本發(fā)明屬于儀器分析領(lǐng)域，涉及一種隨機(jī)測定含EPA鏈化合物的方法，具體指一種從復(fù)雜樣品中無目標(biāo)性隨機(jī)掃描含有EPA脂肪酸鏈的化合物的檢測分析方法。
背景技術(shù)：
EPA(Eicosapentaenoic Acid)，即二十碳五烯酸，是魚油的主要成分。EPA屬于Ω-3系列多不飽和脂肪酸，即從甲基端數(shù)第一個(gè)雙鍵的位置在第三碳位的多不飽和脂肪酸。EPA是人體不可缺少但自身又不能合成的重要營養(yǎng)元素，因此被稱為人體必需脂肪酸。雖然亞麻酸在人體內(nèi)可以轉(zhuǎn)化為EPA，但此反應(yīng)在人體中的速度很慢且轉(zhuǎn)化量很少，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足人體對EPA的需要，因此必須從食物中直接補(bǔ)充。
醫(yī)學(xué)和營養(yǎng)學(xué)研究表明EPA具有抑制血小板凝聚、抗血栓、舒張血管、調(diào)整血脂等治療和預(yù)防心腦血管病的功能，EPA過氧化物和自由基可抑制腫瘤細(xì)胞表達(dá)，縮短染色體的端粒，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。EPA能減少有害的免疫反應(yīng)，并對治療由自身免疫缺陷引起的炎癥有效。Ω-3脂肪酸，包括EPA在內(nèi)，對肺病、腎病、2型糖尿病、大腸潰瘍和節(jié)段性回腸炎的治療都會起到積極的作用。近來又發(fā)現(xiàn)其還具有促進(jìn)腦細(xì)胞生長、發(fā)育，改善大腦機(jī)能，提高記憶力和學(xué)習(xí)能力，增強(qiáng)視網(wǎng)膜反射能力以及防治老年性癡呆等提高生命質(zhì)量的功能。因而，提取分離高純度EPA已成為發(fā)達(dá)國家竟相研究的熱點(diǎn)。
商業(yè)上EPA的來源主要是脂肪含量高的海洋魚類，其EPA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)到20％～30％。隨著海況的變化和海上捕撈強(qiáng)度的不斷增加，海上漁業(yè)資源結(jié)構(gòu)發(fā)生了重大變化，環(huán)境污染、過度捕撈等因素造成資源短缺，促使人們積極尋找開發(fā)富含EPA的新資源。
目前EPA的相關(guān)檢測方法主要以氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法為主，該方法主要檢測游離EPA及甲酯化或乙酯化EPA。含EPA鏈化合物的檢測方法主要為液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法。目前報(bào)道的方法均為定向篩選法，即已知化合物A具有EPA鏈，根據(jù)A的化學(xué)或物理特征從樣品中定向篩選化合物A。而隨機(jī)非定向篩選法未有報(bào)道。
建立隨機(jī)測定含EPA鏈化合物的方法，快速掃描復(fù)雜樣品中含有EPA脂肪酸鏈的化合物并進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定和含量測定，有利于快速篩選EPA原料資源，促進(jìn)EPA保健品產(chǎn)業(yè)發(fā)展。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種操作簡便的復(fù)雜基質(zhì)中隨機(jī)測定含EPA鏈化合物的方法檢測方法。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種隨機(jī)測定含EPA鏈化合物的方法，包括以下步驟：
1)、樣品前處理：
將鯽魚肌肉組織洗凈后研磨成糜，在糜中加入有機(jī)溶劑Ⅰ后震蕩提取，提取完畢后加入純水并震蕩混勻；
所得的混合物用冷凍離心機(jī)離心，移取下相溶液，將該下相溶液干燥(用氮?dú)膺M(jìn)行低溫吹干)，得脂質(zhì)粗提物；
有機(jī)溶劑Ⅰ為甲醇：氯仿＝1：2體積比的混合液或者為甲醇：二氯甲烷＝1：2體積比的混合液，糜與有機(jī)溶劑Ⅰ的料液比為1g/15～30ml；所加入水的量為有機(jī)溶劑Ⅰ的0.5體積倍；
2)、進(jìn)樣：
將脂質(zhì)粗提物用甲醇：二氯甲烷＝1：2體積比的有機(jī)溶劑定容至100mL作為樣品；
移取1mL樣品過0.22μm濾膜后作為待測樣液，使用針泵注射器注射進(jìn)質(zhì)譜；
3)、質(zhì)譜檢測：
使用負(fù)離子模式，根據(jù)特征子離子尋找所有含有該子離子的母離子，掃描范圍為400-1000Da，駐留時(shí)間為2秒，氣簾氣為10psi，加速電壓為-4500ev，輔助氣Ⅰ為20psi，輔助氣Ⅱ?yàn)?0psi，圖譜累加100～200次；使用Analyst軟件采集數(shù)據(jù)；
4)、數(shù)據(jù)分析：
將步驟3)質(zhì)譜檢測所得譜圖進(jìn)行分析，得各個(gè)離子峰的結(jié)構(gòu)信息。即，得知樣品中含有EPA鏈的化合物的種類和數(shù)量。
作為本發(fā)明的隨機(jī)測定含EPA鏈化合物的方法的改進(jìn)：
所述步驟4)為：
將步驟3)質(zhì)譜檢測所得譜圖經(jīng)過噪音過濾(最低峰寬為0.2Da)，基線扣除4Da，去同位素峰后，得到處理后譜圖；將處理后譜圖導(dǎo)出為txt文件后使用Lipid Mass Spec.Prediction軟件鑒定即可得到各個(gè)離子峰的結(jié)構(gòu)信息。
備注說明：以PE 18:1/20:5為例，結(jié)構(gòu)包括3部分信息，PE指的是磷脂酰乙醇胺類，18:1指的是其中一條脂肪酸鏈?zhǔn)?8碳1雙鍵，20:5指另一條鏈。
作為本發(fā)明的隨機(jī)測定含EPA鏈化合物的方法的進(jìn)一步改進(jìn)：
所述步驟4)還包括：
各個(gè)母離子濃度經(jīng)公式：計(jì)算，其中Abundancei為化合物豐度，Ai為譜圖(步驟3)質(zhì)譜檢測所得譜圖)中該特定離子峰的峰面積，A1～An為譜圖中所得的所有離子峰的峰面積。
利用上述公式能得知樣品中含EPA鏈化合物的大概含量。
作為本發(fā)明的隨機(jī)測定含EPA鏈化合物的方法的進(jìn)一步改進(jìn)：
所述步驟1)中，以移取下相溶液后的離心所得物(即，包括上相溶液和固體)替代水產(chǎn)品組織，以機(jī)溶劑Ⅰ中的二氯甲烷或者氯仿替代機(jī)溶劑Ⅰ；再重復(fù)提取1～3次；將所有提取后所得的下相溶液合并后進(jìn)行后續(xù)的干燥和復(fù)溶。
備注說明：離心后離心管內(nèi)溶液上下分層，三文魚肌肉組織樣品則呈餅狀居于兩相中間。
甲醇、氯仿、水三者在一起的時(shí)候不會混溶，會分成上下兩相，甲醇極性較強(qiáng)會與水混溶，因此在離心管中，二氯甲烷或者氯仿混溶少量甲醇在下相，水混溶多量甲醇在上相；由于移取走下相后，實(shí)際大部分甲醇依然在上相中并未被移取，因此重復(fù)提取的時(shí)候只需要加入二氯甲烷或者氯仿即可。即，重復(fù)提取時(shí)二氯甲烷或者氯仿的體積用量＝機(jī)溶劑Ⅰ中的二氯甲烷或者氯仿的體積用量。二氯甲烷和氯仿提取效率相近，二氯甲烷毒性弱于氯仿。
作為本發(fā)明的隨機(jī)測定含EPA鏈化合物的方法的進(jìn)一步改進(jìn)：
所述步驟1)中，用冷凍離心機(jī)離心為：于4℃、8000～12000rpm離心5～15分鐘。
作為本發(fā)明的隨機(jī)測定含EPA鏈化合物的方法的進(jìn)一步改進(jìn)：
所述步驟2)中，針泵注射器流速為10～20μL/min。
作為本發(fā)明的隨機(jī)測定含EPA鏈化合物的方法的進(jìn)一步改進(jìn)：
所述步驟3)中，所采用的掃描方法為子找母掃描(Precursor ion scan)，特征子離子為m/z 301，去簇電壓為-80～-100ev，碰撞電壓為-30～-40ev。
綜上所述，本發(fā)明采用m/z 301為特征子離子通過負(fù)離子模式下子找母掃描方法掃描復(fù)雜基質(zhì)樣品中含有EPA鏈化合物，經(jīng)譜圖處理與數(shù)據(jù)分析后，隨機(jī)非定向得到所有含有EPA脂肪酸鏈的化合物。本發(fā)明樣品前處理、進(jìn)樣、質(zhì)譜檢測、數(shù)據(jù)分析步驟，操作簡便、簡單易培訓(xùn)、定性定量能力較強(qiáng)、實(shí)用性強(qiáng)，適合實(shí)驗(yàn)室廣泛使用。
附圖說明
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
圖1為負(fù)離子模式下子找母掃描方法掃描鯽魚組織樣品質(zhì)譜圖。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合附圖詳細(xì)說明本發(fā)明的具體實(shí)施方式，使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更清楚地理解如何實(shí)踐本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，盡管結(jié)合其優(yōu)選的具體實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但這些實(shí)施方案只是闡述，而不是限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1、一種隨機(jī)測定含EPA鏈化合物的方法，依次進(jìn)行以下步驟：
1)、樣品前處理：
將100g鯽魚肌肉組織洗凈后研磨成糜，取1g肉糜并加入有機(jī)溶劑(甲醇：二氯甲烷＝1：2體積比)21mL后震蕩提取，提取完畢后加入純水10.5mL并震蕩混勻；
所得的混合物用冷凍離心機(jī)離心，于4℃、12000rpm離心5分鐘。移取下相溶液，向剩余上相及固形物中加入14mL二氯甲烷，重復(fù)提取2次；將所有提取后所得的下相溶液合并、干燥后(用氮?dú)膺M(jìn)行低溫吹干)，得脂質(zhì)粗提物；
2)、進(jìn)樣：
將脂質(zhì)粗提物用甲醇：二氯甲烷＝1：2體積比的有機(jī)溶劑定容至100mL作為樣品。移取1mL樣品過0.22μm濾膜后使用針泵注射器注射進(jìn)質(zhì)譜，針泵注射器流速為20μL/min。
3)、質(zhì)譜檢測：
使用負(fù)離子模式，所采用的掃描方法為子找母掃描(Precursor ion scan)，特征子離子為m/z 301，去簇電壓為-100ev，碰撞電壓為-40ev。根據(jù)特征子離子尋找所有含有該子離子的母離子，掃描范圍為400-1000Da，駐留時(shí)間為2秒，氣簾氣為10psi，加速電壓為-4500ev，輔助氣Ⅰ為20psi，輔助氣Ⅱ?yàn)?0psi，圖譜累加100次。使用Analyst軟件采集數(shù)據(jù)。
4)、數(shù)據(jù)分析：
將步驟3)質(zhì)譜檢測所得譜圖經(jīng)過噪音過濾(最低峰寬為0.2Da)，基線扣除4Da，去同位素峰后，得到處理后譜圖(圖1)。將處理后譜圖導(dǎo)出為txt文件后使用Lipid Mass Spec.Prediction軟件鑒定即可得到各個(gè)離子峰的結(jié)構(gòu)信息。各個(gè)母離子濃度經(jīng)公式：計(jì)算，其中Abundancei為化合物豐度，Ai為譜圖(步驟3)質(zhì)譜檢測所得譜圖)中該特定離子峰的峰面積，A1～An為譜圖中所得的所有離子峰的峰面積。
結(jié)果如下：
鯽魚組織樣品脂質(zhì)種類豐富，含有EPA鏈的化合物較多，經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定后發(fā)現(xiàn)均為磷脂；共鑒定出磷脂分子種31種，其中8個(gè)磷脂酰膽堿，14個(gè)磷脂酰乙醇胺，1個(gè)磷脂酰肌醇，4個(gè)磷脂酰絲氨酸，3個(gè)磷質(zhì)酸，1個(gè)磷脂酰甘油。信號最強(qiáng)為m/z 764.9，經(jīng)鑒定是[PCo-16:0/20:5-H]-和[PE18:0/20:5-H]-的重疊。具體如表1所述。
表1、鯽魚組織樣品中含有EPA鏈的化合物的結(jié)構(gòu)與豐度信息
注：a:b/c:d表示化合物的兩條脂肪酸鏈結(jié)構(gòu)，其中一條為20:5，即為20個(gè)碳原子脂肪酸鏈含5個(gè)不飽和雙鍵；前綴o-表示烷基鏈，其余為酰基鏈。
驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：按照液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對實(shí)施例1所述的樣品鯽魚給檢測，所得結(jié)果為：共鑒定出含有EPA脂肪酸鏈的磷脂分子種31種，其中8個(gè)磷脂酰膽堿，14個(gè)磷脂酰乙醇胺，1個(gè)磷脂酰肌醇，4個(gè)磷脂酰絲氨酸，3個(gè)磷質(zhì)酸，1個(gè)磷脂酰甘油，各離子峰豐度相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD≤7％。
對比例1-1、將實(shí)施例1步驟1)中的重復(fù)提取2次改成重復(fù)提取0次；其余等同于實(shí)施例1。
對比例2-1、將實(shí)施例1步驟1)中的冷凍離心機(jī)條件為8000rpm，溫度、時(shí)間不變；其余等同于實(shí)施例1。
對比例3-1、將實(shí)施例1步驟2)中的針泵注射器流速為5μL/min；其余等同于實(shí)施例1。
對比例3-2、將實(shí)施例1步驟2)中的針泵注射器流速為30μL/min；其余等同于實(shí)施例1。
對比例4-1、將實(shí)施例1步驟3)中的掃描方法改為子離子掃描(Product ion scan)，特征子離子為m/z 764.9；其余等同于實(shí)施例1。
對比例4-2、將實(shí)施例1步驟3)中的掃描方法為全掃描(Q1scan)，其余等同于實(shí)施例1。
對比例4-3、將實(shí)施例1步驟3)中的特征子離子m/z 301改為m/z 300；其余等同于實(shí)施例1。
對比例4-4、將實(shí)施例1步驟3)中的特征子離子m/z 301改為m/z 302；其余等同于實(shí)施例1。
對比例4-5、將實(shí)施例1步驟3)中的去簇電壓-100ev改為-60ev；其余等同于實(shí)施例1。
對比例4-6、將實(shí)施例1步驟3)中的去簇電壓-100ev改為-120ev；其余等同于實(shí)施例1。
對比例4-7、將實(shí)施例1步驟3)中的碰撞電壓-40ev改為-20ev；其余等同于實(shí)施例1。
對比例4-8、將實(shí)施例1步驟3)中的碰撞電壓-40ev改為-50ev；其余等同于實(shí)施例1。
采用上述對比例所述方法所得的含EPA化合物和豐度如下表2所述。
表2
綜上可見，本發(fā)明的一種隨機(jī)測定含EPA鏈化合物的方法可以快速、有效的對鯽魚等水產(chǎn)品組織樣品中含有EPA鏈的化合物非定向掃描測定，解決了現(xiàn)有技術(shù)中存在的定向掃描只針對目標(biāo)化合物、EPA原料資源篩查效率低等問題。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。