本發(fā)明涉及中藥制劑的質(zhì)量控制領(lǐng)域，特別涉及中藥組合物三藤膠囊的含量檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
三藤膠囊主要用于治療各型紅斑狼瘡等疾病。該制劑組方合理、治療病癥明確、不良反應(yīng)小。三藤膠囊作為中藥雷公藤復(fù)方制劑，具有體積小、用量小、療效高、副作用小，服用方便和質(zhì)量穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。
三藤膠囊是由雷公藤100g、紅藤100g、雞血藤100g組方。以上3味，加6倍量90％乙醇，回流提取2小時(shí)，濾過，濾液回收乙醇，濃縮至密度為1.24～1.26，加入糊精，混合，80℃干燥，得三藤干粉，裝入0號(hào)膠囊內(nèi)，即得三藤膠囊。本品為硬膠囊劑，除去膠囊殼后顯黃褐色至棕褐色；氣香，味微苦。功能主治：活血化瘀，治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡。
三藤膠囊系由院內(nèi)制劑“三藤合劑”改劑型而得。原三藤合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)只有鑒別，無含量測(cè)定。該膠囊劑采用主要有效成分雷公藤酯甲(Wilforlide A)作為含量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)品。雷公藤酯甲藥理研究證明有免疫抑制作用。原劑型三藤合劑由于是水煎劑，成分比三藤膠囊更復(fù)雜，經(jīng)采用高效液相法測(cè)定含量，雷公藤酯甲含量很低或測(cè)不到，因此對(duì)原劑型改劑型為膠囊劑，采用乙醇提取，可以提高雷公藤酯甲的含量，使三藤膠囊中雷公藤酯甲的含量每粒不低于0.046mg。因此需要一種三藤膠囊的含量檢測(cè)方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于克服上述缺點(diǎn)而提供的一種安全、檢測(cè)準(zhǔn)確性高的三藤膠囊的含量檢測(cè)方法。
本發(fā)明的一種中藥組合物三藤膠囊的含量檢測(cè)方法，所述三藤膠囊由雷公藤、紅藤和雞血藤組方，所述檢測(cè)方法包括如下步驟：
照高效液相色譜法(中國(guó)藥典2010年版一部附錄VI D)測(cè)定。
步驟A、色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以水(A)-乙腈(B)為流動(dòng)相梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm。理論板數(shù)按雷公藤酯甲計(jì)不低于3000。
步驟B、對(duì)照品溶液的制備：取雷公藤酯甲對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含0.34mg的溶液，即得；
步驟C、供試品溶液的制備：取三藤膠囊10粒，倒出內(nèi)容物，混勻，精密稱定1.33g，加氯仿40mL，超聲提取兩次，每次30min，濾紙過濾，殘?jiān)?0mL氯仿洗脫，回收濾液至1mL，加中性氧化鋁(100～200目)1g，攪拌均勻，烘干，上中性氧化鋁柱(100～200目，8g；內(nèi)徑1.5cm×長(zhǎng)度15cm)，用乙酸乙酯100mL洗脫，收集洗脫液并回收至干，加甲醇適量使溶解，置2mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過，即得；
步驟D、測(cè)定法：分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得
本品每粒含雷公藤酯甲(C18H16O8)計(jì)，不得少于0.046mg。
所述三藤膠囊是由雷公藤100g、紅藤100g、雞血藤100g組方，以上3味，加6倍量90％乙醇，回流提取2小時(shí)，濾過，濾液回收乙醇，濃縮至密度為1.24～1.26，加入糊精，混合，80℃干燥，得三藤干粉，裝入0號(hào)膠囊內(nèi)，即得三藤膠囊38粒；本品為硬膠囊劑，除去膠囊殼后顯黃褐色至棕褐色；氣香，味微苦。
所述檢測(cè)方法應(yīng)符合膠囊劑項(xiàng)下的有關(guān)各項(xiàng)規(guī)定。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：原來三藤合劑無含量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，而本品選用對(duì)免疫系統(tǒng)起作用的雷公藤中主要有效成分雷公藤酯甲作為檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，正好與本品的制法和功能主治相符合。因此本品將含測(cè)指標(biāo)成分確定為雷公藤酯甲。從而保證了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。保證用藥的安全性，更好的指導(dǎo)生產(chǎn)，使工藝控制更加嚴(yán)格合理。
具體實(shí)施方式
下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，其目的僅在于更好地理解本發(fā)明的研究?jī)?nèi)容而非限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實(shí)施例：
本發(fā)明的一種中藥組合物三藤膠囊的質(zhì)量(含量)檢測(cè)方法，包括如下步驟：
含量測(cè)定：照高效液相色譜法(中國(guó)藥典2005年版一部附錄VI D)測(cè)定。
步驟A、色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以水(A)-乙腈(B)(0～20min，A：35％，B：65％；20～70min，A：35％→0％，B：65％→100％)為流動(dòng)相，即在0～20min時(shí)間段內(nèi)，流動(dòng)相A設(shè)定為35％，流動(dòng)相B設(shè)定為65％；從20～70min時(shí)間段內(nèi)，為梯度洗脫，流動(dòng)相A設(shè)定為從35％逐漸減少至0％，流動(dòng)相B設(shè)定為從65％逐漸增加至100％；檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm。理論板數(shù)按雷公藤酯甲峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。
步驟B、對(duì)照品溶液的制備：取雷公藤酯甲對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含0.34mg的溶液，即得；
步驟C、供試品溶液的制備：取三藤膠囊10粒，倒出內(nèi)容物，混勻，精密稱定1.33g，加氯仿40mL，超聲提取兩次，每次30min，濾紙過濾，殘?jiān)?0mL氯仿洗脫，回收濾液至1mL，加中性氧化鋁(100～200目)1g，攪拌均勻，烘干，上中性氧化鋁柱(100～200目，8g；內(nèi)徑1.5cm×長(zhǎng)度15cm)，用乙酸乙酯100mL洗脫，收集洗脫液并回收至干，加甲醇適量使溶解，置2mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，0.45νm微孔濾膜濾過，即得。
步驟D、測(cè)定法：分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。
本品每粒含雷公藤酯甲(C18H16O8)不得低于0.046mg。
所述三藤膠囊是由雷公藤100g、紅藤100g、雞血藤100g組方，以上3味，加6倍量90％乙醇，回流提取2小時(shí)，濾過，濾液回收乙醇，濃縮至密度為1.24～1.26，加入糊精，混合，80℃干燥，得三藤干粉，裝入0號(hào)膠囊內(nèi)，即得三藤膠囊；本品為硬膠囊劑，除去膠囊殼后顯黃褐色至棕褐色；氣香，味微苦。
所述檢測(cè)方法應(yīng)符合膠囊劑項(xiàng)下的有關(guān)各項(xiàng)規(guī)定。
以下通過試驗(yàn)例來進(jìn)一步說明本發(fā)明的中藥組合物三藤膠囊的質(zhì)量檢測(cè)方法的有益效果：
試驗(yàn)例：
含量測(cè)定按《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版一部附錄VI D高效液相色譜法測(cè)定。
1.儀器、對(duì)照品、試劑和試藥
1.1本發(fā)明使用的儀器：Agilent 1200高效液相系統(tǒng)，包括：G1312A/30型泵，G1314D紫外/可見光檢測(cè)器，G1329A型自動(dòng)進(jìn)樣閥，G1316A/59柱溫箱；ChemStation B.04.02工作站；EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀N1001型(日本東京理化器械株式會(huì)社制)；B2500S-MTH型超聲波清洗儀；AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司制)
1.2對(duì)照品：雷公藤酯甲(Wilforlide A)(111597-200505)，對(duì)照品由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；
1.3試劑：乙腈(色譜純，美國(guó)Merck公司生產(chǎn))；其余試劑均為分析純，試驗(yàn)用水為二次蒸餾水。中性氧化鋁，上海五四化學(xué)試劑廠生產(chǎn)；微孔濾膜，孔徑0.45μm，上海半島實(shí)業(yè)有限公司凈化器材廠生產(chǎn)。
1.4試藥：三藤膠囊樣品是申請(qǐng)人在上海蔡同德堂中藥制藥廠的中試產(chǎn)品。
2.對(duì)照品溶液的制備
稱取雷公藤酯甲(Wilforlide A)對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含0.34mg的溶液，即得。
3.色譜條件試驗(yàn)
分別以甲醇-水，乙腈-水，甲醇-0.04％磷酸或甲醇-乙腈-水系統(tǒng)為流動(dòng)相。經(jīng)試驗(yàn)，采用甲醇-0.04％磷酸和甲醇-乙腈-水系統(tǒng)分離時(shí)，雷公藤酯甲無明顯出峰，甲醇-水系統(tǒng)分離效果不如采用乙腈-水系統(tǒng)。當(dāng)乙腈-水梯度洗脫，流速為1ml/min，柱溫為30℃時(shí)，供試品色譜峰分離度符合要求，保留時(shí)間合適。雷公藤酯甲峰與其它峰之間有良好的分離，且峰形好、柱效高，表明該流動(dòng)相及相關(guān)色譜條件可作為本實(shí)驗(yàn)的色譜條件。確定如下色譜條件：
色譜柱：Phenomenex Hyper Clore BDS-C18(4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相：水(A)-乙腈(B)(0～20min，A：35％，B：65％；20～70min，A：35％→0％，B：65％→100％)；流速：1ml·min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm；進(jìn)樣量：10μl；
依照上述色譜條件測(cè)定，理論塔板數(shù)按雷公藤酯甲計(jì)不低于3000。
4.供試品溶液的制備選擇
4.1提取方法考察
考察回流和超聲2種提取方法對(duì)雷公藤酯甲的提取程度，結(jié)果顯示超聲提取和回流提取的程度一樣，超聲提取簡(jiǎn)單易操作，選擇超聲提取。
4.2提取溶劑考察
分別選擇乙酸乙酯，氯仿，甲醇為提取溶劑，采用超聲方法，結(jié)果顯示氯仿提取時(shí)，雷公藤酯甲含量最高，雜質(zhì)較少，因此選擇氯仿提取。
4.3提取時(shí)間考察
分別考察15min，30min，60min提取時(shí)間對(duì)雷公藤酯甲的影響，結(jié)果顯示提取30min就較為完全，因此選擇30min。
4.4提取次數(shù)考察
分別考察提取1次，2次，3次的影響，結(jié)果顯示提取2次時(shí)雷公藤酯甲較提取1次時(shí)含量增加，相較于提取3次無明顯差異，為節(jié)約分析時(shí)間，因此選擇提取2次。
綜上考察，確定試品溶液的制備方法如下：
取三藤膠囊10粒，倒出內(nèi)容物，混勻，精密稱定1.33g，加氯仿40mL，超聲提取兩次，每次30min，濾紙過濾，殘?jiān)?0mL氯仿洗脫，回收濾液至1mL，加中性氧化鋁(100～200目)1g，攪拌均勻，烘干，上中性氧化鋁柱(100～200目，8g；內(nèi)徑1.5cm×長(zhǎng)度15cm)，用乙酸乙酯100mL洗脫，收集洗脫液并回收至干，加甲醇適量使溶解，置2mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，0.45νm微孔濾膜濾過，即得。
5.線性關(guān)系的考察
精密吸取濃度為0.068mg/mL，0.17mg/mL，0.34mg/mL，0.51mg/mL，0.68mg/mL的雷公藤酯甲對(duì)照品溶液10μl，注入液相色譜儀，按色譜條件測(cè)定峰面積。以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，雷公藤酯甲的量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算其回歸方程為：y＝2698.5046x-1.7512，r＝0.9999(n＝5)，表明雷公藤酯甲在0.68μg～6.8μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，結(jié)果見下表1。
線性關(guān)系考察結(jié)果(表1)
6.精密度試驗(yàn)
精密吸取濃度為0.34mg/ml的對(duì)照品溶液各10μl，重復(fù)進(jìn)樣6次，按色譜條件測(cè)定其峰面積，結(jié)果如下表2：
精密度試驗(yàn)結(jié)果(表2)
平均峰面積＝938.0，RSD＝0.5％(n＝6)。由試驗(yàn)結(jié)果可知，儀器精密度良好。
7.重復(fù)性試驗(yàn)
取批號(hào)為20121231中試樣品，按供試品制備方法制備6份供試品溶液，并按含量測(cè)定方法色譜條件測(cè)定其含量，結(jié)果如下表3：
重復(fù)性試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果(表3)
平均含量＝0.0132，RSD＝1.76％(n＝6)。由試驗(yàn)結(jié)果可知，本方法重復(fù)性良好。
8.溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)
分別在0h、2h、4h、6h、8h、12h時(shí)精密進(jìn)樣10μl，并按含量測(cè)定項(xiàng)下色譜條件測(cè)定其峰面積，結(jié)果如下表4：
溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(表4)
平均峰面積＝219.766，RSD＝1.78％(n＝6)。由試驗(yàn)結(jié)果可知，供試品溶液在12小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。
9.準(zhǔn)確度試驗(yàn)
取已知含量的三藤膠囊10粒，倒出內(nèi)容物，混勻，精密稱定1.33g，分取9份，按照其實(shí)際含量的80％，100％，120％稱取對(duì)照品制備儲(chǔ)備液，加氯仿40mL，超聲提取兩次，每次30min，濾紙過濾，殘?jiān)?0mL氯仿洗脫，回收濾液至1mL，加中性氧化鋁(100～200目)1g，攪拌均勻，烘干，上中性氧化鋁柱(100～200目，8g；內(nèi)徑1.5cm×長(zhǎng)度15cm)，用乙酸乙酯100mL洗脫，收集洗脫液并回收至干，加甲醇適量使溶解，置2mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過，即得。按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見下表5。
回收率試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果(表5)
平均回收率＝98.17％，RSD＝1.31％(n＝9)。結(jié)果表明，本含量測(cè)定方法具有良好的回收率。
由上述試驗(yàn)結(jié)果可知，本方法準(zhǔn)確度良好，能準(zhǔn)確測(cè)定樣品中雷公藤酯甲的含量。
10.雷公藤酯甲含量測(cè)定及含量低限的確定
10.1雷公藤酯甲含量測(cè)定
按上述含量測(cè)定方法測(cè)定3批中試樣品中雷公藤酯甲(C30H4603)的含量，其測(cè)得結(jié)果見下表6：
中試樣品含量測(cè)定(表6)
10.2含量低限的確定
由上述含量測(cè)定結(jié)果可知，3批成品的含量測(cè)定結(jié)果基本穩(wěn)定，平均含量為0.0131％，將成品中雷公藤酯甲(C18H16O8)的低限定為0.0104％，即每粒膠囊含雷公藤酯甲不低于0.046mg。
顯然，本技術(shù)領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，以上的實(shí)施例僅是用來說明本發(fā)明，而并非用作為對(duì)本發(fā)明的限定，只要在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)精神范圍內(nèi)，對(duì)以上所述實(shí)施例的變化、變型都將落在本發(fā)明的權(quán)利要求書范圍。