在上清液加入分散固相萃取試劑，所述萃取試劑為質(zhì)量比1:1的C18粉(十八烷基硅烷)和中性氧化鋁，漩渦后氮?dú)獯蹈?，再加入體積比為1:1的甲醇和0.01％甲酸水的混合液進(jìn)行復(fù)溶，經(jīng)0.22μm的有機(jī)濾膜過(guò)濾，濾液供LC-MS-MS檢測(cè)；3)LC-MS-MS測(cè)定：液相色譜流動(dòng)相的水相為pH3.9的10mmol/L乙酸銨，有機(jī)相含5mmol/L乙酸銨、甲醇及乙腈，甲醇及乙腈的體積比為1:9，檢測(cè)的殘留藥物左旋咪唑(LEV)、氨基-甲苯咪唑(MBZ-NH2)、羥基-甲苯咪唑(MBZ-OH)、甲苯咪唑(MBZ)以氘代甲苯咪唑(MBZ-D3)為內(nèi)標(biāo)，阿苯達(dá)唑亞砜(ABZ-SO)、阿苯達(dá)唑砜(ABZ-SO2)、阿苯達(dá)唑氨基砜(ABZ-NH2-SO2)和阿苯達(dá)唑(ABZ)以氘代阿苯達(dá)唑(ABZ-D3)為內(nèi)標(biāo)；采用待測(cè)藥物的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液上機(jī)測(cè)定，繪標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)；將步驟2)中的濾液進(jìn)行LC-MS-MS定量測(cè)定，采用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算水產(chǎn)品中LEV、MBZ-NH2、MBZ-OH、MBZ、ABZ-SO、ABZ-SO2、ABZ-NH2-SO2和ABZ的殘留量。優(yōu)選的，步驟1)中肌肉樣品為2g，內(nèi)標(biāo)ABZ-D3和MBZ-D3的終濃度分別為5μg/kg和10μg/kg，去水劑硫酸鎂和氯化鈉分別為0.84g、0.21g，提取溶液乙腈為10mL。優(yōu)選的，步驟3)中采用的色譜柱為C18柱，150mm×2.1mm，粒徑3μm。優(yōu)選的，步驟3)中流速為0.2mL/min，進(jìn)樣量10μL，流動(dòng)相梯度如下：優(yōu)選的，步驟3)中質(zhì)譜條件為霧化氣溫度338℃，鞘氣40arb，輔助氣5arb，離子傳輸管350℃。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)及有益效果：1、本方法快速簡(jiǎn)便，提取和凈化步驟少，節(jié)約了大量的人力和物力：在提取方法中采用樣品量更少，僅為2g；采用一步有機(jī)試劑提取，即得提取液，優(yōu)化了去水劑和分層劑的量，選取了最佳的提取溶劑。2、比較了不同固體分散凈化劑的凈化效果，選取了最佳的凈化劑及加入量(質(zhì)量比為1:1的C18和AL-N混合粉)，化合物的回收率都在80.0-117.9％之間，日內(nèi)和日間變異系數(shù)都在10％之內(nèi)。3、選取了最佳的水相pH值，增加了每個(gè)化合物分離度和選擇性，尤其使左旋咪唑出峰更完美。附圖說(shuō)明圖1為不同提取溶液對(duì)團(tuán)頭魴中苯并咪唑及噻唑類(lèi)藥物的提取效果。圖2為C18粉進(jìn)行凈化時(shí)左旋咪唑各個(gè)離子質(zhì)譜圖。圖3為PSA粉進(jìn)行凈化時(shí)左旋咪唑各個(gè)離子質(zhì)譜圖。圖4為NH2粉進(jìn)行凈化時(shí)左旋咪唑各個(gè)離子質(zhì)譜圖。圖5為C18和AL-N混合粉進(jìn)行凈化時(shí)左旋咪唑各個(gè)離子質(zhì)譜圖。圖6為不同凈化劑對(duì)苯并咪唑及噻唑類(lèi)藥物的提取效率的影響。圖7為水相pH值為7.2時(shí)左旋咪唑的離子質(zhì)譜圖。圖8為水相pH值為3.9時(shí)左旋咪唑的離子質(zhì)譜圖。圖9為團(tuán)頭魴肌肉中添加10μg/kg左旋咪唑(LEV)、氨基-甲苯咪唑(MBZ-NH2)、羥基-甲苯咪唑(MBZ-OH)、甲苯咪唑(MBZ)定性離子和定量離子質(zhì)譜圖。圖10為團(tuán)頭魴肌肉中添加10μg/kg阿苯達(dá)唑亞砜(ABZ-SO)、阿苯達(dá)唑砜(ABZ-SO2)、阿苯達(dá)唑氨基砜(ABZ-NH2-SO2)、阿苯達(dá)唑(ABZ)定性離子和定量離子質(zhì)譜圖。具體實(shí)施方式實(shí)施例1：不同提取溶劑的效果比較(1)提?。悍Q(chēng)取團(tuán)頭魴肌肉空白樣品2g于50mL離心管中，空白樣品中分別添加待測(cè)化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使各個(gè)待測(cè)化合物(LEV、MBZ-NH2、MBZ-OH、MBZ、ABZ-SO、ABZ-SO2、ABZ-NH2-SO2和ABZ)的終濃度分別達(dá)到2、3和4μg/kg，加入內(nèi)標(biāo)氘代阿苯達(dá)唑(ABZ-D3)和氘代甲苯咪唑(MBZ-D3)，使其終濃度分別達(dá)到5μg/kg和10μg/kg，加入0.84g硫酸鎂(提取樣品中分別加入0.44g、0.84g和1.04g硫酸鎂，發(fā)現(xiàn)加入0.84g硫酸鎂時(shí)，提取液能夠完全吹干，達(dá)到最佳效果)和0.21g氯化鈉，加入10mL提取溶劑，旋渦1min，5000rpm離心5min，取5.5mL提取液，待用；在本實(shí)施例中提取溶劑分別選用了乙腈(ACN)、乙腈+0.05％氨水(氨水的終濃度，下同)、乙腈+0.1％氨水、乙腈+0.2％氨水、乙腈+0.05％甲酸、乙腈+0.1％甲酸、乙腈+0.2％甲酸。(2)凈化：將上述5.5mL提取液放入10mL離心管中，加入分散固相萃取試劑(50mgC18粉和50mgAl-N粉)，旋渦1min，5000rpm離心5min，40℃水浴下，氮?dú)獯蹈桑?mL甲醇/0.01％甲酸水(v：v＝1:1)復(fù)溶，12000rpm離心10min，過(guò)0.22μm的有機(jī)濾膜，供LC-MS-MS檢測(cè)。(3)色譜條件儀器：高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(SuryeyorMSPumpPlus，SuryeyorAutosamplerPlus，ThermoTSQQuantumAcessMAX)及ThermoLCquan2.6數(shù)據(jù)采集處理軟件色譜柱：hypersilgold-C18(150mm×2.1mm，粒徑3μm)流動(dòng)相洗脫條件：水相中加入乙酸銨10mmol/L，采用甲酸調(diào)節(jié)pH值到3.9；有機(jī)相為5mmol/L乙酸銨、甲醇及乙腈，甲醇及乙腈的體積比為1:9表1流動(dòng)相梯度流速：200μL/min進(jìn)樣量：10μL離子源：電噴霧離子源掃描方式：正離子檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)噴霧電壓：3500V霧化器溫度：338℃鞘氣：40arb輔助氣：5arb離子傳輸管溫度：350℃LEV、MBZ-NH2、MBZ-OH、MBZ以MBZ-D3為內(nèi)標(biāo)，ABZ-SO、ABZ-SO2、ABZ-NH2-SO2和ABZ以ABZ-D3為內(nèi)標(biāo)；標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)是采用混合標(biāo)準(zhǔn)品，濃度分別為1、2、5、10、20和50μg/L；測(cè)定定量離子的峰面積和內(nèi)標(biāo)離子的峰面積，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，定量離子的峰面積與內(nèi)標(biāo)離子的峰面積比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。(4)計(jì)算回收率R＝(Ai/Ais)/(As/Ass)×100％R為回收率，Ai為加標(biāo)樣品中目標(biāo)化合物的峰面積，Ais為加標(biāo)樣品中內(nèi)標(biāo)的峰面積，As為目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積，Ass為標(biāo)準(zhǔn)品中添加的內(nèi)標(biāo)的峰面積。本實(shí)施例選用不同的提取溶劑(純乙腈、乙腈+0.05％氨水、乙腈+0.1％氨水、乙腈+0.2％氨水、乙腈+0.05％甲酸、乙腈+0.1％甲酸、乙腈+0.2％甲酸)，采用內(nèi)標(biāo)法對(duì)團(tuán)頭魴肌肉中的LEV、MBZ-NH2、MBZ-OH、MBZ、ABZ-SO、ABZ-SO2、ABZ-NH2-SO2和ABZ進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1，綜合各種因素最終發(fā)現(xiàn)純乙腈的提取效果是最佳的。實(shí)施例2：不同凈化劑的效果比較按照實(shí)施例1所述的方法，以乙腈為提取溶劑，分別選取C18粉(十八烷基硅烷)、PSA粉(乙二胺-N-丙基硅烷)、AL-N粉(中性氧化鋁)、NH2粉((氨丙基)硅膠基質(zhì))、C18+AL-N混合粉(各50mg)作為凈化劑，比較不同凈化劑對(duì)LEV、MBZ-NH2、MBZ-OH、MBZ、ABZ-SO、ABZ-SO2、ABZ-NH2-SO2和ABZ的測(cè)定效果。如圖2、3、4所示，選用C18粉、PSA粉、NH2粉對(duì)提取液進(jìn)行凈化時(shí)，左旋咪唑定量離子91.3檢測(cè)時(shí)出現(xiàn)較大干擾峰；選用AL-N粉作為凈化劑，雜質(zhì)峰消除；如圖5所示，最終經(jīng)C18和AL-N混合粉(各50mg)凈化各個(gè)化合都能達(dá)到較高的回收率，而且樣品中雜質(zhì)少。實(shí)施例3：水相的pH值對(duì)左旋咪唑的出峰效果的比較按照實(shí)施例1所述的方法，以乙腈為提取溶劑，選用C18+AL-N混合粉(各50mg)作為凈化劑，流動(dòng)相水相中加入乙酸銨10mmol/L，水相的pH值分別設(shè)置為3.9(采用甲酸調(diào)節(jié))、7.2(不加pH調(diào)節(jié)劑)，測(cè)定不同pH值對(duì)左旋咪唑的影響。如圖8所示，pH值為3.9時(shí)，峰的對(duì)稱(chēng)性最好。實(shí)施例4：苯并咪唑及噻唑類(lèi)藥物的快速提取及LC-MS-MS檢測(cè)方法根據(jù)實(shí)施例1-3優(yōu)選的實(shí)驗(yàn)條件，采用LC-MS-MS檢測(cè)方法測(cè)定苯并咪唑及噻唑類(lèi)藥物在團(tuán)頭魴肌肉中的殘留量，以其回收率及精密度作為檢測(cè)效果的衡量指標(biāo)，其步驟是：1、樣品處理方法(1)提取稱(chēng)取團(tuán)頭魴肌肉空白樣品2g于50mL離心管中，空白樣品中分別添加不同濃度的待測(cè)化合物(LEV、MBZ-NH2、MBZ-OH、MBZ、ABZ-SO、ABZ-SO2、ABZ-NH2-SO2和ABZ)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使各個(gè)待測(cè)化合物的終濃度分別達(dá)到2、3和4μg/kg，加入內(nèi)標(biāo)ABZ-D3和MBZ-D3，使其終濃度分別達(dá)到5μg/kg和10μg/kg，加入0.84g硫酸鎂和0.21g氯化鈉，加入10mL提取溶液乙腈，旋渦1min，5000rpm離心5min，取5.5mL提取液待用；(2)凈化將上述5.5mL提取液放入10mL離心管中，加入分散固相萃取試劑(50mgC18粉+50mgAl-N粉)，旋渦1min，5000rpm離心5min，40℃水浴下，氮?dú)獯蹈桑?mL甲醇/0.01％甲酸水(v：v＝1:1)復(fù)溶，12000rpm離心10min，過(guò)0.22μm的有機(jī)濾膜，供LC-MS-MS檢測(cè)。2、LC/MS/MS(1)色譜條件儀器：高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(SuryeyorMSPumpPlus，SuryeyorAutosamplerPlus，ThermoTSQQuantumAcessMAX)及ThermoLCquan2.6數(shù)據(jù)采集處理軟件色譜柱：hypersilgold-C18(150mm×2.1mm，粒徑3μm)流動(dòng)相洗脫條件：流動(dòng)相水相中加入乙酸銨10mmol/L，采用甲酸調(diào)節(jié)pH值到3.9；有機(jī)相含5mmol/L乙酸銨、甲醇及乙腈，甲醇及乙腈的體積比為1:9，流動(dòng)相梯度如下：時(shí)間min有機(jī)相％水相％089018903505059010790101088流速：200μL/min進(jìn)樣量：10μL離子源：電噴霧離子源掃描方式：正離子檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)噴霧電壓：3500V霧化器溫度：338℃鞘氣：40arb輔助氣：5arb離子傳輸管溫度：350℃(2)線(xiàn)性和測(cè)定低限本方法對(duì)于水產(chǎn)品肌肉中LEV、MBZ-NH2、MBZ-OH、MBZ、ABZ-SO、ABZ-SO2、ABZ-NH2-SO2和ABZ測(cè)定低限均為1μg/kg，采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，LEV、MBZ-NH2、MBZ-OH、MBZ以MBZ-D3為內(nèi)標(biāo)；ABZ-SO、ABZ-SO2、ABZ-NH2-SO2和ABZ以ABZ-D3為內(nèi)標(biāo)；標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)是采用混合標(biāo)準(zhǔn)品，濃度分別為1、2、5、10、20和50μg/L；內(nèi)標(biāo)ABZ-D3和MBZ-D3的濃度分別為5和10μg/L，測(cè)定定量離子的峰面積和內(nèi)標(biāo)離子的峰面積(見(jiàn)圖9和10)，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，定量離子的峰面積與內(nèi)標(biāo)離子的峰面積比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，每種化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)良好，相關(guān)系數(shù)都達(dá)到0.996-0.999之間。(3)回收率和精密度R＝(Ai/Ais)/(As/Ass)×100％R為回收率，Ai為加標(biāo)樣品中目標(biāo)化合物的峰面積，Ais為加標(biāo)樣品中內(nèi)標(biāo)的峰面積，As為目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積，Ass為標(biāo)準(zhǔn)品中添加的內(nèi)標(biāo)的峰面積。精密度：選定三個(gè)濃度，每個(gè)濃度3個(gè)平行，一天內(nèi)測(cè)定3次，計(jì)算回收率的變異系數(shù)為日內(nèi)變異系數(shù)；選定三個(gè)濃度，每個(gè)濃度3個(gè)平行，連續(xù)測(cè)定3天，計(jì)算回收率的變異系數(shù)為日間變異系數(shù)?？瞻讟悠分蟹謩e添加三個(gè)不同濃度的待測(cè)化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加濃度為2、3和4ug/kg，按照操作方法制備樣品，獲得了良好的回收率和變異系數(shù)，回收率都在80.0-117.9％之間，日內(nèi)和日間變異系數(shù)都在10％以?xún)?nèi)。表2團(tuán)頭魴肌肉中不同化合物的回收率和精密度當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3