本發(fā)明涉及一種水產(chǎn)動物保健品中磺胺嘧啶抗生素含量的檢測方法，屬于水產(chǎn)科學領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：我國是水產(chǎn)養(yǎng)殖大國，產(chǎn)量一直居于世界首位。高密度的養(yǎng)殖方式是獲得高產(chǎn)量的保證，但也易引起各種魚病的暴發(fā)。因此，預防為主、防治結(jié)合一直是水產(chǎn)養(yǎng)殖過程防控病害、促進生長的基本法則。水產(chǎn)動物保健品在預防、治療魚類疾病、保障魚類健康生長，以及在節(jié)省資源和保證生物安全等方面有著重要作用，并已經(jīng)成為養(yǎng)殖過程日常管理的必備投入品。例如，復合維生素類保健品通過潑灑和飼料拌喂等方式進入水產(chǎn)動物體內(nèi)，具有增強免疫和預防疾病等功效，中草藥粉劑和多種微量元素復合制劑也標識這些類似的功效。與國外發(fā)達國家動物保健品企業(yè)相比，我國水產(chǎn)動物保健品企業(yè)無論在研發(fā)、生產(chǎn)、銷售環(huán)節(jié)均存在較大的差距此，更為關(guān)鍵的是，國外以藥物殘留為借口，對我國動物源性產(chǎn)品提高了貿(mào)易技術(shù)壁壘?；前粪奏ふ潜粡V泛隱性添加使用的抗生素之一?；前粪奏ぷ鳛閺V譜抑菌劑，對大多數(shù)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌有抑制作用，可用于治療由氣單胞菌屬、假單胞菌屬、弧菌屬和鏈球菌屬引起的水產(chǎn)動物的細菌性疾病。目前已報道水產(chǎn)品、水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境(水體和沉積物)中磺胺嘧啶的檢測方法。這些方法考慮了生物體及其生活環(huán)境介質(zhì)中磺胺嘧啶的提取和純化手段。而水產(chǎn)動物保健品的基質(zhì)特殊，復雜，至今未見相關(guān)報道。因此需要開發(fā)新型的抗生素提取和純化程序，以及與之匹配的液相色譜流動相配比和質(zhì)譜條件來定性和定量。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是得到一種水產(chǎn)動物保健品中磺胺嘧啶抗生素含量的檢測方法，其優(yōu)點是檢測靈敏度高、精密度好和時間短。按照本發(fā)明提供的技術(shù)方案，一種水產(chǎn)動物保健品中磺胺嘧啶抗生素含量的檢測方法，步驟如下：(1)標準曲線制備：取磺胺嘧啶標準溶液，利用色譜純級別的甲醇來溶解、稀釋成濃度為1mg/L的母液；把母液再次稀釋成5個不同濃度，即0μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L和50μg/L的磺胺嘧啶標準工作液；通過設(shè)備對所得標準工作液進行檢測，獲得實測數(shù)據(jù)，并繪制磺胺嘧啶抗生素含量與檢測結(jié)果之間的標準曲線圖；(2)檢測：對待測的水產(chǎn)動物保健品進行處理，得到樣品后采用設(shè)備進行檢測，得到實測數(shù)據(jù)；(3)對比：將步驟(2)所得實測結(jié)果與步驟(1)中獲得的標準曲線圖進行比對，即可得到樣品中磺胺嘧啶抗生素的含量。步驟(1)和(2)所用檢測設(shè)備為超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀。步驟(2)所述處理方法如下：a、稱量：精確稱取5g樣品粉末，溶解到1000mL蒸餾水中，搖蕩5分鐘，然后超聲5分鐘；靜置30分鐘后，進行下一步操作；b、過濾：緩慢將步驟a所得上層澄清液倒入過濾裝置，通過玻璃纖維濾膜進行過濾；c、處理：在步驟b所得過濾液中加入0.2g乙二胺四乙酸二鈉Na2EDTA，搖勻；用4M的硫酸調(diào)節(jié)pH至3.0，然后加入50mL色譜純級別的甲醇；d、固相提取：用10mL甲醇和10mL超純水分別活化固相提取小柱，再往柱子里面加載步驟c中處理好的溶液；加載完畢后用10mL超純水潤洗小柱，抽干柱子；e、保存：用2mL色譜純級別的甲醇洗脫柱子并收集洗脫液，并過0.22μm有機相濾頭，最后保存于2mL棕色進樣小瓶中；f、取樣：取出300μL步驟e中得到的溶液與300μL蒸餾水混合后用于檢測。所述超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀的色譜分離方法如下：色譜柱：ACQUITYUPLCBEHC18column，2.1×50mm，i.d.＝1.7μm；柱溫：40℃；流速：0.5mL·min-1；進樣體積：5μL；流動相梯度：溶液A：含0.1％甲酸的甲醇；溶液B：乙酸：水＝1:81；程序梯度：Initial,A:B＝5:95；1min,A:B＝9.5:90.5；2.2min,A:B＝23:77；4min,A:B＝45:55；4.2min,A:B＝75:25；4.21min,A:B＝9.5:90.5；6min,5:95；質(zhì)譜條件如下：離子源：電噴霧離子源ESI+；采集方式：多反應(yīng)檢測模式MRM；毛細管電壓3.5V；離子源溫度150℃；脫溶劑氣溫度450℃；脫溶劑氣流速800L/Hr；錐孔氣流速50L/Hr；碰撞能量3V。本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明檢測時間短，一個樣本僅需要1分鐘左右，靈敏度高，本方法的檢測限是1μg/kg，能夠滿足市場上所售的水產(chǎn)動物保健品的常規(guī)例行監(jiān)測需求，精確度高，回收率均值為93.45％。本發(fā)明能夠從特殊的基質(zhì)中鎖定和提取目標化合物，對市場上所售的水產(chǎn)動物保健品均適用。附圖說明圖1為磺胺嘧啶抗生素含量與檢測結(jié)果之間的標準曲線圖。圖2為魚肝寶中磺胺嘧啶的色譜圖。具體實施方式實施例1(1)標準曲線制備：從具備資質(zhì)的公司(如Dr.E)購買磺胺嘧啶標準溶液，利用色譜純級別的甲醇來溶解、稀釋成濃度為1mg/L的母液。把母液再次稀釋成5個不同濃度(0μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L和50μg/L)的磺胺嘧啶標準工作液。通過檢測，獲得實測數(shù)據(jù)，并繪制磺胺嘧啶抗生素含量與檢測結(jié)果之間的標準曲線圖，具體如圖1所示。(2)對待測的水產(chǎn)動物保健品進行處理，然后檢測，得到實測數(shù)據(jù)。(3)將步驟(2)中得到的實測結(jié)果與步驟(1)中獲得的標準曲線圖進行比對，即可得到樣品中磺胺嘧啶抗生素的含量。(4)用于上述檢測的設(shè)備是超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀。上述步驟(2)中所述的處理方法如下：a、稱量：精確稱取5g左右的魚肝寶樣品粉末，溶解到1000mL蒸餾水中。搖蕩5分鐘，然后超聲5分鐘。靜置30分鐘后，進行下一步操作。b、過濾：緩慢將上層澄清液倒入過濾裝置，通過玻璃纖維濾膜(WhatmanGF/F,0.7μm)，進行過濾。c、處理：在過濾液中加入0.2g乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)，搖勻。用4M的硫酸調(diào)節(jié)pH至3.0，然后加入50mL色譜純級別的甲醇。d、固相提取：用10mL甲醇和10mL超純水分別活化固相提取小柱，再往柱子里面加載步驟c中處理好的溶液。加載完畢后用10mL超純水潤洗小柱，抽干柱子。e、保存：用2mL色譜純級別的甲醇洗脫柱子并收集洗脫液，并過0.22μm有機相濾頭，最后保存于2mL棕色進樣小瓶中。f、取樣：取出300μL步驟e中得到的溶液與300μL蒸餾水混合后用于檢測。所述固相提取小柱型號是AnPu公司HLB固相萃取小柱，規(guī)格是500mg/6mL。所述超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀的色譜分離方法如下：色譜柱：ACQUITYUPLCBEHC18column(2.1×50mm,i.d.＝1.7μm)；柱溫：40℃；流速：0.5mL·min-1；進樣體積：5μL；流動相梯度：溶液A：含0.1％甲酸的甲醇；溶液B：乙酸：水＝1:81；程序梯度：Initial,A:B＝5:95；1min,A:B＝9.5:90.5；2.2min,A:B＝23:77；4min,A:B＝45:55；4.2min,A:B＝75:25；4.21min,A:B＝9.5:90.5；6min,5:95.所述超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀的質(zhì)譜條件如下：離子源：電噴霧離子源(ESI+)；采集方式：多反應(yīng)檢測模式(MRM)。毛細管電壓3.5V；離子源溫度150℃；脫溶劑氣溫度450℃；脫溶劑氣流速800L/Hr；錐孔氣流速50L/Hr；碰撞能量3V。其他參數(shù)條件如表1所示，其中子離子為定量離子。表1化合物名稱母離子/(m/z)子離子/(m/z)錐孔電壓/V碰撞能量/V保留時間/min磺胺嘧啶251.14592.08736401.20檢測結(jié)果：圖2為魚肝寶(一種水產(chǎn)動物保健品)中磺胺嘧啶在定量離子對下的質(zhì)量色譜圖及對應(yīng)的出峰時間，峰面積為1053，標準曲線計算，得出魚肝寶中磺胺嘧啶的含量為8.42μg/g。當前第1頁1 2 3