本發(fā)明屬于化學檢測領域，尤其是一種ASE-HPLC法測定卷柏中穗花雙黃酮含量的方法。

背景技術：

2015年版藥典方法：取本品粉末(過三號篩)約0.2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50ml，稱定重量，加熱回流5小時，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

該方法的回流時間較長，對技術人員的專業(yè)水平較高。

技術實現(xiàn)要素：

針對上述不足，本發(fā)明旨在提供一種ASE-HPLC法測定卷柏中穗花雙黃酮含量的方法，該方法萃取時間短、且檢測精度高。

為了實現(xiàn)上述技術效果，本發(fā)明提供的技術方案是這樣的：一種ASE-HPLC法測定卷柏中穗花雙黃酮含量的方法，依次包括下述步驟：

步驟1：采用ASE法萃取卷柏粉末，并收集甲醇萃取液；

步驟2：采用HPLC法測定甲醇萃取液中的穗花雙黃酮含量。

優(yōu)選地，所述的步驟1包括下述子步驟：

步驟S1：將卷柏樣品粉碎，過三號篩，取0.2g與1g硅藻土混合；

步驟S2：將步驟S1所得的混合物裝于放有濾膜的ASE萃取池中，加硅藻土至與池口平行；

步驟S3：用甲醇萃取，結束后用甲醇定容至25ml，離心，去上清液。

優(yōu)選地，步驟S3所述的ASE萃取條件：壓力為1500psi、溫度為110℃，時間為5min，次數(shù)為2次，沖洗體積為80％，吹掃時間為80％。

優(yōu)選地，所述的HPLC法的檢測參數(shù)為：色譜柱為Thermo Syncronis C18；柱溫為40℃；流速為0.5mL/min；流動相為甲醇-0.1％磷酸；檢測波長為330nm。

優(yōu)選地，步驟S3所述的離心步驟的參數(shù)為：離心速度為15000r/min，離心時間為3min。

優(yōu)選地，步驟S2所述的ASE萃取池的體積為5ml。

優(yōu)選地，所述的色譜柱的規(guī)格為3*100mm，3μm。

優(yōu)選地，所述的流動相為體積比等于55：45的甲醇-0.1％磷酸。

本發(fā)明與傳統(tǒng)方法相比，具有以下優(yōu)點：

本發(fā)明曾對快速溶劑萃取使用的溶劑進行考察，《中國藥典》使用甲醇回流5小時。本實驗選用甲醇、乙醇、乙腈作為提取溶劑進行了溶劑考察，結果顯示甲醇提取后穗花杉雙黃酮含量最高，故采用與藥典一致的提取溶劑甲醇。

ASE提取原理如下所示：A:提高溫度降低溶劑的黏度，減少溶劑進入樣品基體的阻止，增加了溶劑進入樣品基體的擴散，降低溶劑和樣品基體之間的表面張力，使溶劑溶解待測物的容量增加；B:萃取液體的沸點隨壓力升高而提高，從而使溶劑在高溫高壓下仍保持在液態(tài)(液體對溶質的溶解能力遠大于氣體對溶質的溶解能力)。

我們經(jīng)過正交試驗選擇采用110℃，提取5min，提取3次，即可達到與藥典含量接近，更多的提取時間、溫度、次數(shù)對結果已經(jīng)無明顯影響。最終確定最佳提取工藝組合為提取溫度110℃，提取時間5min，提取次數(shù)3次。

附圖說明

圖1為穗花雙黃酮對照品和采用ASE法萃取所得的樣品溶液的色譜圖；

圖2為采用藥典方法提取所得的樣品溶液的色譜圖。

具體實施方式

下面結合具體實施方式，對本發(fā)明的權利要求做進一步的詳細說明，但不構成對本發(fā)明的任何限制，任何在本發(fā)明權利要求保護范圍內所做的有限次修改、仍在本發(fā)明的權利要求保護范圍之內。

實施例1

1、儀器設備及試劑

1.1儀器：

電子分析天平(XA205DU)、ASE350快速溶劑萃取儀(美國DIONEX公司)、Thermo U3000UHPLC液相色譜儀

1.2試劑：

水：符合GB/T 6682規(guī)定的一級水；

甲醇：色譜純；

硅藻土：2mm；

2、方法

2.1對照品溶液的制備

取穗花雙黃酮對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含25μg的溶液，即得。

2.2供試品溶液的制備

2015年版藥典方法：取本品粉末(過三號篩)約0.2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50ml，稱定重量，加熱回流5小時，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

快速溶劑萃取法(ASE)制備供試品方法：樣品經(jīng)粉碎機粉碎，過三號篩，約0.2g，精密稱定，與1g硅藻土混合均勻，待用，移入到預先放好過濾膜的ASE5ml萃取池中再加入適量硅藻土，輕輕振搖使之與池口在同一水平線上，擰緊萃取池上蓋。萃取結束后，把萃取液轉移于25ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，在15000r/min下離心3min，取上清液，進入HPLC測定。

2.3 ASE萃取條件：壓力為1500psi、溫度為110℃，時間為5min，次數(shù)為2次，沖洗體積為80％，吹掃時間為80％。

2.4色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

a)儀器：Thermo雙三元液相(U-3000)；

b)色譜柱：Thermo Syncronis C18，3*100mm 3μm；

c)柱溫：40℃；

d)流速：0.5mL/min；

e)流動相：：甲醇-0.1％磷酸(55:45)；

f)檢測波長：330nm；

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；理論板數(shù)按穗花杉雙黃酮峰計算應不低于3000。

2.5測定法

照高效液相色譜法(通則0512)測定

分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各2μl，注入液相色譜儀，測定，即得。

2.6標準限值要求

本品按干燥品計算，含穗花杉雙黃酮(C₃₀H₁₈O₁₀)不得少于0.30％。

2.7計算(外標法)

式中C_R——對照品溶液濃度，單位為微克每升(mg/L)；

A_X——供試品的峰面積；

A_R——對照品峰面積。

注意：

使用前萃取池底部應拆卸清理干凈，否則容易引起壓力不穩(wěn)；

萃取池底部的濾紙應在密封圈內，否則引起滲漏；

萃取池裝樣時松緊適中，太松容易導致提取液過多；

開機前檢查氣瓶氣壓是否達到1Mpa；

使用結束后清理干凈，萃取池要及時晾干(容易生銹)。

3、結果

3.1線性關系

取取穗花杉雙黃酮對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含25μg的溶液，即得，然后分別精密吸取該溶液0.1μl、0.2μl、0.5μl、1μl、2μl進入LC測定，并依照上述方法測定，結果詳見表1。

以濃度(μg/ml)-峰面積進行線性回歸，求得回歸方程：y＝17.132x+9.1974，R²＝0.99998。穗花杉雙黃酮在2.7～53.9μg/ml范圍內呈良好的線性關系。

表1線性試驗結果

3.2重現(xiàn)性試驗

取相同批號的樣品(批號：1409122廣西)0.2g，共3份，精密稱定，按ASE提取方法提取供試品溶液，進樣量為1μL，以上述的色譜條件平行試驗，測得樣品中穗花杉雙黃酮的含量見表2，RSD為2.70％，結果表明ASE提取方法重復性良好。

表2

3.3樣品含量測定結果(4批)

表3

3.4色譜圖

圖1為穗花雙黃酮對照品和采用ASE法萃取所得的樣品溶液的色譜圖；其中，上面為穗花雙黃酮對照品的色譜圖，下面為采用ASE法萃取所得的樣品溶液的色譜圖。

圖2為采用藥典方法提取所得的樣品溶液的色譜圖。

其中在圖1、圖2中，穗花雙黃酮的保留時間：7.818min。

4、討論：

4.1 ASE提取溶劑的選擇：

本發(fā)明曾對快速溶劑萃取使用的溶劑進行考察，《中國藥典》使用甲醇回流5小時。本實驗選用甲醇、乙醇、乙腈作為提取溶劑進行了溶劑考察，結果顯示甲醇提取后穗花杉雙黃酮含量最高，故采用與藥典一致的提取溶劑甲醇。

4.2 ASE提取條件的優(yōu)化

甲醇的熔沸點較高，快速溶劑萃取(以下簡稱ASE)提取原理：A:提高溫度降低溶劑的黏度，減少溶劑進入樣品基體的阻止，增加了溶劑進入樣品基體的擴散，降低溶劑和樣品基體之間的表面張力，使溶劑溶解待測物的容量增加；B:萃取液體的沸點隨壓力升高而提高，從而使溶劑在高溫高壓下仍保持在液態(tài)(液體對溶質的溶解能力遠大于氣體對溶質的溶解能力)。我們經(jīng)過正交試驗選擇采用110℃，提取5min，提取3次，即可達到與藥典含量接近，更多的提取時間、溫度、次數(shù)對結果已經(jīng)無明顯影響。最終確定最佳提取工藝組合為提取溫度110℃，提取時間5min，提取次數(shù)3次。

以上所述的僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡在本發(fā)明的精神和原則范圍內所做的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍內。