本發(fā)明屬于藥學(xué)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及具有ACC1蛋白調(diào)控作用的五環(huán)三萜類化合物及其用途及其在制備抗腫瘤的藥物中的用途。

背景技術(shù)：

近20多年來(lái)，世界上多數(shù)國(guó)家結(jié)直腸癌(主要是結(jié)腸癌)發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。隨著人們生活水平的提高，飲食習(xí)慣與結(jié)構(gòu)的改變，加之人口老齡化趨勢(shì)影響，我國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病人數(shù)和死亡人數(shù)也呈增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年新發(fā)病例已超過(guò)17萬(wàn)，是我國(guó)發(fā)病率排第四位的惡性腫瘤性疾病。結(jié)直腸癌的中位發(fā)病年齡在中國(guó)比歐美提前約十年，青年患者比歐美多見，這是結(jié)直腸癌在中國(guó)的一個(gè)特點(diǎn)。結(jié)直腸癌的病因尚未完全清楚，目前認(rèn)為主要是遺傳因素、環(huán)境因素、免疫因素等綜合作用的結(jié)果。

11羰基-β-乙酰乳香酸的英文全名是：Acetyl-11-keto-β-boswellic acid，簡(jiǎn)稱AkβBA或AKBA，其具有如圖1A的結(jié)構(gòu)式。是植物卡式乳香樹的膠狀樹脂-乳香含有的重要成份之一。從天然乳香樹提取物中富集純化AKBA已經(jīng)描述于國(guó)際專利申請(qǐng)WO 03/0746，美國(guó)專利20030199581以及國(guó)際專利申請(qǐng)WO 03/077860中。更高純度的產(chǎn)品可以通過(guò)色譜分離以及重結(jié)晶的方法而獲得。

乳香提取物已經(jīng)在傳統(tǒng)的醫(yī)藥中被用作抗炎劑，如對(duì)關(guān)節(jié)炎以及潰瘍性結(jié)腸炎患者的治療。另外乳香酸由于其抗增殖作用而受到關(guān)注，乳香酸在體外可以抑制幾種白血病細(xì)胞株，黑素瘤的生長(zhǎng)并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。但是，現(xiàn)有的乳香酸的抗增殖作用還有待提高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供具有ACC1蛋白調(diào)控作用的五環(huán)三萜類化合物及 其用途及其在制備抗腫瘤的藥物中的用途。

在本發(fā)明的第一方面，提供式(I)所示化合物或其異構(gòu)體、溶劑合物或前體，或它們的藥學(xué)上可接受的鹽的用途，用于制備治療腫瘤的藥物；

其中，R獨(dú)立地選自：氫、羥基、C1-C4烷基、C2-C4鏈烯基、C2-C4鏈炔基、鹵素。

在一個(gè)優(yōu)選例中，式(I)所示化合物中，R獨(dú)立地選自：氫、羥基、C1-C2烷基。

在另一優(yōu)選例中，所述的式(I)所示化合物或其異構(gòu)體、溶劑合物或前體，或它們的藥學(xué)上可接受的鹽通過(guò)靶向結(jié)合ACC1蛋白，調(diào)控ACC1蛋白功能，抑制腫瘤的生長(zhǎng)。

在另一優(yōu)選例中，所述的腫瘤是ACC1過(guò)表達(dá)或過(guò)度活化的腫瘤。

在另一優(yōu)選例中，所述的腫瘤包括：結(jié)腸癌，淋巴癌，胰腺癌，肝癌，卵巢癌。

在另一優(yōu)選例中，所述的式(I)化合物通過(guò)以下方法制備：以11羰基-β-乙酰乳香酸為原料，將其AcO-基團(tuán)替換為基團(tuán)。

在另一優(yōu)選例中，所述的式(I)化合物通過(guò)以下方法制備：

(i)以11-羰基-β-乙酰乳香酸為原料，與堿反應(yīng)獲得11-羰基-β-乳香酸；和

(ii)將11-羰基-β-乳香酸與環(huán)己甲酰氯反應(yīng)，獲得式(I)所示化合物。

所述的堿包括但不限于：有機(jī)堿，例如三乙胺、三丁胺、N-甲基嗎啉、N，N-二異丙基乙胺、N-甲基吡咯烷、吡啶、4-(N，N-二甲基氨基)吡啶、嗎啉、咪唑、2-甲基咪唑、4-甲基咪唑等；無(wú)機(jī)堿，例如堿金屬氫化物如氫 化鈉、氫化鉀等；氨基鈉；正丁基鋰；二異丙基氨基鋰；堿金屬氫氧化物例如氫氧化鋰、氫氧化鈉、氫氧化鉀和氫氧化銫；堿土金屬氫氧化物例如氫氧化鋁、氫氧化鎂、氫氧化鈣等；堿金屬碳酸鹽例如碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸鋰、碳酸銫等；堿土金屬碳酸鹽例如碳酸鎂、碳酸鈣等；堿金屬碳酸氫鹽例如碳酸氫鈉、碳酸氫鉀等；離子交換樹脂，包括與離子例如鈉離子、鉀離子、鋰離子、鈣離子、鎂離子、取代的或未取代的銨離子等結(jié)合的樹脂；以及其他適合的堿。

在另一優(yōu)選例中，所述方法中，步驟(i)包括：在雙口瓶中加入acetyl-11-keto-β-boswellic acid(簡(jiǎn)稱AKBA)和氫氧化鉀(KOH)，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入異丙醇作為溶劑；加熱回流反應(yīng)，待反應(yīng)體系冷卻到室溫，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干溶劑，得到白色固體，加入二氯甲烷后加入稀鹽酸調(diào)節(jié)混合體系pH值至酸性；用二氯甲烷萃取水相，收集二氯甲烷溶劑，用無(wú)水硫酸鎂干燥，旋干溶劑得到棕色油狀產(chǎn)物，使用石油醚：乙酸乙酯作為洗脫劑，用柱層析法提純，得到白色固體11-羰基-β-乳香酸(簡(jiǎn)稱KBA)；步驟(ii)包括：將KBA溶于二氯甲烷(含有4-二甲基吡啶)，加入三乙胺和環(huán)己基上取代或非取代的環(huán)己甲酰氯，冰浴過(guò)夜；反應(yīng)完全后，用碳酸氫鈉溶液處理，并用二氯甲烷萃取，收集二氯甲烷溶劑，用無(wú)水硫酸鎂干燥混合物，旋干溶劑得到白色固體。用石油醚：乙酸乙酯作為洗脫劑，用柱層析法提純，得到?；a(chǎn)物3-o-α-cyclohexanoyl-11-keto-β-boswellic acid(簡(jiǎn)稱CKBA)。

在本發(fā)明的另一方面，提供式(I)所示化合物或其異構(gòu)體、溶劑合物或前體，或它們的藥學(xué)上可接受的鹽的用途，用于制備靶向結(jié)合ACC1蛋白和調(diào)控ACC1蛋白的組合物；

其中，R獨(dú)立地選自：氫、羥基、C1-C4烷基、C2-C4鏈烯基、C2-C4 鏈炔基、鹵素。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于治療腫瘤的藥物組合物，所述的藥物組合物包含：式(I)所示化合物或其異構(gòu)體、溶劑合物或前體，或它們的藥學(xué)上可接受的鹽；和藥學(xué)上可接受的載體；

其中，R獨(dú)立地選自：氫、羥基、C1-C4烷基、C2-C4鏈烯基、C2-C4鏈炔基、鹵素。

在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的藥物組合物中，所述的藥學(xué)上可接受的載體是羧甲基纖維素鈉和水混合獲得的混懸液。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種治療腫瘤的方法，所述方法包括：給予需要治療的對(duì)象有效量的式(I)所示化合物或其異構(gòu)體、溶劑合物或前體，或它們的藥學(xué)上可接受的鹽；

其中，R獨(dú)立地選自：氫、羥基、C1-C4烷基、C2-C4鏈烯基、C2-C4鏈炔基、鹵素。

本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。

附圖說(shuō)明

圖1：AKBA和CKBA結(jié)構(gòu)式。

A，AKBA結(jié)構(gòu)式；

B，CKBA結(jié)構(gòu)式(式(II)化合物)。

圖2：CKBA及AKBA對(duì)多種人結(jié)腸癌細(xì)胞株生長(zhǎng)抑制效果。

A-B，CKBA及AKBA對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116的抑制效果；

C-D，CKBA及AKBA對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株Lovo的抑制效果；

E-F，CKBA及AKBA對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29的抑制效果；

G-H，CKBA及AKBA對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480的抑制效果。

圖3：CKBA顯著抑制腸炎相關(guān)結(jié)腸癌模型中結(jié)腸腫瘤的生長(zhǎng)。

A，給予CKBA治療的小鼠的結(jié)腸部位照片；

B，給予CMC-Na的小鼠的結(jié)腸部位照片；

C，分別給予CKBA及CMC-Na的小鼠結(jié)腸中的腫瘤大?。豢v坐標(biāo)是腫瘤大小的評(píng)分。

D，分別給予CKBA及CMC-Na的小鼠結(jié)腸中的腫瘤負(fù)荷(所有腫瘤大小評(píng)分相加后得到的值，為腫瘤大小和個(gè)數(shù)的綜合評(píng)分)。

圖4：CKBA顯著抑制結(jié)腸癌皮下移植瘤的生長(zhǎng)。

圖5：AKBA和CKBA的生物素標(biāo)記。

圖6：AKBA和CKBA共同作用靶點(diǎn)ACC1(其編碼基因?yàn)锳CACA)的鑒定。

A，SDS-PAGE分析和銀染結(jié)果；

B，銀染差異條帶質(zhì)譜打分結(jié)果(部分)。

圖7：蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)顯示AKBA和CKBA作用于ACC1。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明人經(jīng)過(guò)深入的研究，首次揭示一種新的五環(huán)三萜結(jié)構(gòu)修飾化合物，其能夠有效地治療腫瘤如結(jié)腸癌，通過(guò)靶向結(jié)合ACC1蛋白來(lái)發(fā)揮抗腫瘤的作用。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。

術(shù)語(yǔ)

本文所用的術(shù)語(yǔ)“烷基”指直鏈或支鏈飽和的、含有1-4個(gè)碳原子(較佳地1-2個(gè)碳原子)的脂族烴類基團(tuán)。例如，烷基包括但不限于甲基，乙基，正丙基，異丙基，正丁基，異丁基，叔丁基。

本文所用的術(shù)語(yǔ)“鏈烯基”包括含有至少一個(gè)碳碳雙鍵和2-4個(gè)碳原子(較佳地2-3個(gè)碳原子)的直鏈和支鏈烴基。

本文所用的術(shù)語(yǔ)“鏈炔基”包括含有至少一個(gè)碳碳三鍵和2-4個(gè)碳原子(較佳地2-3個(gè)碳原子)的直鏈和支鏈烴基。

本文所用的術(shù)語(yǔ)“鹵素”指F、Cl、Br、或I。

本文所用的術(shù)語(yǔ)“異構(gòu)體”包括：幾何異構(gòu)體、對(duì)映異構(gòu)體、非對(duì)映異構(gòu)體(如順?lè)串悩?gòu)體，構(gòu)象異構(gòu)體)。

本文所用的的表示方法是本領(lǐng)域人員熟知的，其表示基團(tuán)R可以取代在環(huán)上的任意一個(gè)或多個(gè)可被取代的位置。并且，在不同的取代位置上，R的選擇可以是不同的。

本文所用的術(shù)語(yǔ)“溶劑合物”表示攜帶有溶劑分子的化合物，例如，所述的溶劑合物可以是水合物。

本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“含有”表示各種成分可一起應(yīng)用于本發(fā)明的混合物或組合物中。因此，術(shù)語(yǔ)“主要由...組成”和“由...組成”包含在術(shù)語(yǔ)“含 有”中。

本發(fā)明中，“藥學(xué)上可接受的”成分是適用于人和/或動(dòng)物而無(wú)過(guò)度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))即有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比的物質(zhì)。

本發(fā)明中，“藥學(xué)上可接受的載體”是用于將本發(fā)明的式(I)化合物、異構(gòu)體、溶劑合物、前體，或它們的藥學(xué)上可接受的鹽傳送給動(dòng)物或人的藥學(xué)上或食品上可接受的溶劑、懸浮劑或賦形劑。載體可以是液體或固體。

如本發(fā)明所用，所述的“ACC1表達(dá)或過(guò)表達(dá)相關(guān)的腫瘤”是指一類腫瘤，該類腫瘤的生長(zhǎng)必需依靠ACC1表達(dá)或過(guò)表達(dá)，抑制該類腫瘤中ACC1的表達(dá)或活性可使得腫瘤的生長(zhǎng)受到抑制甚至凋亡。

化合物

本發(fā)明人在11羰基-β-乙酰乳香酸(AKBA)基礎(chǔ)上進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，獲得了經(jīng)修飾的五環(huán)三萜結(jié)構(gòu)化合物，相較于AKBA，該經(jīng)修飾的五環(huán)三萜結(jié)構(gòu)化合物的體外抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的能力顯著性增強(qiáng)。并且，該經(jīng)修飾的五環(huán)三萜結(jié)構(gòu)化合物具有卓越的體內(nèi)抑制腸炎相關(guān)結(jié)腸癌模型和人結(jié)腸癌腫瘤移植模型腫瘤生成能力。

基于本發(fā)明人的新發(fā)現(xiàn)，首先提供了一種如結(jié)構(gòu)式(I)所示的化合物：

其中，R獨(dú)立地選自：氫、羥基、C1-C4烷基、C2-C4鏈烯基、C2-C4鏈炔基、鹵素。較佳地，R獨(dú)立地選自：氫、羥基、C1-C2烷基。

本發(fā)明還包括上述式(I)化合物的異構(gòu)體、溶劑合物、前體，或它們的藥 學(xué)上可接受的鹽，只要它們也具有與式(I)化合物具有相同或基本相同的功能。所述的“藥學(xué)上可接受的鹽”是指化合物與無(wú)機(jī)酸、有機(jī)酸、堿金屬或堿土金屬等反應(yīng)生成的鹽。這些鹽包括(但不限于)：(1)與如下無(wú)機(jī)酸形成的鹽：如鹽酸、硫酸、硝酸、磷酸；(2)與如下有機(jī)酸形成的鹽，如乙酸、草酸、丁二酸、酒石酸、甲磺酸、馬來(lái)酸、或精氨酸。其它的鹽包括與堿金屬或堿土金屬(如鈉、鉀、鈣或鎂)形成的鹽，以酯、氨基甲酸酯，或其它常規(guī)的“前體藥物”的形式?；衔锞哂幸粋€(gè)或多個(gè)不對(duì)稱中心。所以，這些化合物可以作為外消旋的混合物、單獨(dú)的對(duì)映異構(gòu)體、單獨(dú)的非對(duì)映異構(gòu)體、非對(duì)映異構(gòu)體混合物、順式或反式異構(gòu)體存在。

所述的“化合物的前體”指當(dāng)用適當(dāng)?shù)姆椒ǚ煤螅摶衔锏那绑w在病人體內(nèi)進(jìn)行代謝或化學(xué)反應(yīng)而轉(zhuǎn)變成結(jié)構(gòu)式(I)的一種化合物，或化學(xué)結(jié)構(gòu)式(I)的一個(gè)化合物所組成的鹽或溶液。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述的化合物具有式(II)所示的結(jié)構(gòu)。

式(II)化合物的英文名為3-o-α-cyclohexanoyl-11-keto-β-boswellic acid，簡(jiǎn)稱CKBA。

本領(lǐng)域人員應(yīng)理解，在得知了本發(fā)明化合物的結(jié)構(gòu)以后，可通過(guò)多種本領(lǐng)域熟知的方法、利用公知的原料，來(lái)獲得本發(fā)明的化合物，比如化學(xué)合成或從生物(如動(dòng)物或植物)中提取的方法，這些方法均包含在本發(fā)明中。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，提供了一種制備本發(fā)明的式(I)所示的化合物的方法，所述方法包括：以11羰基-β-乙酰乳香酸為原料，將其AcO-基團(tuán)替換為基團(tuán)。更佳地，制備步驟包括：(i)以11羰基-β-乙酰乳香酸(AKBA) 為原料，與堿(如KOH)反應(yīng)獲得11-羰基-β-乳香酸；和(ii)將11-羰基-β-乳香酸與環(huán)己甲酰氯反應(yīng)，獲得式(I)所示化合物。其它的制備式(I)化合物的方法也被包含在本發(fā)明中，例如可以以11-羰基-β-乳香酸(KBA)為原料，使其與環(huán)己甲酰氯反應(yīng)直接獲得式(I)所示化合物。

合成的化合物可以進(jìn)一步通過(guò)柱層析法、高效液相色譜法等方式進(jìn)一步純化。

用途

本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，相比于11羰基-β-乙酰乳香酸(AKBA)，本發(fā)明的式(II)化合物具有更顯著的抑制結(jié)腸癌細(xì)胞分裂、增殖能力的作用，對(duì)于腸炎相關(guān)結(jié)腸癌模型和皮下移植瘤模型有顯著的治療作用。

另外，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的式(II)化合物和AKBA均靶向作用于ACC1蛋白。通過(guò)使用生物素(biotin)標(biāo)記的AKBA和其修飾物，結(jié)合使用鏈霉親和素(streptavidin)瓊脂糖微球從結(jié)腸癌細(xì)胞株中“釣取”直接作用靶蛋白的方法，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)AKBA和其結(jié)構(gòu)修飾物主要通過(guò)直接作用于乙酰輔酶A羧化酶1(Acetyl CoA carboxylase 1，簡(jiǎn)稱ACACA或ACC1)基因發(fā)揮治療腫瘤作用。這是首次在腫瘤細(xì)胞中明確AKBA和其結(jié)構(gòu)修飾物的共同直接作用靶點(diǎn)。

乙酰輔酶A羧化酶(Acetyl CoA carboxylase)分為ACC1(ACC-α)和ACC2(ACC-β)兩亞型，分子量分別為265kD、280kD，廣泛存在于生物界。ACC1主要表達(dá)在產(chǎn)生脂肪的組織，如肝臟和脂肪細(xì)胞，而ACC2主要在耗氧組織或細(xì)胞中表達(dá)，如心臟和肌肉細(xì)胞。由于ACC1調(diào)控脂肪酸的代謝，所以被認(rèn)為是治療代謝綜合癥和多種腫瘤的靶點(diǎn)。研究表明：靶向ACC1，可以抑制多種腫瘤干細(xì)胞的生長(zhǎng)。

ACC1是長(zhǎng)鏈脂肪酸生物合成反應(yīng)中限速步驟催化酶，其缺失可以導(dǎo)致一些腫瘤細(xì)胞系的生長(zhǎng)受到抑制甚至凋亡，通過(guò)化學(xué)抑制劑的方法抑制ACC1的功能還可以抑制腫瘤干細(xì)胞的自我更新。因此，本發(fā)明的化合物通過(guò)靶向結(jié)合ACC1蛋白，調(diào)控ACC1蛋白功能，抑制腫瘤的生長(zhǎng)。

基于本發(fā)明人的上述新發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了式(I)所示的化合物或其異構(gòu)體、溶劑合物、前體，或它們的藥學(xué)上可接受的鹽的用途，用于制備治療 腫瘤的藥物。所述的腫瘤較佳地是ACC1過(guò)表達(dá)或過(guò)度活化的(或?qū)е碌?腫瘤，例如結(jié)腸癌，淋巴癌，胰腺癌，肝癌，卵巢癌等。

在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，通過(guò)體外試驗(yàn)，利用本發(fā)明所述的式(I)所示化合物對(duì)四種人結(jié)腸癌細(xì)胞系：HCT116、Lovo、HT29和SW480進(jìn)行了效果驗(yàn)證，結(jié)果本發(fā)明的化合物顯示出比AKBA更好的抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。

在本發(fā)明的另一具體實(shí)施例中，還利用所述的式(I)所示化合物進(jìn)行了體內(nèi)試驗(yàn)，驗(yàn)證其對(duì)腸炎相關(guān)腸癌模型中結(jié)腸腫瘤的生成的影響。結(jié)果，本發(fā)明所述的式(I)化合物顯示出與溶劑對(duì)照組相比更顯著的抑制作用。

在本發(fā)明的另一具體實(shí)施例中，還利用所述的式(I)所示化合物進(jìn)行了體內(nèi)試驗(yàn)，驗(yàn)證其對(duì)HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞皮下移植瘤的生長(zhǎng)。結(jié)果，本發(fā)明所述的式(I)化合物顯示出和溶劑對(duì)照組相比更顯著的抑制作用。

基于本發(fā)明人的上述新發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明還提供一種治療腫瘤(如結(jié)腸癌等ACC1過(guò)表達(dá)或過(guò)度活化相關(guān)的腫瘤)的方法，所述方法包括：給予需要治療的對(duì)象有效量的所述的式(I)所示化合物或其異構(gòu)體、溶劑合物或前體，或它們的藥學(xué)上可接受的鹽。

藥物組合物

本發(fā)明還提供了一種用于治療腫瘤的藥物組合物，含有：(a)有效量的式(I)所述的化合物、或其異構(gòu)體、溶劑合物、前體，或它們的藥學(xué)上可接受的鹽；和(b)藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。

在本發(fā)明中，所述的藥物組合物含有按照重量比例為0.01-5％的式(I)所示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。較佳的，所述的藥物組合物含有按照重量比例為0.03-3％的式(I)所示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽；更佳地，所述的藥物組合物含有按照重量比例為0.05-1％的式(I)所示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。

本發(fā)明所述的藥物組合物的劑型可以是多種多樣的，只要是能夠使活性成分有效地到達(dá)哺乳動(dòng)物機(jī)體的劑型都是可以的。比如可選自：溶液、懸浮液、片劑、膠囊、粉末、顆粒或糖漿。根據(jù)本發(fā)明的化合物所治療的疾病類型，本領(lǐng)域人員可以選擇方便應(yīng)用的劑型。

式(I)化合物作為活性成分的有效施用劑量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴(yán)重程度而變化。然而，通常當(dāng)本發(fā)明的化合物每天以約0.05-500mg/kg，較佳地0.1-300mg/kg，更佳地1-200mg/kg動(dòng)物體重的劑量給予時(shí)，能得到令人滿意的效果，較佳地每天以1-3次分開的劑量給予，或以緩釋形式給藥?？烧{(diào)節(jié)此劑量方案以提供最佳治療應(yīng)答。例如，由治療狀況的迫切要求，可每天給予若干次分開的劑量，或?qū)┝堪幢壤販p少。

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，科學(xué)出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實(shí)施例1：式(II)化合物(CKBA)的制備及鑒定

在100毫升雙口瓶中加入8克acetyl-11-keto-β-boswellic acid(簡(jiǎn)稱AKBA)和2.63克氫氧化鉀(KOH)，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入異丙醇50毫升作為溶劑。加熱回流反應(yīng)約6小時(shí)，待反應(yīng)體系冷卻到室溫，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干溶劑，得到白色固體，加入30毫升二氯甲烷后加入稀鹽酸調(diào)節(jié)混合體系pH值至酸性。用二氯甲烷萃取水相3次(3*15毫升)，收集二氯甲烷溶劑，用無(wú)水硫酸鎂干燥，旋干溶劑得到棕色油狀產(chǎn)物，使用石油醚：乙酸乙酯(90：10)作為洗脫劑用柱層析法提純，得到白色固體KBA 5.8g，產(chǎn)率約為78％。將1克KBA溶于10毫升二氯甲烷(含有2mol％4-二甲基吡啶)，加入1.5當(dāng)量的三乙胺和1.2當(dāng)量的環(huán)己甲酰氯，冰浴過(guò)夜。反應(yīng)完全后，用10％的碳酸氫鈉溶液處理，并用二氯甲烷萃取3次(3*10毫升)，收集二氯甲烷溶劑，用無(wú)水硫酸鎂干燥混合物，旋干溶劑得到白色固體。用石油醚：乙酸乙酯(90：10)作為洗脫劑，用柱層析法提純，得到?；a(chǎn)物3-o-α-cyclohexanoyl-11-keto-β-boswellic acid 4g，產(chǎn)率約為55％。

取一定量的式(II)的化合物進(jìn)行核磁、質(zhì)譜分析得其分子式為C₃₇H₅₆O₅，分子量為581，如圖1。

實(shí)施例2：式(II)的化合物的羧甲基纖維素鈉混懸液的制備

(1)混懸液1

取一定量羧甲基纖維素鈉(簡(jiǎn)稱CMC-Na)用雙蒸水溶解過(guò)夜制備成0.3％(g/ml)的CMC-Na溶液。將此溶液加入一定量的CKBA粉末制備成5mg/ml的混懸液，可以簡(jiǎn)單超聲輔助CKBA分散。

(2)空白混懸液

取一定量羧甲基纖維素鈉(簡(jiǎn)稱CMC-Na)用雙蒸水溶解過(guò)夜制備成0.3％(g/ml)的CMC-Na溶液作為空白混懸液。該空白混懸液作為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的對(duì)照。

實(shí)施例3：體外抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116、Lovo、HT29和SW480(購(gòu)自ATCC)種96孔板，每孔1.5×10⁴個(gè)細(xì)胞，分別加入呈梯度濃度(1，5，10，20，25，30，35，50，100μM)的CKBA和AKBA，總體積為100微升，對(duì)照組加入終濃度為0.5％的DMSO，空白對(duì)照孔僅加入100微升培養(yǎng)基，每組均設(shè)三個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)后，每孔加入CCK-8溶液10微升，將培養(yǎng)板放置于培養(yǎng)箱(37℃，5％CO₂條件下)避光孵育4小時(shí)后取出。酶標(biāo)儀測(cè)定450nm波長(zhǎng)處的O.D.值。計(jì)算抑制率：抑制率＝【1-(實(shí)驗(yàn)組O.D.值/對(duì)照組O.D.值)】×100％。

結(jié)果如圖2，式(II)化合物(CKBA)及AKBA均能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞分裂、增殖。兩者相比較，式(II)化合物(CKBA)比AKBA能更加有效地抑制結(jié)腸癌細(xì)胞。CKBA在較低濃度(20-25μM)下完全抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，而AKBA則需要在100μM濃度下才能達(dá)到相同效果，故CKBA體外抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的活性顯著地優(yōu)于AKBA。

實(shí)施例4：體內(nèi)抑制腸炎相關(guān)結(jié)腸癌腫瘤生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)

建立AOM/DSS結(jié)腸癌腫瘤動(dòng)物模型。取6-8周齡的C57BL/6小鼠10只，第1天每只小鼠腹腔注射AOM 1mg/ml 200μl，第6-10天連續(xù)喂含2.5％DSS的水5天，第11-26天換成普通水喂，第27-31天再次連續(xù)喂含2.5％DSS的水5天，第32-47天換成普通水喂，之后第48-49天第三次喂含2.5％DSS 的水2天，再換成普通水喂第50-56天。第50-56天給治療組5只小鼠每只每天腹腔注射5mg/ml CKBA的CMC-Na混懸液200μl，對(duì)照組5只小鼠每只每天腹腔注射空白混懸液200μl。第57天處死小鼠，取結(jié)腸拍照，記錄結(jié)腸部位腫瘤的數(shù)量和大小。

結(jié)果如圖3A-D。CKBA治療組小鼠結(jié)腸部位腫瘤的個(gè)數(shù)明顯少于對(duì)照組小鼠，并且腫瘤的大小也明顯小于對(duì)照組。

實(shí)施例5：體內(nèi)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞皮下移植瘤的實(shí)驗(yàn)

培養(yǎng)HCT116細(xì)胞，用0.5％胰酶消化后離心，重懸于無(wú)菌的PBS中，對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)，稀釋細(xì)胞至濃度為2.8×10⁸個(gè)/ml。對(duì)12只裸鼠每只裸鼠的腋下通過(guò)皮下注射細(xì)胞懸液100ul，記為實(shí)驗(yàn)開始第一天。第5-16天實(shí)驗(yàn)組6只裸鼠腹腔注射5mg/ml CKBA的CMC-Na混懸液200μl，對(duì)照組6只裸鼠每只每天腹腔注射空白混懸液200μl，兩組裸鼠均使用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤大小并記錄。第17天處死裸鼠，拍照，取腫瘤和脾臟拍照并稱重記錄。

結(jié)果如圖4。CKBA治療組裸鼠的皮下腫瘤大小明顯小于對(duì)照組裸鼠，表明CKBA對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞皮下移植瘤具有顯著治療作用。

實(shí)施例6：在細(xì)胞中釣取蛋白靶點(diǎn)的試驗(yàn)

人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116先和AKBA和CKBA孵育1小時(shí)，再加入biotin標(biāo)記的AKBA和CKBA(結(jié)構(gòu)如圖5)繼續(xù)孵育1.5小時(shí)。細(xì)胞用PBS洗兩遍，RIPA裂解細(xì)胞后離心得到蛋白上清。加入預(yù)先洗好的瓊脂糖微球，在搖床上孵育1小時(shí)。洗微球6遍后加入蛋白上樣緩沖液95℃煮10分鐘。樣品用SDS-PAGE分離，銀染顯色(如圖6A)后割取差異條帶，LC/MS/MS ESI-MicroTOF-QII質(zhì)譜分析(如圖6B)。

分析結(jié)果顯示，ACC1蛋白評(píng)分最高，為AKBA和CKBA在結(jié)腸癌細(xì)胞中潛在直接作用靶點(diǎn)。

實(shí)施例7：蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證AKBA和CKBA作用于ACC1

已變性的各組蛋白樣品在SDS-PAGE膠中加入相同體積，跑膠后通過(guò)濕轉(zhuǎn)將聚丙烯酰胺凝膠上的蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜，膜室溫封閉2小時(shí)后， 和ACC1的一抗4℃孵育過(guò)夜，TBST洗3遍后和對(duì)應(yīng)二抗室溫孵育2小時(shí)，TBST再洗3遍后加入ECL顯色液顯色拍照。

結(jié)果如圖7，biotin對(duì)照組中沒有ACC1蛋白條帶，biotin-AKBA和biotin-CKBA組中都顯示明顯的ACC1蛋白條帶，相應(yīng)的AKBA和CKBA競(jìng)爭(zhēng)組中ACC1條帶明顯變?nèi)酰f(shuō)明AKBA和CKBA對(duì)biotin標(biāo)記的化合物結(jié)合ACC1有競(jìng)爭(zhēng)作用。進(jìn)一步說(shuō)明AKBA和CKBA作用于ACC1。

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