本發(fā)明屬于生物傳感器技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及基于高濃度鹽溶液下金納米的聚沉構(gòu)建的化學(xué)生物傳感器、制備方法及應(yīng)用；實現(xiàn)對avidin的靈敏檢測。

背景技術(shù)：

抗生物素蛋白(avidin)是一種廣泛存在于生蛋清中的一種堿性糖蛋白，第一次被發(fā)現(xiàn)在20世紀(jì)上半期?？股锼氐鞍自诎┌Y的治療過程中起著重要的作用，如腫瘤細胞的定位和成像。

隨著研究的深入，由于其抗菌活性和殺蟲技能，抗生物素蛋白被廣泛用于基于工程，這可能會導(dǎo)致抗生物素蛋白的殘留。生物素(biotin)作為一種水溶性維生素，是正常代謝和重要的生化過程所必需的。抗生物素蛋白-生物素之間的締合常數(shù)K＝10^-15，是最大的蛋白質(zhì)和小分子之間的非共價鍵相互作用之一。近幾十年里，這種復(fù)合物的穩(wěn)定性已被應(yīng)用于許多系統(tǒng)中?？股锼氐鞍?生物素系統(tǒng)在免疫組化、免疫細胞/組織工程和生物傳感應(yīng)用等中的應(yīng)用具有重要的意義。

然而，過量的抗生物素蛋白的殘留會導(dǎo)致生物素營養(yǎng)不良。因此，檢測avidin的含量是非常重要的。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供基于高濃度鹽溶液下金納米的聚沉構(gòu)建的化學(xué)生物傳感器及其制備方法，將biotin標(biāo)記在DNA單鏈上并和avidin結(jié)合對DNA單鏈起保護作用，由于單鏈DNA和AuNPs之間的相互作用，使得AuNPs在高鹽濃度下不發(fā)生聚沉。

本發(fā)明還提供了基于高濃度鹽溶液下金納米的聚沉構(gòu)建的化學(xué)生物傳感器可視化檢測avidin的應(yīng)用，具有高靈敏性、特異性、穩(wěn)定性。

本發(fā)明提供的基于高濃度鹽溶液下金納米的聚沉構(gòu)建的化學(xué)生物傳感器的制備方法，包括以下步驟：

1)、將抗生素蛋白avidin溶液和biotin-ssDNA溶液混合在PBS緩沖液中，培養(yǎng)，使avidin與biotin-ssDNA結(jié)合，對DNA單鏈起保護作用；

2)將Exo I剪切酶加入步驟1)培養(yǎng)后的溶液中，加熱反應(yīng)，然后冷卻至室溫；

3)室溫下，將AuNPs加入步驟2)得到的冷卻后的反應(yīng)液中反應(yīng)，最后加入NaCl溶液，利用AuNPs在高鹽濃度下發(fā)生聚沉而使溶液顏色變化，制備得到化學(xué)生物傳感器。

步驟1)之前制備抗生素蛋白avidin溶液：將購買的抗生素蛋白avidin用二次水溶解，濃度為1μM，4℃下保存?zhèn)溆茫?/p>

步驟1)之前制備biotin-ssDNA溶液：將購買的biotin-ssDNA用二次水溶解，濃度為2μM，4℃下保存?zhèn)溆?；biotin-ssDNA序列為5-CCCTCTATCTATCTCTCTCTCTCTCACTTA-biotin-3。

步驟1)中所述PBS緩沖液濃度為0.05M；

步驟1)中所述培養(yǎng)具體為：在30～37℃下反應(yīng)20-30min；

步驟1)具體為：將30μL 1μM的抗生素蛋白avidin溶液和30μL 2μM biotin-ssDNA溶液混合在40μL PBS緩沖液中，在30～37℃下反應(yīng)20-30min。

步驟2)中所述加熱反應(yīng)具體為：先在30～37℃下反應(yīng)20min后，再85～95℃熱水浴20-30min。

先在30～37℃下反應(yīng)20min，目的是使Exo I剪切酶水解DNA，然后再85～95℃熱水浴20min目的是使Exo I剪切酶失活，以免影響后續(xù)檢測。

步驟2)具體為：將10U Exo I剪切酶加入步驟1)培養(yǎng)后的溶液中，在37℃下反應(yīng)20min后，85℃熱水浴，熱水浴20min后拿出冷卻至室溫。

步驟3)中AnNPs制備方法為：加熱50mL，1mg/mL的HAuCl₄溶液直至沸騰，然后將2mL 1mg/mL檸檬酸鈉溶液迅速加入煮沸的HAuCl₄溶液中，劇烈攪拌，直至溶液顏色變成深紅色，再加熱30min，然后停止加熱并冷卻至室溫，后裝入容量瓶備用。所有參與反應(yīng)的玻璃儀器及轉(zhuǎn)子均在王水中浸泡12h以上。

步驟3)中NaCl溶液溶度大于0.12M，優(yōu)選的為：0.2M。

步驟3)具體為：將200μL AuNPs加入步驟2)得到的冷卻后的反應(yīng)液中反應(yīng)10min，最后加入120μL 0.2M的NaCl溶液，利用AuNPs在高鹽濃度下發(fā)生聚沉而使溶液顏色變化，制備得到化學(xué)生物傳感器。

本發(fā)明提供的一種基于高濃度鹽溶液下金納米的聚沉構(gòu)建的化學(xué)生物傳感器，采用上述方法制備得到。

本發(fā)明提供的基于高濃度鹽溶液下金納米的聚沉構(gòu)建的化學(xué)生物傳感器用于檢測抗生素蛋白avidin；

具體檢測方法為：將biotin標(biāo)記在DNA單鏈上并和avidin結(jié)合構(gòu)建末端保護體系對DNA單鏈起保護作用，保護DNA不被Exo I剪切酶水解，由于單鏈DNA和AuNPs之間的相互作用，使得AuNPs在高鹽濃度下不發(fā)生聚沉，不同濃度的avidin溶液，體系顏色不同，吸光度不同，實現(xiàn)對不同濃度的avidin定量檢測。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明利用高鹽濃度下會使AuNPs發(fā)生聚沉，溶液顏色由酒紅色變成灰藍色的原理，將biotin標(biāo)記在DNA單鏈上并和avidin結(jié)合對DNA單鏈起保護作用，由于單鏈DNA和AuNPs之間的相互作用，使得AuNPs在高鹽濃度下不發(fā)生聚沉，不同濃度的avidin溶液，顏色不同。基于此機理制備生物傳感器，線性范圍為10-180ng/mL,檢測限為0.004μg/mL。此傳感器實現(xiàn)了對avidin靈敏性、特異性、穩(wěn)定性的檢測。

附圖說明

圖1為基于高鹽濃度下AuNPs的聚沉和DNA的末端保護作用可視化檢測抗生物素蛋白avidin的實驗原理圖；

圖2為檢測avidin的可行性分析圖，曲線a為不存在avidin時溶液的紫外吸收曲線，曲線b為存在avidin時溶液的紫外吸收曲線；

圖3為NaCl濃度對本實驗的影響圖；

圖4為Exo I剪切酶對本實驗的影響圖；

圖5為avidin和biotin的反應(yīng)時間對本實驗的影響圖；

圖6為avidin和biotin的反應(yīng)溫度對本實驗的影響圖；

圖7為不同濃度的avidin對本實驗的影響圖；

從上到下濃度分別為10ng/mL，20ng/mL，40ng/mL，60ng/mL，80ng/mL，100ng/mL，120ng/mL，140ng/mL，160ng/mL，180ng/mL和200ng/mL的avidin的紫外光譜圖；

圖8為不同濃度下吸光度的線性關(guān)系；

圖9為該方法對lysozyme,trypase,thrombin,BSA和avidin的選擇性對比圖。

具體實施方式

實施例1

基于高濃度鹽溶液下金納米的聚沉構(gòu)建的化學(xué)生物傳感器的制備方法，包括以下步驟：

A、制備抗生素蛋白avidin溶液：將購買的抗生素蛋白avidin用二次水溶解，濃度為1μM，4℃下保存?zhèn)溆?；制備biotin-ssDNA溶液：將購買的biotin-ssDNA用二次水溶解，濃度為2μM，4℃下保存?zhèn)溆?；制備濃度?.05M PBS緩沖液濃度，4℃下保存?zhèn)溆茫?/p>

B、將30μL抗生素蛋白avidin溶液和30μL biotin-ssDNA溶液混合在40μL PBS緩沖液中，在37℃下反應(yīng)0.5h；

C、將10U Exo I剪切酶加入步驟1)培養(yǎng)后的溶液中，在37℃下反應(yīng)20min后，85℃熱水浴，熱水浴20min后拿出冷卻至室溫；

D、將200μL AuNPs加入步驟2)得到的冷卻后的反應(yīng)液中反應(yīng)10min，最后加入120μL NaCl溶液，利用AuNPs在高鹽濃度下發(fā)生聚沉而使溶液顏色變化，制備得到化學(xué)生物傳感器。

與實施例1相同的實驗條件下，不加入avidin溶液，分別測量2個體系的紫外吸收曲線，結(jié)果如圖2所示。

實施例2

利用上述制備的傳感器檢測avidin的濃度：

A、制備抗生素蛋白avidin溶液：將購買的抗生素蛋白avidin用二次水溶解，濃度為1μM，4℃下保存?zhèn)溆茫恢苽鋌iotin-ssDNA溶液：將購買的biotin-ssDNA用二次水溶解，濃度為2μM，4℃下保存?zhèn)溆?；制備濃度?.05M PBS緩沖液濃度，4℃下保存?zhèn)溆茫?/p>

B、分別將不同濃度的抗生素蛋白avidin溶液和30μL biotin-ssDNA溶液混合在40μL PBS緩沖液中，此時，抗生素蛋白avidin的濃度分別為10ng/mL，20ng/mL，40ng/mL，60ng/mL，80ng/mL，100ng/mL，120ng/mL，140ng/mL，160ng/mL，180ng/mL和200ng/mL，在37℃下反應(yīng)0.5h；

C、將10U Exo I剪切酶加入步驟1)培養(yǎng)后的溶液中，在37℃下反應(yīng)20min后，85～95℃熱水浴，熱水浴20min后拿出冷卻至室溫；

D、將200μL AuNPs加入步驟2)得到的冷卻后的反應(yīng)液中反應(yīng)10min，最后加入120μL NaCl溶液，利用AuNPs在高鹽濃度下發(fā)生聚沉而使溶液顏色變化，測得的吸光度與avidin濃度建立線性關(guān)系(圖7和圖8)，然后相同條件下實驗，測量未知濃度的avidin體系的吸光度，根據(jù)建立的線性關(guān)系得avidin濃度。

實施例3

改變NaCl濃度，其他步驟同實施例1，NaCl濃度對本實驗的影如圖3；

改變Exo I剪切酶用量，其他步驟同實施例1，Exo I剪切酶用量度對本實驗的影如圖4；

改變avidin和biotin的反應(yīng)時間，其他步驟同實施例1，avidin和biotin的反應(yīng)時間對本實驗的影如圖5；

改變avidin和biotin的反應(yīng)溫度，其他步驟同實施例1，avidin和biotin的反應(yīng)溫度對本實驗的影如圖6；

實施例4

將檢測對象avidin分別改為lysozyme,trypase,thrombin,BSA，檢測條件不變，本發(fā)明檢測方法對lysozyme,trypase,thrombin,BSA和avidin的選擇性對比如圖9。