本發(fā)明涉及一種檢測復(fù)方阿膠制劑中阿膠含量的組合物及試劑盒，還包括使用該組合物或試劑盒進行復(fù)方阿膠制劑中阿膠含量檢測的方法，本發(fā)明屬于醫(yī)藥與食品檢測技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

阿膠作為一種傳統(tǒng)名貴中藥，已有數(shù)千年的食用歷史，具有補血滋陰，潤燥，止血的功效。中國藥典規(guī)定，阿膠為馬科動物驢Equus asinus L.的干燥皮或鮮皮經(jīng)煎煮、濃縮制成的固體膠。純正的阿膠必需來自百分百的驢皮，方能保證產(chǎn)品的功效。從原料生物分類學(xué)上看，驢屬于奇蹄目馬科驢屬，包括非洲野驢、藏野驢、中亞野驢、家驢等品種。其中中國飼養(yǎng)的家驢包括關(guān)中驢、德州驢、廣靈驢、佳米驢、泌陽驢、淮陽驢、慶陽驢、華北驢、新疆驢、西南驢等眾多地方品種。由于驢的畜牧價值不斷下降，而其經(jīng)濟價值卻未見提高，驢的數(shù)量在世界范圍內(nèi)急劇下降，驢皮的供應(yīng)也逐年緊張，價格不斷上漲。市場上出現(xiàn)了很多不法分子，在生產(chǎn)阿膠時，部分甚至全部用各種其他動物皮包括馬皮、騾皮、牛皮、豬皮等來取代驢皮進行熬制，有的甚至直接摻入工業(yè)明膠。這些偽品的存在嚴(yán)重干擾了市場正常秩序，損害消費者利益，影響正規(guī)產(chǎn)品的信譽。

阿膠經(jīng)長時間高溫蒸煮濃縮而成，主要成分非常相近且不同廠家的生產(chǎn)工藝存有差異，采用紅外、近紅外、X-衍射、HPLC等方法對阿膠進行真?zhèn)舞b別常存在判斷不準(zhǔn)確、缺乏足夠說服力等。目前已報道的鑒別阿膠真?zhèn)伪容^權(quán)威的方法主要是DNA分子鑒定方法和檢測特征性肽段的液質(zhì)聯(lián)用方法。已報道的這兩種方法都無法對阿膠中驢皮源成分進行比較準(zhǔn)確的定量檢測，而是通過檢測阿膠中是否含有驢的成分，并排除其他動物源成分來判斷阿膠真?zhèn)?；但阿膠的摻假可能會五花八門，因此需要排除的動物源成分會是多種多樣，利用排除法來鑒別阿膠真?zhèn)未嬖谥匾毕?，其?zhǔn)確性和可靠性會大打折扣，這種情況非常不利于對市場阿膠產(chǎn)品的監(jiān)管。利用驢皮源成分含量來判斷阿膠真?zhèn)?，可從根本上限制阿膠的造假行為。已報道的文獻中，對驢皮源性成分檢測，基本都沒有排除馬皮源性成分，因此雖宣稱為驢皮源成分，實則為驢與馬共有。

因此，目前迫切需要提出一種能夠快速、準(zhǔn)確檢測復(fù)方阿膠制劑中阿膠含量的方法，進而實現(xiàn)對復(fù)方阿膠制劑的真?zhèn)舞b別。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的在于，提供快速、準(zhǔn)確檢測復(fù)方阿膠制劑中阿膠含量的組合物。

本發(fā)明的再一個目的在于，提供用于快速、準(zhǔn)確檢測復(fù)方阿膠制劑中阿膠含量的試劑盒。

本發(fā)明的另一個目的在于，提供快速、準(zhǔn)確檢測復(fù)方阿膠制劑中阿膠含量的檢測方法。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：

本發(fā)明的一種用于檢測復(fù)方阿膠制劑中阿膠含量的組合物，由多肽I、多肽II、多肽III以及對照品檢測基質(zhì)組成，其中，所述多肽I的氨基酸序列為Ser-Gly-Gln-Pro-Gly-Thr-Val-Gly-Pro-Ala-Gly-Val-Arg(SEQ ID NO.1所示)，多肽II的氨基酸序列為His-Gly-His-Arg(SEQ ID NO.2所示)，多肽III的氨基酸序列為Gly-Val-Val-Gly-Pro-Gln-Gly-Ala-Arg(SEQ ID NO.3所示)，對照品檢測基質(zhì)為魚皮膠。

含有所述組合物的檢測試劑盒也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

進一步的，本發(fā)明還提出了一種使用所述的組合物或試劑盒檢測復(fù)方阿膠制劑中阿膠含量的方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)對照品溶液的制備：

對照品檢測基質(zhì)粉碎后，稱取一定量的對照品檢測基質(zhì)于量瓶中，加入NH₄HCO₃溶液，超聲使樣品完全溶解，得到基質(zhì)溶液，用配制得到的基質(zhì)溶液溶解稱量好的多肽I、多肽II和多肽III，搖勻，得到對照品母液，采用分步稀釋的方法，以基質(zhì)溶液為溶劑，將對照品母液稀釋500-10⁵倍，微孔濾膜過濾，續(xù)濾液中加胰蛋白酶溶液，酶解；

2)復(fù)方阿膠制劑樣品溶液的制備：

取待檢測復(fù)方阿膠制劑樣品于量瓶中，重量記為M₁，加水溶解后，加入三氯乙酸溶液，超聲，離心后去除上清液，沉淀用丙酮洗滌、干燥后稱重，重量記為M₂；稱取一定量沉淀干燥物于量瓶中，加入NH₄HCO₃溶液稀釋至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾，續(xù)濾液中加入胰蛋白酶溶液，酶解；

3)將對照品溶液、待檢測復(fù)方阿膠制劑樣品溶液分別放入液質(zhì)聯(lián)用儀，選擇m/z592.2→756.4、655.4、499.3，m/z253.8→312.2、369.2，m/z421.0→684.4、528.3作為檢測離子對進行MRM掃描，其中選擇m/z592.2→756.4、m/z253.8→312.2、m/z421.0→684.4分別作為多肽I、多肽II和多肽III的定量離子對，待檢測阿膠樣品中多肽I的含量記為N₁、多肽II的含量記為N₂、多肽III的含量記為N₃；

4)按下式計算出樣品中阿膠的含量：

復(fù)方阿膠制劑中阿膠的含量(％)＝(N₁/1182.3–N₂/505.5)×840/N₃×M₂/M₁×100％。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的NH₄HCO₃溶液為1％(w/w)pH8.0的NH₄HCO₃溶液。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的對照品溶液的制備包括以下步驟：

1)基質(zhì)溶液的制備：對照品檢測基質(zhì)粉碎后，稱取0.50g的對照品檢測基質(zhì)于250ml量瓶中，加少量1％(w/w)pH8.0的NH₄HCO₃溶液，超聲使樣品完全溶解，用1％(w/w)pH8.0的NH₄HCO₃溶液稀釋至刻度，搖勻；

2)稱取23.1mg的多肽I、9.9mg的多肽II和16.4mg的多肽III于25ml量瓶中，用步驟1)配制的基質(zhì)溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻；

3)對照品溶液的制備：采用分步稀釋的方法，以基質(zhì)溶液為溶劑，分別將對照品母液稀釋500-10⁵倍，微孔濾膜過濾，精密量取續(xù)濾液100μl加2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl，37℃恒溫酶解12h。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的待檢測復(fù)方阿膠制劑樣品溶液的制備包括以下步驟：稱取1～5g的待檢測復(fù)方阿膠制劑樣品，重量記為M₁，用水補足至5ml，加入30％(w/v)的三氯乙酸5ml，震蕩混合，使三氯乙酸的終濃度為15％(w/v)，超聲15min，4℃靜置30min，離心后去除清液，沉淀用丙酮洗滌、干燥后稱重，重量記為M₂，稱取0.05g的沉淀干燥物于25ml量瓶中，加入少量1％(w/w)pH8.0的NH₄HCO₃溶液溶解后，用1％(w/w)pH8.0的NH₄HCO₃溶液稀釋至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾，精密量取續(xù)濾液100μl加2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl，37℃恒溫酶解12h。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟3)中液質(zhì)聯(lián)用儀檢測的液相條件為：C₁₈反相色譜柱，流動相A為含有0.1％(v/v)甲酸的水溶液，流動相B為含有0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液，流速0.3ml/min；梯度洗脫：0→20min，流動相A 100％→25％，流動相B 0％→75％。質(zhì)譜條件：電噴霧正離子模式(ESI⁺)進行多反應(yīng)監(jiān)測。

更進一步的，本發(fā)明還提出了所述的組合物及其試劑盒在檢測復(fù)方阿膠制劑中阿膠含量中的應(yīng)用。

阿膠復(fù)方制劑的成分較阿膠更為復(fù)雜，因此對阿膠復(fù)方制劑中阿膠進行含量檢測，其難度比單純的阿膠中檢測更大。這不但要找出能標(biāo)志驢皮源成分且在不同工藝的阿膠中含量相對穩(wěn)定的物質(zhì)，去除與驢親緣關(guān)系較近的馬、騾等的偽品成分；還要考慮檢測信號的穩(wěn)定性，滿足在檢測時具有較高的信號響應(yīng)、較低的噪音及其他物質(zhì)干擾等。這些都需要創(chuàng)新性的工作。對此，本發(fā)明通過選取驢皮源性特征性多肽，并采用多肽I的檢測值減去多肽II的檢測值，并利用多肽III的檢測值來修正檢測偏差，從而實現(xiàn)對阿膠復(fù)方制劑中驢皮源成分的含量檢測。實驗證明，采用本發(fā)明的方法，能夠準(zhǔn)確地檢測阿膠復(fù)方制劑中驢皮源成分的含量，且操作簡單，在阿膠復(fù)方制劑質(zhì)量監(jiān)控領(lǐng)域?qū)⒕哂袕V泛的應(yīng)用前景。

附圖說明

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步的詳細(xì)描述，其中：

圖1是對照品溶液MRM掃描模式下選擇離子對m/z592.2→756.4、m/z253.8→312.2、m/z421.0→684.4監(jiān)測的質(zhì)譜圖。

圖2是復(fù)方阿膠制劑樣品及其偽品在MRM掃描模式下選擇離子對m/z592.2→756.4、m/z253.8→312.2、m/z421.0→684.4監(jiān)測的質(zhì)譜圖。

具體實施方式

以下將參照附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實例進行詳細(xì)描述。優(yōu)選實例中沒有注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或制造廠商所建議的條件進行。

實施例1

1材料和試劑

1)材料

各種純品膠，包括阿膠、馬皮膠、黃明膠、豬皮膠、羊皮膠，魚皮膠(對照品檢測基質(zhì))，分別用驢皮、馬皮、牛皮、豬皮、羊皮以及魚皮煎煮、濃縮、干燥后獲得。

多肽I(SEQ ID NO.1所示)、多肽II(SEQ ID NO.2所示)、多肽III(SEQ ID NO.3所示)，交由生物公司合成。

復(fù)方阿膠制劑樣品：用復(fù)方阿膠漿生產(chǎn)工序中的植物藥材提取濃縮溶液，分別加入上述純品膠，按照每9g植物藥材提取濃縮溶液加入1.0g純品膠樣品制成含有阿膠的復(fù)方阿膠漿(制劑1)、含有馬皮膠的復(fù)方阿膠漿偽品(制劑2)、含有黃明膠的復(fù)方阿膠漿偽品(制劑3)、含有豬皮膠的復(fù)方阿膠漿偽品(制劑4)、含有羊皮膠的復(fù)方阿膠漿偽品(制劑5)。

2)試劑

碳酸氫銨(分析純)、胰蛋白酶(序列純)

2檢測方法

1)基質(zhì)溶液的制備：稱取0.50g對照品檢測基質(zhì)于250ml量瓶中，加少量1％的NH₄HCO₃溶液(pH8.0)，超聲使樣品完全溶解，用1％NH₄HCO₃溶液(pH8.0)稀釋至刻度，搖勻。

2)對照品母液的制備：稱取23.1mg的多肽I、9.9mg的多肽II和16.4mg的多肽III于25ml量瓶中，用上述配制的基質(zhì)溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻。

3)對照品溶液的制備：采用分步稀釋的方法，以基質(zhì)溶液為溶劑，將對照品母液稀釋1000倍，微孔濾膜過濾，精密量取續(xù)濾液100μl加2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl，37℃恒溫酶解12h。

4)復(fù)方阿膠制劑樣品溶液的制備：稱取5g(重量記為M₁)的待檢測復(fù)方阿膠制劑樣品，用水補足至5ml，加入30％(w/v)的三氯乙酸5ml，震蕩混合，使三氯乙酸的終濃度為15％(w/v)，超聲15min，4℃靜置30min，離心后去除清液，沉淀用丙酮洗滌、干燥后稱重(重量記為M₂)，稱取0.05g的沉淀干燥物于25ml量瓶中，加入少量1％的NH₄HCO₃溶液(pH8.0)溶解后，用1％的NH₄HCO₃溶液(pH8.0)稀釋至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾，精密量取續(xù)濾液100μl加2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl，37℃恒溫酶解12h；

5)檢測：分別取對照品溶液、待檢測復(fù)方阿膠制劑樣品溶液各5μl放入液質(zhì)聯(lián)用儀進行檢測。液相條件：C₁₈反相色譜柱(2.1mm×100mm，1.8μm)，流動相A為0.1％甲酸的水溶液，流動相B為0.1％甲酸的乙腈溶液，流速0.3ml/min；梯度洗脫：0→20min，流動相A 100％→25％，流動相B 0％→75％。質(zhì)譜條件：電噴霧正離子模式(ESI⁺)進行多反應(yīng)監(jiān)測，選擇m/z592.2→756.4、655.4、499.3，m/z253.8→312.2、369.2，m/z421.0→684.4、528.3作為檢測離子對進行MRM掃描，其中選擇m/z592.2→756.4、m/z253.8→312.2、m/z421.0→684.4分別作為多肽I、多肽II和多肽III的定量離子對。

6)計算出樣品中阿膠的含量：

圖1是對照品溶液MRM掃描模式下選擇離子對m/z592.2→756.4、m/z253.8→312.2、m/z421.0→684.4監(jiān)測的質(zhì)譜圖。圖2是復(fù)方阿膠制劑及其偽品在MRM掃描模式下選擇離子對m/z592.2→756.4、m/z253.8→312.2、m/z421.0→684.4監(jiān)測的質(zhì)譜圖。

通過將對照品與復(fù)方阿膠制劑樣品及其偽品的質(zhì)譜圖峰面積比對，計算出復(fù)方阿膠制劑樣品及其偽品中多肽I、多肽II和多肽III的含量，待檢測阿膠樣品中多肽I的含量記為N₁、多肽II的含量記為N₂、多肽III的含量記為N₃；然后，按下式計算出各樣品中阿膠的含量：

樣品中阿膠的含量(％)＝(N₁/1182.3–N₂/505.5)×840/N₃×M₂/M₁×100％。

制劑1中阿膠的含量(％)＝(N₁/1182.3–N₂/505.5)×840/N₃×M₂/M₁×100％＝(0.3245/1182.3–0/505.5)×840/0.2319×0.5209/5.0810×100％＝10.19％

制劑2中阿膠的含量(％)＝(N₁/1182.3–N₂/505.5)×840/N₃×M₂/M₁×100％＝(0.3212/1182.3–0.1388/505.5)×840/0.2331×0.5493/5.0415×100％＝-0.11％≈0％

制劑3中阿膠的含量(％)＝(N₁/1182.3–N₂/505.5)×840/N₃×M₂/M₁×100％＝(0/1182.3–0/505.5)×840/0.2322×0.5581/5.0370×100％＝0％

制劑4中阿膠的含量(％)＝(N₁/1182.3–N₂/505.5)×840/N₃×M₂/M₁×100％＝(0/1182.3–0/505.5)×840/0.2306×0.5260/5.0561×100％＝0％

制劑5中阿膠的含量(％)＝(N₁/1182.3–N₂/505.5)×840/N₃×M₂/M₁×100％＝(0/1182.3–0/505.5)×840/0.2352×0.0.5144/5.0505×100％＝0％

上述計算結(jié)果表明：含有阿膠的復(fù)方阿膠漿樣品中檢測的阿膠含量與加入量相符，而不含阿膠的復(fù)方阿膠漿偽品中檢測的阿膠含量為0％，這與實際情況相符，表明該方法能檢測阿膠復(fù)方制劑中的阿膠含量。

實施例2

1材料和試劑

1)材料

多肽I(SEQ ID NO.1所示)、多肽II(SEQ ID NO.2所示)、多肽III(SEQ ID NO.3所示)，交由生物公司合成。

混合膠樣品由實施例1中的純品膠樣品分別加入不同質(zhì)量的阿膠制成，包括含15％阿膠的黃明膠、含30％阿膠的黃明膠、含60％阿膠的黃明膠。

復(fù)方阿膠制劑樣品：用復(fù)方阿膠漿生產(chǎn)工序中的植物藥材提取濃縮溶液，分別加入上述混合膠樣品，按照每9g植物藥材提取濃縮溶液加入1.0g混合膠樣品制成3個復(fù)方阿膠漿偽品，分別命名為制劑1、制劑2、制劑3，阿膠含量分別為1.5％、3.0％、6.0％。

2)試劑

碳酸氫銨(分析純)、胰蛋白酶(序列純)

2檢測方法

1)基質(zhì)溶液的制備：稱取0.50g對照品檢測基質(zhì)于250ml量瓶中，加少量1％的NH₄HCO₃溶液(pH8.0)，超聲使樣品完全溶解，用1％NH₄HCO₃溶液(pH8.0)稀釋至刻度，搖勻。

2)對照品母液的制備：稱取23.1mg的多肽I、9.9mg的多肽II和16.4mg的多肽III于25ml量瓶中，用上述配制的基質(zhì)溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻。

3)對照品溶液的制備：采用分步稀釋的方法，以基質(zhì)溶液為溶劑，將對照品母液分別稀釋500倍、1000倍、2000倍、4000倍、8000倍、10000倍，微孔濾膜過濾，精密量取續(xù)濾液100μl加2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl，37℃恒溫酶解12h。

4)復(fù)方阿膠制劑樣品溶液的制備：稱取5g(重量記為M₁)的待檢測復(fù)方阿膠制劑樣品，用水補足至5ml，加入30％(w/v)的三氯乙酸5ml，震蕩混合，使三氯乙酸的終濃度為15％(w/v)，超聲15min，4℃靜置30min，離心后去除清液，沉淀用丙酮洗滌、干燥后稱重(重量記為M₂)，稱取0.05g的沉淀干燥物于25ml量瓶中，加入少量1％的NH₄HCO₃溶液(pH8.0)溶解后，用1％的NH₄HCO₃溶液(pH8.0)稀釋至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾，精密量取續(xù)濾液100μl加2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl，37℃恒溫酶解12h；

5)檢測：分別取對照品溶液、待檢測樣品溶液各5μl放入液質(zhì)聯(lián)用儀進行檢測。液相條件：C₁₈反相色譜柱(2.1mm×100mm，1.8μm)，流動相A為0.1％甲酸的水溶液，流動相B為0.1％甲酸的乙腈溶液，流速0.3ml/min；梯度洗脫：0→20min，流動相A 100％→25％，流動相B 0％→75％。質(zhì)譜條件：電噴霧正離子模式(ESI⁺)進行多反應(yīng)監(jiān)測，選擇m/z592.2→756.4、655.4、499.3，m/z253.8→312.2、369.2，m/z421.0→684.4、528.3作為檢測離子對進行MRM掃描，其中選擇m/z592.2→756.4、m/z253.8→312.2、m/z421.0→684.4分別作為多肽I、多肽II和多肽III的定量離子對。

6)樣品中驢皮源成分含量的計算

以對照品溶液的各多肽的含量為縱坐標(biāo)、峰面積為橫坐標(biāo)進行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，各多肽的線性相關(guān)系數(shù)R≥0.998，由此計算出復(fù)方阿膠制劑樣品中多肽I、多肽II和多肽III的含量，待檢測復(fù)方阿膠制劑樣品中多肽I的含量記為N₁、多肽II的含量記為N₂、多肽III的含量記為N₃，然后，按下式計算出各樣品中阿膠的含量：

樣品中阿膠的含量(％)＝(N₁/1182.3–N₂/505.5)×840/N₃×M₂/M₁×100％。

制劑1中阿膠的含量(％)＝(N₁/1182.3–N₂/505.5)×840/N₃×M₂/M₁×100％＝(0.0496/1182.3–0/505.5)×840/0.2341×0.5065/5.0521×100％＝1.51％

制劑2中阿膠的含量(％)＝(N₁/1182.3–N₂/505.5)×840/N₃×M₂/M₁×100％＝(0.0992/1182.3–0/505.5)×840/0.2413×0.5256/5.0535×100％＝3.04％

制劑3中阿膠的含量(％)＝(N₁/1182.3–N₂/505.5)×840/N₃×M₂/M₁×100％＝(0.1968/1182.3–0/505.5)×840/0.2398×0.5116/5.0445×100％＝5.91％

上述計算結(jié)果表明：利用本發(fā)明公開的三個多肽以及對照品檢測基質(zhì)，采用液質(zhì)聯(lián)用儀，能準(zhǔn)確檢測阿膠復(fù)方制劑中阿膠的含量。

需要說明的是，以上實施例僅用以說明發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過參照本發(fā)明的優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進行了描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員對本發(fā)明作的各種改動或修改而不背離本發(fā)明的精神與范圍，這些等價形式同樣落在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

序列表

<110> 東阿阿膠股份有限公司

<120> 用于檢測復(fù)方阿膠制劑中阿膠含量的組合物、試劑盒及其檢測方法

<130> KLPI161261

<160> 3

<170> PatentIn 3.5

<210> 1

<211> 13

<212> PRT

<213> 多肽I

<400> 1

Ser Gly Gln Pro Gly Thr Val Gly Pro Ala Gly Val Arg

<210> 2

<211> 4

<212> PRT

<213> 多肽II

<400> 2

His Gly His Arg

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 多肽III

<400> 3

Gly Val Val Gly Pro Gln Gly Ala Arg