本發(fā)明涉及一種中藥制劑的檢測方法，具體涉及六神丸中蟾蜍二烯內(nèi)酯類成分檢測方法，屬于中藥成分分析領域。

背景技術：

六神丸由麝香、牛黃、蟾酥等中藥組成，屬于國家中藥保護品種，具有清涼解毒，消炎止痛的功效，適用于爛喉丹痧，咽喉腫痛，喉風喉癰，單雙乳蛾，小兒熱癤，癰瘍疔瘡，乳癰發(fā)背，無名腫毒。其中所含藥味蟾酥為蟾蜍科動物中華大蟾蜍Bufo bufogargarizans Cantor或黑眶蟾蜍B.melanostictus Schneider的干燥分泌物，其性味甘辛、溫，有毒，具有解毒、消腫、醒神、開竅、強心和止痛等作用。根據(jù)文獻報道，蟾酥主要活性成分為蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物，該類化合物具有顯著的洋地黃樣作用、升壓、呼吸興奮和抗腫瘤作用。

現(xiàn)有文獻報道中，已有學者采用紫外分光光度法、薄層色譜法、高效液相色譜法對蟾酥及其制劑中脂蟾毒配基和華蟾酥毒基進行了定量分析，但未見對和蟾蜍他靈、沙蟾毒精、遠華蟾毒精、去乙酰華蟾毒等其它蟾酥二烯內(nèi)酯類化合物同時測定的報道。

六神丸目前執(zhí)行標準為《衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑第十八冊》(標準編號：WS3-B-3374-98)，標準中含量測定項中只有牛黃中膽酸的含量測定項。學術論文(鄒瑾麗,祁海宏.HPLC法測定六神丸中華蟾酥毒基和酯蟾毒配基含量[J].中國臨床藥學雜志,2007,16(1):49-50.)公開了一種同時測定六神丸中華蟾酥毒基和脂蟾毒配基兩個蟾蜍二烯內(nèi)酯類成分的含量方法；學術論文(王建,倪坤儀,于如報.六神丸中蟾毒內(nèi)酯化合物的HPLC分析[J].中國藥科大學學報,1991,22(6):372-374.)公開了六神丸中總蟾毒內(nèi)酯類化合物含量。但由于蟾酥二烯內(nèi)酯類化合物的極性非常接近，目前色譜條件并沒有達到分離蟾酥二烯內(nèi)酯類化合物的方法，因此現(xiàn)有技術均不能全面反映六神丸中蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物含量水平，不能很好的控制產(chǎn)品的質(zhì)量，存在一定的缺陷。

蟾酥既是六神丸中有效成分，也是毒性成分，為對六神丸產(chǎn)品中蟾蜍二烯內(nèi)酯類成分進行全面檢測和分析，本發(fā)明對六神丸中9種蟾蜍二烯內(nèi)酯類成分檢測方法同時進行了研究，為制定新的質(zhì)量標準和有效控制產(chǎn)品質(zhì)量提供科學依據(jù)。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種六神丸中蟾蜍二烯內(nèi)酯類成分檢測方法。該方法能夠同時檢測極性接近的9種蟾蜍二烯內(nèi)酯類成分，簡便快速、準確可靠，專屬性強，重現(xiàn)性好，可用于六神丸產(chǎn)品的質(zhì)量控制，具有重要的意義。

為實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明的技術解決方案是：

一種六神丸中蟾蜍二烯內(nèi)酯類成分檢測方法，包括如下步驟：

(1)對照品溶液的制備：精密稱取華蟾酥毒基、脂蟾毒配基、和蟾蜍他靈、沙蟾毒精、遠華蟾毒精、去乙酰華蟾毒它靈、蟾毒它靈、華蟾毒它靈和蟾毒靈，用甲醇溶解并定容，得到混合對照品溶液；

(2)供試品溶液的制備：取六神丸適量，研磨粉碎，取粉末適量，精密稱定，精密加入醇適量，提取，放冷，用醇補足失重，搖勻，離心，取上清液，得供試品溶液；

(3)測定法：分別精密吸取混合對照品溶液和供試品溶液，注入HPLC，按標準曲線法測定蟾蜍二烯內(nèi)酯類成分的含量；

色譜條件：色譜柱：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相：A相為乙腈，B相為水，梯度洗脫；檢測波長：245nm～360nm；柱溫35℃～45℃；流速0.8ml/min～1.2ml/min；進樣量5μl～20μl。

作為優(yōu)選方案，六神丸中蟾蜍二烯內(nèi)酯類成分檢測方法，步驟(1)對照品溶液的制備：分別取華蟾酥毒基(CAS:470-37-1)、脂蟾毒配基(CAS:465-39-4)、和蟾蜍他靈(CAS:465-11-2)、沙蟾毒精(CAS：464-74-4)、遠華蟾毒精(CAS:472-26-4)、去乙酰華蟾毒它靈(CAS:4099-30-3)、蟾毒它靈(CAS:471-95-4)、華蟾毒它靈(CAS:1108-68-5)和蟾毒靈(CAS:465-21-4)對照品適量，精密稱定，以甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度分別為華蟾酥毒基468.11μg/ml、脂蟾毒配基331.56μg/ml、和蟾蜍他靈70.39μg/ml、沙蟾毒精257.78μg/ml、遠華蟾毒精261.89μg/ml、去乙酰華蟾毒它靈42.96μg/ml、蟾毒它靈214.73μg/ml、華蟾毒它靈366.44μg/ml、蟾毒靈241.56μg/ml的混合對照品儲備液；

步驟(2)所述的供試品溶液的制備：

取六神丸適量，研磨粉碎，過100～200目篩，取粉末約0.1g～0.5g，精密稱定，按料液比1︰50～1︰100精密加入體積濃度為70％～100％甲醇或乙醇，密塞，稱重，超聲(50KHz～100KHz，功率150W～250W)或回流提取30min～120min，放冷，用70％～100％甲醇或乙醇補足失重，搖勻，離心，取上清液，得供試品溶液。

一、提取方法的篩選：

本發(fā)明對提取方法(超聲提取、回流提取)、提取溶劑(純甲醇、90％甲醇、80％甲醇、70％甲醇、乙醇)、提取時間(30min、60min、90min、120min)、料液比等進行了單因素進行考察，篩選出以純甲醇作為六神丸的提取溶劑，料液比為1︰50，50kHz頻率下超聲60min，蟾蜍二烯內(nèi)酯類成分提取率最高。因此，本發(fā)明優(yōu)選的提取方法為：取六神丸適量，研磨粉碎，過200目篩，取粉末約0.2g，精密稱定，精密加入甲醇10ml(料液比1︰50)，密塞，稱重，超聲(工作頻率50KHz，功率250W)提取60min，放冷，用甲醇補足失重，搖勻，離心，取上清液，待測。

二、色譜條件的篩選：本發(fā)明分別對色譜柱、洗脫系統(tǒng)、洗脫程序、柱溫、檢測波長進行了篩選。

1、色譜柱的篩選：分別篩選色譜柱1：Xbridge C18(4.6×250mm,5μm,Waters)；色譜柱2：ODS Hypersil C18(4.6×250mm,5μm,Thermo)；色譜柱3：ODS-2C18(4.6×250mm,5μm，漢邦)。根據(jù)色譜峰的分離情況，9種蟾蜍二烯內(nèi)酯類成分在ODS-2C18(4.6×250mm,5μm，漢邦)色譜柱上分離較好，優(yōu)選色譜柱3：ODS-2C18(4.6×250mm,5μm，漢邦)色譜柱。

2、洗脫系統(tǒng)的篩選：本發(fā)明分別篩選洗脫系統(tǒng)：1：甲醇-水；2：乙腈-水；3：乙腈-0.1％磷酸；4：乙腈-0.15％磷酸；5：乙腈-0.3％磷酸。根據(jù)9種蟾蜍二烯內(nèi)酯類成分色譜峰分離效果和峰型等，優(yōu)選4：乙腈-0.15％磷酸為最終洗脫系統(tǒng)。

3、洗脫程序的篩選：本發(fā)明以乙腈-0.15％磷酸做流動相，篩選了程序1-5的洗脫程序，以乙腈百分比表示，括號內(nèi)表示時間(min)：

程序1：5％(0)～15％(12)～20％(20)～30％(25)～45％(35)～55％(45)～70％(50)～90％(55)～15％(60)～15％(62)

程序2：10％(0)～30％(10)～40％(20)～45％(30)～50％(35)～67％(37)～86％(40)～96％(42)～30％(44)～15％(45)

程序3：20％(0)～25％(15)～40％(25)～40％(35)～55％(37)～55％(45)～100％(47)～100％(52)～20％(54)～20％(55)

程序4：25％(0)～35％(14)～50％(26)～60％(36)～65％(46)～72％(58)～85％(60)～95％(70)～35％(75)～25％(80)

程序5：32％(0)～40％(20)～55％(35)～65％(45)～70％(55)～75％(65)～90％(70)～100％(80)～30％(90)～30％(100)

根據(jù)9種蟾蜍二烯內(nèi)酯類成分色譜圖的分離效果，優(yōu)選程序3：20％(0)～25％(15)～40％(25)～40％(35)～55％(37)～55％(45)～100％(47)～100％(52)～20％(54)～20％(55)為最終洗脫程序。

4、柱溫的篩選：本發(fā)明篩選25℃、30℃、35℃、40℃和45℃柱溫，根據(jù)9種蟾蜍二烯內(nèi)酯類成分色譜峰分離效果及分離時間，優(yōu)選40℃為最終柱溫。

5、檢測波長的篩選：本發(fā)明篩選了254nm、280nm、296nm和316nm的波長，根據(jù)9 種蟾蜍二烯內(nèi)酯類成分色譜峰分離效果和峰數(shù)優(yōu)選296nm為最終檢測波長。

本發(fā)明步驟(3)測定法中包括線性關系測定：精密吸取對照品溶液，依次稀釋2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍，制備包括母液在內(nèi)的7份溶液。分別精密吸取系列質(zhì)量濃度的混合對照品溶液10μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。以對照品濃度X(μg/mL)為橫坐標，以峰面積Y為縱坐標，繪制標準曲線。

本發(fā)明步驟(3)測定法中包括檢測限和定量限測定：在色譜條件下，當信噪比為3時，測定和蟾蜍他靈、沙蟾毒精、遠華蟾毒精、去乙酰華蟾毒它靈、蟾毒它靈、華蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、脂蟾毒配基的檢測限；當信噪比為10時，測定和蟾蜍他靈、沙蟾毒精、遠華蟾毒精、去乙酰華蟾毒它靈、蟾毒它靈、華蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、脂蟾毒配基的定量限。

本發(fā)明步驟(3)測定法中包括精密度實驗：取對照品溶液，在色譜條件下，重復進樣6次，每次10μL，計算各對照品色譜峰面積以及相對標準偏差；

本發(fā)明步驟(3)測定法中包括穩(wěn)定性實驗：取六神丸供試品溶液，室溫放置，于0、2、4、8、10、12、16、24h進樣，每次10μL，在色譜條件下進樣分析，計算六神丸樣品中各色譜峰面積以及相對標準偏差；

本發(fā)明步驟(3)測定法中包括重復性實驗：取同一批六神丸樣品，按供試品溶液的制備方法各平行制備6份，分別進樣，每次10μL。在色譜條件下進樣分析，計算六神丸樣品中各色譜峰面積以及相對標準偏差；

本發(fā)明步驟(3)測定法中包括回收率實驗：精密稱取同一批六神丸樣品各6份，分別準確加入一定量的蟾酥二烯內(nèi)酯類化合物，按供試品溶液的制備方法處理后，在色譜條件下進行分析，記錄峰面積，計算加樣回收率。

本發(fā)明的優(yōu)點是：

1、與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明可同時測定的六神丸中的9種極性非常接近的蟾蜍二烯內(nèi)酯類成分，可大大大大提高檢測效率，可更加全面的控制六神丸的質(zhì)量。

2、本發(fā)明通過大量實驗篩選出最佳的流動相組成、色譜柱、洗脫程序、檢測波長、柱溫等色譜條件，優(yōu)選得到最佳的色譜條件。在優(yōu)選定的色譜條件下，六神丸中9種蟾蜍二烯內(nèi)酯類成分在55min內(nèi)便可完成分析，和蟾蜍他靈、沙蟾毒精、遠華蟾毒精、去乙酰華蟾毒它靈、蟾毒它靈、華蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基和脂蟾毒配基分別在線性范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關系(r≧0.9996)。加樣回收率均在92％～105％，RSD＜5％。該法測定快速、準確可靠，專屬性強，重現(xiàn)性好，可全面反映六神丸中蟾蜍二烯內(nèi)酯類成分情況，可用于六神丸的質(zhì)量控制，對控制藥品質(zhì)量具有重要的意義。

附圖說明

圖1是本發(fā)明對照品溶液的高效液相色譜圖

圖2是本發(fā)明六神丸供試品溶液的高效液相色譜圖

具體實施方式

下面通過實施例的方式進一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實施例范圍之中。在閱讀了本發(fā)明之后，本領域技術人員對本發(fā)明的各種非實質(zhì)性的修改均落于本申請所附權利要求所限定的范圍。

實施例1

HPLC法同時測定六神丸中9種蟾蜍二烯內(nèi)酯類成分含量的方法

1儀器與試藥

1.1儀器

美國Waters e2695高效液相色譜系統(tǒng)，包括在線脫氣機，自動進樣器Prominence SIL-20A，2998紫外可見光檢測器和柱溫箱CTO-20A；漢邦ODS-2(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱；Anke TGL-16C高速離心機(上海安亭科學儀器廠)；電子分析天平(FA1204B，上海精密科學有限公司)；CPA22，5D電子天平(德國Sartorius公司)；Milli-Q Synthesis 108超純水儀(美國密理博公司)；KQ-500DE超聲機(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2試藥

乙腈(色譜純，美國TEDIA試劑公司)，甲醇(色譜純，江蘇漢邦科技有限公司)，重蒸水(由Milli-Q Synthesis 108超純水儀制得)，和蟾蜍他靈(批號465-11-2)、沙蟾毒精(批號464-74-4)、遠華蟾毒精(批號472-26-4)、去乙酰華蟾毒它靈(批號4099-30-3)、蟾毒它靈(批號471-95-4)、華蟾毒它靈(批號1108-68-5)、蟾毒靈(批號11981-201501)等對照品購自寶雞市辰光生物科技有限公司，經(jīng)面積歸一化法測定，純度均大于98.0％；華蟾酥毒基(批號110803-201406，供含量測定用)、脂蟾毒配基(批號110718-201108，供含量測定用)購自中國食品藥品檢定研究院。六神丸(雷允上藥業(yè)有限公司，批號分別為NA18003A、NA18008B、NA18018A、NA18021B、OA18019A、OA10005B、OA18025B、OA18009C、0A18004B、LA18012C)。

2方法與結(jié)果

2.1對照品溶液的制備

分別取和蟾蜍他靈、沙蟾毒精、遠華蟾毒精、去乙酰華蟾毒它靈、蟾毒它靈、華蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、脂蟾毒配基對照品適量，精密稱定，以甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度分別為和蟾蜍他靈70.39μg/ml、沙蟾毒精257.78μg/ml、遠華蟾毒精261.89μg/ml、去乙酰華蟾毒它靈42.96μg/ml、蟾毒它靈214.73μg/ml、華蟾毒它靈366.44μg/ml、蟾毒靈241.56μg/ml、華蟾酥毒基468.11μg/ml、脂蟾毒配基331.56μg/ml的混合對照品儲備液。

2.2供試品溶液的制備

取六神丸粉末約0.2g，精密稱定，精密加入甲醇10ml，密塞，稱重，超聲(工作頻率50KHz，功率250W)處理60min，放冷，用甲醇補足失重，搖勻，離心，取上清液進樣分析。

2.3色譜條件

色譜柱：ODS-2(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱，流動相：乙腈(A)-0.15％磷酸溶液，梯度洗脫：0～15min，20％～25％乙腈；15～25min，25％～40％乙腈；25～35min，40％乙腈；35～37min，40％～55％乙腈；37～45min，55％乙腈；45～47min，55％～100％乙腈；47～52min，100％乙腈；52～54min，100％～20％乙腈；54～55min，20％乙腈；體積流量1mL·min-1；檢測波長296nm；柱溫：40℃；進樣量:10μL。

在上述色譜條件下，和蟾蜍他靈、沙蟾毒精、遠華蟾毒精、去乙酰華蟾毒它靈、蟾毒它靈、華蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、脂蟾毒配基的對照品溶液，六神丸供試品溶液高效液相色譜圖見圖1和圖2。各色譜峰依次為：1：和蟾蜍他靈、2：沙蟾毒精、3：遠華蟾毒精、4：去乙酰華蟾毒它靈、5：蟾毒它靈、6：華蟾毒它靈、7：蟾毒靈、8：華蟾酥毒基、9：酯蟾毒配基。

2.4線性關系考察

精密吸取“2.1”項下對照品溶液，依次稀釋2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍，制備包括母液在內(nèi)的7份溶液。分別精密吸取系列質(zhì)量濃度的混合對照品溶液10μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。以對照品濃度X(μg/mL)為橫坐標，以峰面積Y為縱坐標，繪制標準曲線。見表1。

表1蟾酥二烯內(nèi)酯類成分的回歸方程

2.5檢測限和定量限

在選定的色譜條件下，當信噪比為3時，測得和蟾蜍他靈、沙蟾毒精、遠華蟾毒精、去乙酰華蟾毒它靈、蟾毒它靈、華蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、脂蟾毒配基的檢測限分別為0.0027μg、0.0021μg、0.0051μg、0.0017μg、0.0042μg、0.0072μg、0.0047μg、0.0091μg、0.0130μg；測得當信噪比為10時，測得和蟾蜍他靈、沙蟾毒精、遠華蟾毒精、去乙酰華蟾毒它靈、蟾毒它靈、華蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、脂蟾毒配基的檢測定量限分別為0.0110μg、0.0085μg、0.0102μg、0.0034μg、0.0084、0.0143μg、0.0094μg、0.0366μg、0.0259μg。

2.6精密度試驗

按照“2.3”項下色譜條件，分別取制備得到的對照品溶液10μL，重復進樣6次，和蟾蜍他靈、沙蟾毒精、遠華蟾毒精、去乙酰華蟾毒它靈、蟾毒它靈、華蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、脂蟾毒配基峰面積的RSD分別為1.36％、1.25％、1.44％、1.07％、1.08％、1.21％、1.20％、1.16％、1.11％，RSD均<3％，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.7穩(wěn)定性試驗

取六神丸供試品溶液，按“2.3”項色譜條件，在0、2、4、8、10、12、16、24h進樣10μL，六神丸中和蟾蜍他靈、沙蟾毒精、遠華蟾毒精、去乙酰華蟾毒它靈、蟾毒它靈、華蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、脂蟾毒配基峰面積的RSD分別為1.70％、1.60％、1.80％、2.37％、1.83％、1.87％、1.93％、1.71％、1.75％，RSD均<3％，結(jié)果表明六神丸溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8重復性試驗

取同一批六神丸樣品，按供試品溶液的制備方法制備6份，分別進樣10μL，六神丸中和蟾蜍他靈、沙蟾毒精、遠華蟾毒精、去乙酰華蟾毒它靈、蟾毒它靈、華蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、脂蟾毒配基質(zhì)量分數(shù)的RSD分別為2.06％、2.28％、2.47％、2.09％、2.44％、2.36％、2.47％、2.45％、2.45％，RSD均<3％，結(jié)果表明重復性良好。

2.9回收率試驗

精密稱取同一批六神丸樣品6份，分別準確加入一定量的蟾酥二烯內(nèi)酯類化合物，按供試品溶液的制備方法處理后，按“2.3”項色譜條件測定，計算回收率及RSD，結(jié)果見表2。

表2六神丸加樣回收率試驗

2.10樣品測定

取六神丸按供試品溶液制備方法制成供試品溶液，按“2.3”項色譜條件進樣分析，根據(jù)線性回歸方程計算不同批次的六神丸中9種蟾酥二烯內(nèi)酯類成分的含量見表3。

表3六神丸中9種蟾酥二烯內(nèi)酯類成分的含量(mg/g)(n＝3)

本發(fā)明通過大量實驗篩選，建立了HPLC法同時測定六神丸中9種極性接近的蟾蜍二烯內(nèi)酯類成分含量的方法。并且采用本發(fā)明優(yōu)選的方法測定了10批六神丸中和蟾蜍他靈、沙蟾毒精、遠華蟾毒精、去乙酰華蟾毒它靈、蟾毒它靈、華蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量。方法學考察結(jié)果表明，本發(fā)明所建立的檢測方法精密度、穩(wěn)定性、重復性良好，加樣回收率實驗結(jié)果符合定量分析的要求，方法簡便易行，可為六神丸的質(zhì)量標準的建立和完善提供科學依據(jù)。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。