本發(fā)明涉及成分檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及利用UFLC法同時(shí)檢測(cè)山茱萸中5種三萜酸成分的方法。

背景技術(shù)：

山茱萸為山茱萸科植物山茱萸(Cornus offcinalis Sieb.et Zucc)的干燥成熟果肉，味酸、澀，性微溫，歸肝、腎經(jīng)，具有補(bǔ)益肝腎、澀精固脫的功效。近年來山茱萸及其提取物已被證明有多種藥理活性，如抗炎、抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂、保肝以及神經(jīng)保護(hù)等作用。山茱萸中主要化學(xué)成分有環(huán)烯醚萜苷類、鞣質(zhì)、黃酮、有機(jī)酸、多糖、三萜類、揮發(fā)性成分等。山茱萸中的三萜酸大部分屬于三萜類中的五環(huán)三萜酸，目前檢測(cè)到山茱萸三萜酸成分主要包括熊果酸、齊墩果酸、山楂酸、科羅索酸、白樺脂酸，參見袁菊麗等.山茱萸的主要化學(xué)成分及藥理作用[J].化學(xué)與生物工程,2011,05:7-9；劉博等.HPLC法測(cè)定山茱萸中科羅索酸的含量[J].藥物分析雜志,2011,12:2217-2219；劉博,吳和珍.山茱萸藥材中三萜類成分的研究[J].湖北中醫(yī)雜志,2010,12:75-76。已有研究表明山茱萸中的三萜酸可以降低血糖、改善糖尿病并發(fā)癥如心肌病變、視網(wǎng)膜病變、糖尿病腎病等，因此檢測(cè)山茱萸中三萜酸成分及其含量對(duì)于預(yù)防和治療糖尿病及其并發(fā)癥具有指導(dǎo)意義。

目前關(guān)于山茱萸中三萜酸成分都是獨(dú)立檢測(cè)，金德莊等運(yùn)用HPLC的方法分析山茱萸中熊果酸、齊墩果酸含量，劉博等運(yùn)用HPLC法檢測(cè)山茱萸中科羅索酸含量，山楂酸和科羅索酸、齊墩果酸和熊果酸為同分異構(gòu)體，這5種酸同為山茱萸中三萜酸其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)相似，用高效液相色譜法測(cè)定分析時(shí)間較長(zhǎng)且不易分離，如何快速、準(zhǔn)確地同時(shí)測(cè)定山茱萸中山楂酸、科羅索酸、白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸含量具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，提供一種利用UFLC法同時(shí)檢測(cè)山茱萸中5種三萜酸成分的方法，能夠快速檢測(cè)出山茱萸中5種三萜酸成分含量，且精確度高。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

包括以下步驟：

(1)分別配置熊果酸、齊墩果酸、山楂酸、科羅索酸和白樺脂酸的對(duì)照品溶液，對(duì)對(duì)照品溶液進(jìn)行色譜分析，獲得熊果酸、齊墩果酸、山楂酸、科羅索酸和白樺脂酸的峰面積，以對(duì)照品溶液的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，對(duì)照品溶液中各組分的峰面積為縱坐標(biāo)分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

(2)向山茱萸粉末中加入提取劑，提取得到樣品溶液，將樣品溶液抽濾，所得濾液為供試液；

(3)對(duì)供試液進(jìn)行色譜分析，獲得供試液中各被測(cè)組分的峰面積，以供試液中各被測(cè)組分的峰面積為縱坐標(biāo)代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，得出供試液中各被測(cè)組分的進(jìn)樣量，再計(jì)算得到供試液中熊果酸、齊墩果酸、山楂酸、科羅索酸和白樺脂酸的含量，完成利用UFLC法同時(shí)對(duì)山茱萸中5種三萜酸成分的檢測(cè)。

進(jìn)一步地，步驟(1)中采用甲醇分別配置熊果酸、齊墩果酸、山楂酸、科羅索酸和白樺脂酸的對(duì)照品溶液。

進(jìn)一步地，步驟(1)中熊果酸、齊墩果酸、山楂酸、科羅索酸和白樺脂酸的對(duì)照品溶液的濃度分別為0.8mg/mL、0.1mg/mL、0.005mg/mL、0.005mg/mL和0.001mg/mL。

進(jìn)一步地，步驟(2)中提取劑為體積分?jǐn)?shù)40～80％乙醇溶液。

進(jìn)一步地，步驟(2)中山茱萸粉末和提取劑之比為1g：(5～25)mL。

進(jìn)一步地，步驟(2)中提取6～15min。

進(jìn)一步地，步驟(2)中在超聲微波組合反應(yīng)系統(tǒng)中提取，其中，微波功率為100～500W，超聲功率為120～600W。

進(jìn)一步地，步驟(2)中提取的溫度為40～80℃。

進(jìn)一步地，步驟(2)中向所得濾液中加入提取劑，直至所得溶液重量與樣品溶液重量相同，得到供試液。

進(jìn)一步地，步驟(1)和步驟(3)的色譜分析條件為：Shim-pack XR-ODS III色譜柱，規(guī)格2.0mm×75mm×1.6μm；流動(dòng)相：體積比為84:16的甲醇-40mmol/L磷酸二氫鉀緩沖液；流速0.2mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm；柱溫：35℃；進(jìn)樣體積：1μL。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：

本發(fā)明應(yīng)用超高效液相色譜(UFLC)法，對(duì)山茱萸成分進(jìn)行分析研究，具有超強(qiáng)的分離能力及超高靈敏度，其在峰容量、分析效率、靈敏度和分辨率方面均優(yōu)于常規(guī)HPLC，可在極短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到柱平衡或重新平衡，顯著減少分析時(shí)間，在9.0min內(nèi)即可獲得很好的分離效果；同時(shí)會(huì)減少溶劑、樣品消耗，該方法精密度高、重現(xiàn)性好、操作簡(jiǎn)便，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，是一種高效、環(huán)保、可行的質(zhì)量評(píng)價(jià)技術(shù)。該法快速、簡(jiǎn)便、分離效果好，準(zhǔn)確度好，可用于山茱萸藥材有效成分分析及質(zhì)量控制。

進(jìn)一步地，本發(fā)明通過調(diào)節(jié)料液比、提取時(shí)間、微波功率和超聲功率等條件，提高提取率。

【附圖說明】

圖1是對(duì)照品的色譜圖。

圖2是山茱萸樣品的色譜圖。

圖3是不同料液比對(duì)總?cè)扑崽崛÷式Y(jié)果比較曲線圖。

圖4是不同提取時(shí)間對(duì)總?cè)扑崽崛÷式Y(jié)果比較曲線圖。

圖5是不同提取溫度對(duì)總?cè)扑崽崛÷式Y(jié)果比較曲線圖。

圖6是不同乙醇濃度對(duì)總?cè)扑崽崛÷式Y(jié)果曲線比較圖。

圖7是不同微波功率對(duì)總?cè)扑崽崛÷式Y(jié)果比較曲線圖。

圖8是不同超聲功率對(duì)總?cè)扑崽崛÷式Y(jié)果比較曲線圖。

其中：1.山楂酸2.科羅索酸3.白樺脂酸4.齊墩果酸5.熊果酸。

【具體實(shí)施方式】

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。

1.儀器與材料

Nexera UHPLC LC-30A(日本SHIMADZU)：LC-30AD二元泵系統(tǒng)，SIL-30AC自動(dòng)進(jìn)樣器，SPD-20A UFLC紫外可見檢測(cè)器，CTO-30A柱溫箱；超純水儀(美國(guó)Milipore公司)；精密微量移液器(德國(guó)Eppendorf公司)；AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；超聲波微波組合反應(yīng)系統(tǒng)(南京先歐儀器制造有限公司)；SYFM-8Ⅱ型微粉機(jī)(濟(jì)南松岳機(jī)器)。

熊果酸對(duì)照品(成都曼斯特生物科技有限公司，批號(hào)：MUST-15082905)，齊墩果酸對(duì)照品(成都曼斯特生物科技有限公司，批號(hào)：MUST-15030105)，山楂酸對(duì)照品(成都曼斯特生物科技有限公司，批號(hào)：MUST-16072803)，科羅索酸對(duì)照品(成都曼斯特生物科技有限公司，批號(hào)：MUST-16052204)，白樺脂酸對(duì)照品(成都曼斯特生物科技有限公司，批號(hào)：MUST-16032403)。甲醇、磷酸二氫鉀為色譜純，水為超純水。山茱萸采自陜西省丹鳳縣，經(jīng)陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院肖婭萍教授鑒定為山茱萸(Cornus offcinalis Sieb.et Zucc.)的干燥成熟果肉。將以上藥材干燥，粉碎，干燥保存，備用。

2.方法與結(jié)果

2.1混合對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取熊果酸、齊墩果酸、山楂酸、科羅索酸對(duì)照品各0.7mg，白樺脂酸對(duì)照品1.4mg，甲醇溶解，1mL容量瓶定容。分別精密量取上述5種對(duì)照品溶液各200μL置于1mL容量瓶中，0.22μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，將續(xù)濾液混合即得混合對(duì)照品溶液。

2.2供試品溶液的制備

精密稱取山茱萸粉末1.00g，置于XO-200型專用玻璃反應(yīng)瓶中，加體積分?jǐn)?shù)為60～90％的乙醇溶液5～25mL密封，稱重質(zhì)量為A，連接好回流裝置，于XO-200超聲微波組合反應(yīng)系統(tǒng)中提取6～15min，其中，微波功率100～500W，超聲功率120～600W，溫度40～80℃，取出，抽濾，所得濾液再用體積分?jǐn)?shù)為60～90％乙醇溶液補(bǔ)至原重量A，搖勻，0.22μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試液。

2.3色譜條件

色譜柱為Shim-pack XR-ODS III(2.0mm×75mm，1.6μm)；流動(dòng)相：甲醇-40mmol/L磷酸二氫鉀緩沖液(84:16，v/v)；流速0.2mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm；柱溫：35℃；進(jìn)樣體積：1μL。在上述色譜條件下，各被測(cè)組分理論塔板數(shù)均不低于8000，樣品中各被測(cè)組分與相鄰峰分離度均大于1.5，混合對(duì)照品色譜圖見圖1。

2.4方法學(xué)考察

本發(fā)明包括以下步驟：

(1)分別配置熊果酸、齊墩果酸、山楂酸、科羅索酸和白樺脂酸的對(duì)照品溶液，對(duì)對(duì)照品溶液分別進(jìn)行色譜分析，分別獲得熊果酸、齊墩果酸、山楂酸、科羅索酸和白樺脂酸的峰面積，以對(duì)照品溶液的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，對(duì)照品溶液中各組分的峰面積為縱坐標(biāo)分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

M＝V_標(biāo)×C_標(biāo)，其中M為對(duì)照品溶液的進(jìn)樣量，μg；V_標(biāo)是對(duì)照品溶液的進(jìn)樣體積，μL；C_標(biāo)是對(duì)照品溶液的濃度，mg/mL。

(2)按以上2.2獲取供試液；

(3)按以上2.3的色譜條件，對(duì)供試液進(jìn)行色譜分析，獲得供試液中各被測(cè)組分的峰面積，將供試液中各被測(cè)組分的峰面積為縱坐標(biāo)代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，得出供試液中各被測(cè)組分的進(jìn)樣量，再計(jì)算得到供試液中熊果酸、齊墩果酸、山楂酸、科羅索酸和白樺脂酸的含量，完成利用UFLC法同時(shí)對(duì)山茱萸中5種三萜酸成分的檢測(cè)。

X＝(m×V_供)/V_樣。X是供試液中各被測(cè)組分的含量；m為供試液中各被測(cè)組分的進(jìn)樣量；V_供為供試液體積，V_樣為供試液的進(jìn)樣體積。

2.4.1線性關(guān)系的考察

精密稱取熊果酸對(duì)照品0.8mg，齊墩果酸對(duì)照品0.8mg，山楂酸、科羅索酸、白樺脂酸對(duì)照品各1.3mg，甲醇溶解，1mL容量瓶定容。將上述溶液分別稀釋成0.8mg/mL熊果酸、0.1mg/mL齊墩果酸，0.005mg/mL山楂酸，0.005mg/mL科羅索酸，0.001mg/mL白樺脂酸。分別進(jìn)熊果酸和齊墩果酸對(duì)照品溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.8、1.0μL，山楂酸和科羅索酸1、2、3、4、5、6μL，白樺脂酸2、3、4、6、8、10μL。在上述色譜條件下分析，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，各組分在色譜圖中的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。各對(duì)照品只有在上述濃度下表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。各組分的線性關(guān)系見表1，各組分線性關(guān)系良好。

表1山茱萸5中成分回歸方程

2.4.2精密度試驗(yàn)

取2.1的混合對(duì)照品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定山楂酸、科羅索酸、白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸各組分峰面積，計(jì)算RSD分別為1.01％，1.27％，1.76％，1.98％，2.13％，說明儀器精密度良好。

2.4.3重復(fù)性試驗(yàn)

稱取1.00g山茱萸樣品5份，按上述制備供試品溶液方法制備，按上述色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算山楂酸、科羅索酸、白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸各組分含量RSD分別為2.08％，1.16％，2.08％，1.38％，0.56％，說明儀器重現(xiàn)性良好。

2.4.4穩(wěn)定性試驗(yàn)

取山茱萸供試品溶液，按上述色譜條件下分別于0、2、4、8、12h進(jìn)樣分析，測(cè)得山楂酸、科羅索酸、白樺脂酸、熊果酸、齊墩果酸峰面積的RSD分別為1.86％，1.20％，2.19％，1.34％，0.55％，說明樣品在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5加樣回收試驗(yàn)

稱取已知含量的山茱萸樣品3份，分別加入一定量山楂酸、科羅索酸、白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸對(duì)照品溶液，制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表2。

表2 5種酸加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n＝9)

2.4.6樣品含量測(cè)定

按上述供試品溶液制備方法制備樣品，在上述色譜條件下分析，色譜圖見圖1和圖2所示，測(cè)得各組分的含量分別為0.0137％，0.0169％，0.0019％，0.0528％，0.1864％。

3.實(shí)施例

本實(shí)驗(yàn)采用了超聲-微波提取法考察了料液比、乙醇濃度、提取時(shí)間、超聲功率、微波功率、提取溫度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

實(shí)施例1料液比的選擇

本實(shí)例實(shí)驗(yàn)選取料液比1:5、1:10、1:15、1:20、1:25五種料液比分別對(duì)山茱萸粉末進(jìn)行提取，取山茱萸粉末1g置于XO-200型專用玻璃反應(yīng)瓶中，分別加入不同體積60％乙醇，超聲功率300w，溫度50℃，微波功率400w，提取時(shí)間5min。分別取上清液，用香草醛-高氯酸顯色法測(cè)定總?cè)扑岷?；如圖3所示，結(jié)果表明，在1:5～1:15時(shí)隨著料液比的增大，提取率升高，料液比為1:20～1:25時(shí)，提取率變化減小，故本發(fā)明中料液比確定為1:15～1:25，考慮到節(jié)省溶劑目的，故選取1:20為最佳料液比。

實(shí)施例2提取時(shí)間的選擇

本實(shí)例考察了不同提取時(shí)間對(duì)總?cè)扑崽崛÷实挠绊?，?g山茱萸粉末置于XO-200型專用玻璃反應(yīng)瓶中，加入20mL體積分?jǐn)?shù)60％乙醇，超聲功率300w，微波功率400w，溫度50℃，提取時(shí)間分別為3、6、9、12、15min，按照不同提取時(shí)間依次進(jìn)行提取。分別取上清液，用香草醛-高氯酸顯色法測(cè)定總?cè)扑岷浚蝗鐖D4所示，結(jié)果表明，在提取時(shí)間為3～9min時(shí)，提取率依次增大，在提取時(shí)間為9～15min，提取率依次減小。故本發(fā)明中提取時(shí)間確定為6～15min，考慮到提取完全，選擇最優(yōu)提取時(shí)間為9min。

實(shí)施例3提取溫度的選擇

本實(shí)例考察了不同提取溫度對(duì)提取率的影響，分別選取不同提取溫度40℃、50℃、60℃、70℃、80℃分別對(duì)山茱萸粉末進(jìn)行提取，取山茱萸粉末1g置于XO-200型專用玻璃反應(yīng)瓶中，分別加入體積分?jǐn)?shù)60％乙醇20mL，超聲功率300w，微波功率400w，提取時(shí)間9min。分別取上清液，用香草醛-高氯酸顯色法測(cè)定總?cè)扑岷?；如圖5所示，結(jié)果表明，在提取溫度為40～50℃時(shí)，提取率逐漸增大，在提取溫度為50℃～80℃時(shí)，提取率逐漸下降，考慮到提取完全，最終選擇提取溫度50℃為最優(yōu)條件。

實(shí)施例4乙醇濃度的選擇

本實(shí)例考察了不同乙醇濃度對(duì)提取率的影響，分別選取不同乙醇濃度40％、50％、60％、70％、80％分別對(duì)山茱萸粉末進(jìn)行提取，取山茱萸粉末1g置于XO-200型專用玻璃反應(yīng)瓶中，分別加入不同體積分?jǐn)?shù)乙醇20mL，超聲功率300w，微波功率400w，提取時(shí)間9min。分別取上清液，用香草醛-高氯酸顯色法測(cè)定總?cè)扑岷浚蝗鐖D6所示，結(jié)果表明，在乙醇濃度為40％～60％時(shí)，提取率逐漸增大，在提取溫度為60％～80％時(shí)，提取率逐漸下降，考慮到提取完全，最終選擇提取溫度60％為最優(yōu)條件。

實(shí)施例5微波功率的選擇

本實(shí)例考察了不同微波功率對(duì)提取率的影響，分別選取不同微波功率100w、200w、300w、400w、500w分別對(duì)山茱萸粉末進(jìn)行提取，取山茱萸粉末1g置于XO-200型專用玻璃反應(yīng)瓶中，分別加入體積分?jǐn)?shù)60％乙醇20mL，超聲功率300w，溫度50℃，提取時(shí)間9min。分別取上清液，用香草醛-高氯酸顯色法測(cè)定總?cè)扑岷?；如圖7所示，結(jié)果表明，在微波功率為100w～200w時(shí)，提取率逐漸增大，在微波功率為300w～500w時(shí)，提取率逐漸下降，考慮到提取完全，最終選擇微波功率200w為最優(yōu)條件。

實(shí)施例6超聲功率的選擇

本實(shí)例考察了不同超聲功率對(duì)提取率的影響，分別選取不同超聲功率120w、240w、360、480w、600w分別對(duì)山茱萸粉末進(jìn)行提取，取山茱萸粉末1g置于XO-200型專用玻璃反應(yīng)瓶中，分別加入體積分?jǐn)?shù)60％乙醇20mL，微波功率200w，溫度50℃，提取時(shí)間9min。分別取上清液，用香草醛-高氯酸顯色法測(cè)定總?cè)扑岷浚蝗鐖D8所示，結(jié)果表明，在超聲功率120w～360w時(shí)，提取率逐漸增大，在超聲功率為360w～600w時(shí)，提取率下降，考慮到提取完全，最終選擇超聲功率360w為最優(yōu)條件。

根據(jù)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，采用如下表1所示的四因素三水平對(duì)本發(fā)明進(jìn)行驗(yàn)證。

表1試驗(yàn)因素水平及編碼表

利用Design-Expert.8.05b軟件對(duì)表1-2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到二次多項(xiàng)回歸方程為：

R1＝32.61+3.84A+0.22B-0.73C-0.26D+0.50AB-0.46AC-0.22AD+1.44BC-0.76BD-0.30CD-0.74A²+0.81B²+0.49C²-0.91D²。

回歸方程的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表1-3。由表1-3可知，該模型p<0.05，表明該模型顯著，失擬項(xiàng)不顯著(p＝0.3675>0.05)，表明該模型能較好地描述個(gè)因素與響應(yīng)值間的關(guān)系。相關(guān)系數(shù)R²＝0.7570，說明響應(yīng)值的變化75.7％來源于模型。各因素對(duì)響應(yīng)值的影響順序是A(料液比)>B(提取時(shí)間)>C(微波功率)>D超聲功率。

表1-2中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表1-3回歸方差分析結(jié)果

注：*表示顯著(0.05<P<0.01)，**表示極顯著(p<0.01)

運(yùn)用Design-Expert.8.05b軟件和其回歸方程求出最佳提取工藝為料液比1:20，提取時(shí)間9min，微波功率200w，超聲功率396.67w，在該條件下測(cè)得山茱萸總?cè)扑岷繛?8.71mg/g。考慮到實(shí)際操作具體情況，最終確定提取工藝為：料液比1:20，提取時(shí)間9min，微波功率200w，超聲功率396w。在此最佳條件下進(jìn)行三次重復(fù)試驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得的平均含量為35.31mg/g，與理論值相比，RSD為2.04％，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.79，說明本發(fā)明方法可靠，可用于山茱萸總?cè)扑岬奶崛　?/p>

結(jié)果表明：60％乙醇，50℃，超聲功率396W，微波功率200W，反應(yīng)時(shí)間9min為最優(yōu)提取條件。

本發(fā)明應(yīng)用UFLC法，在9.0min內(nèi)即可同時(shí)分離山茱萸中5種三萜酸成分且分離效果良好。與HPLC法相比，UFLC法分析時(shí)間短，溶劑消耗少，具有快速、環(huán)保、高效等優(yōu)點(diǎn)。該法快速、簡(jiǎn)便、分離效果好，準(zhǔn)確度好，可用于山茱萸藥材有效成分分析及質(zhì)量控制。