本發(fā)明涉及一種植物化合物分離提純方法，具體涉及從龍脷葉中同時(shí)分離槲皮素-3-0-龍膽二糖苷和山柰酚-3-0-龍膽二糖苷的方法，屬于中藥技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

龍脷葉Sauropus rostratus系大戟科守宮木屬植物，又名龍舌葉、龍味葉、龍利葉、牛耳葉，主要分布在廣東、廣西、福建等地，原產(chǎn)于越南北部，馬來(lái)半島有栽培。具有清熱潤(rùn)肺、化痰止咳之功效，民間用于治療肺熱咳喘痰多、口干、便秘等疾病。目前對(duì)龍利葉的報(bào)道僅限于一些初步探討，對(duì)其化學(xué)成分及其藥理活性的研究較少。而龍脷葉中槲皮素-3-O-龍膽二糖苷與山柰酚-3-O-龍膽二糖苷在中藥技術(shù)領(lǐng)域中有至關(guān)重要作用。

槲皮素-3-O-龍膽二糖苷（Quercetin 3-O-gentiobioside），分子式為C₂₇H₃₀O₁₇，分子量為626.52，結(jié)構(gòu)式如下：

山柰酚-3-O-龍膽二糖苷（Kaempferol 3-O-diglucoside），分子式為C27H30O16，分子量為 610.52，結(jié)構(gòu)式如下：

目前主要采用硅膠柱層析和結(jié)晶相結(jié)合的方法進(jìn)行槲皮素-3-O-龍膽二糖苷、山柰酚-3-O-龍膽二糖苷單體的精制，生產(chǎn)周期長(zhǎng)，試劑浪費(fèi)嚴(yán)重，產(chǎn)品收率低。

國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局于2006年10月11日公開(kāi)了一種公開(kāi)號(hào)為CN1844116，專利名稱為“烏飯樹(shù)黑色素中黃酮類單體的提取、分離、純化及鑒定”的發(fā)明專利，該專利以烏飯樹(shù)樹(shù)葉為原料，經(jīng)乙醇提取得到烏飯樹(shù)樹(shù)葉黑色素溶液，再經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂對(duì)黑色素中的黃酮類化合物進(jìn)行粗分離，再通過(guò)聚酰胺柱和HW-40柱對(duì)黃酮類化合物單體進(jìn)行純化，再用高效液相色譜-質(zhì)譜、核磁共振技術(shù)對(duì)純化組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定；從中分離出7種黃酮類化合物單體，分別為A、B、C、D、E、F和G，并對(duì)B、C、D、E和F進(jìn)行了精確的結(jié)構(gòu)鑒定，確定分別為槲皮素、白楊黃素、芹黃素、山奈酚和木犀草素，其相對(duì)含量分別為：37.51%，2.26%，9.57%，1.72%和15.16%。

該專利以烏飯樹(shù)樹(shù)葉為原料，經(jīng)乙醇提取得到烏飯樹(shù)樹(shù)葉黑色素溶液，再經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂對(duì)黑色素中的黃酮類化合物進(jìn)行粗分離，再通過(guò)聚酰胺柱和HW-40柱對(duì)黃酮類化合物單體進(jìn)行純化。但該技術(shù)方案過(guò)程復(fù)雜，成本較高，所涉及溶劑種類過(guò)多，所提取到黃酮類化合物中槲皮素及山柰酚含量低，純度不高；且所涉及的槲皮素、白楊黃素、芹黃素、山奈酚和木犀草素為黃酮苷元，而沒(méi)有提及到黃酮苷類化合物，由于黃酮苷元與黃酮苷類化合物兩者極性相差極大，故該技術(shù)方案不適用于槲皮素-3-0-龍膽二糖苷和山柰酚-3-0-龍膽二糖苷的提取分離。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在解決現(xiàn)有技術(shù)問(wèn)題，而提出了從龍脷葉中同時(shí)分離槲皮素-3-0-龍膽二糖苷和山柰酚-3-0-龍膽二糖苷的方法。本發(fā)明通過(guò)成熟的工藝步驟及參數(shù)條件，使產(chǎn)品中槲皮素-3-0-龍膽二糖苷與山柰酚-3-0-龍膽二糖苷純度分別達(dá)到99%以上；該方法能快速、高純度、簡(jiǎn)便的分離、提純龍脷葉中槲皮素-3-0-龍膽二糖苷與山柰酚-3-0-龍膽二糖苷。

為了實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，提出如下技術(shù)方案：

從龍脷葉中同時(shí)分離槲皮素-3-0-龍膽二糖苷和山柰酚-3-0-龍膽二糖苷的方法，包括如下步驟：

（1）提取

以龍脷葉藥材為原料，粉碎成1～4mm的粗粉，然后按照每千克原料加入乙醇溶液6升，加入70％乙醇溶液，回流提取3-4次，每次2-3小時(shí)，提取液過(guò)濾，收集、合并，得提取液Ⅰ；

（2）濃縮

將步驟（1）所得的提取液Ⅰ回收乙醇后，濃縮至原提取液Ⅰ體積的15-25%，為提取液Ⅱ；

（3）大孔樹(shù)脂柱富集與洗脫

將步驟（2）所得的提取液Ⅱ過(guò)大孔吸附樹(shù)脂柱進(jìn)行吸附，用純化水清洗至無(wú)色后，再用60-70％乙醇溶液洗脫產(chǎn)品段，至流出液無(wú)色，收集、合并洗脫液，然后將洗脫液減壓濃縮，回收乙醇，得提取液Ⅲ；

（4）聚酰胺樹(shù)脂柱富集與洗脫

將步驟（3）所得的提取液Ⅲ過(guò)聚酰胺樹(shù)脂柱進(jìn)行吸附，先用10%乙醇溶液清洗聚酰胺樹(shù)脂柱至無(wú)色后，再用90％乙醇溶液洗脫產(chǎn)品段，至流出液無(wú)色，收集、合并洗脫液，然后將洗脫液減壓濃縮，回收乙醇后，得含有兩種目標(biāo)產(chǎn)物的濃縮液，為提取液Ⅳ；

（5）高效制備液相色譜儀分離

取步驟（4）所得的提取液Ⅳ用0.45μm有機(jī)膜過(guò)濾，收集濾液，然后濾液進(jìn)樣，進(jìn)行槲皮素-3-0-龍膽二糖苷單體與山柰酚-3-0-龍膽二糖苷單體的制備分離，并針對(duì)性收集槲皮素-3-0-龍膽二糖苷與山柰酚-3-0-龍膽二糖苷兩種單體的制備餾分溶液；在此過(guò)程中，紫外檢測(cè)器以波長(zhǎng)350nm，進(jìn)行在線檢測(cè)；

（6）產(chǎn)品回收

將步驟（5）中進(jìn)行高效制備液相色譜分離得到的槲皮素-3-0-龍膽二糖苷與山柰酚-3-0-龍膽二糖苷兩種單體的制備餾分溶液，加熱回收甲醇，槲皮素-3-0-龍膽二糖苷、山柰酚-3-0-龍膽二糖苷單體在水溶液中大量析出，放置室溫后，用漏斗過(guò)濾析出晶體，過(guò)濾固體于65℃條件下干燥12小時(shí)，即得到槲皮素-3-0-龍膽二糖苷單體及山柰酚-3-0-龍膽二糖苷單體目標(biāo)產(chǎn)物。

在步驟（5）中，色譜條件為：色譜柱填料為C18填料，柱溫為30℃，流速為1.0mL/min，流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸水溶液，且兩者的體積比為46比54。

在進(jìn)行高效制備液相色譜儀分離前，可通過(guò)液-質(zhì)聯(lián)用或其它本技術(shù)領(lǐng)域常用的方法確定高效液相色譜中槲皮素-3-0-龍膽二糖苷及山柰酚-3-0-龍膽二糖苷單體的峰形。以液-質(zhì)聯(lián)用方法為例，可與上述制備分離色譜條件相同，采用填料相同的色譜柱、組成相同的流動(dòng)相、相同的檢測(cè)波長(zhǎng)等，柱溫為室溫。取步驟（4）所得的提取液Ⅳ過(guò)濾，然后進(jìn)樣，進(jìn)行槲皮素-3-0-龍膽二糖苷、山柰酚-3-0-龍膽二糖苷單體的高效液相分離純化，根據(jù)質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果，可確定槲皮素-3-0-龍膽二糖苷、山柰酚-3-0-龍膽二糖苷單體在液相色譜中所對(duì)應(yīng)的峰形。

所述槲皮素-3-0-龍膽二糖苷、山柰酚-3-0-龍膽二糖苷單體產(chǎn)品的純度復(fù)檢采用反相分析型液相色譜，色譜條件為：以C18為填充劑；以甲醇－0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相，兩者體積比為46比54；流速1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為350nm。

槲皮素-3-0-龍膽二糖苷與山柰酚-3-0-龍膽二糖苷純度分別達(dá)到99%以上。

采用上述技術(shù)方案，帶來(lái)的有益技術(shù)效果為：

1.本發(fā)明通過(guò)成熟的工藝步驟及參數(shù)條件，使產(chǎn)品中槲皮素-3-0-龍膽二糖苷與山柰酚-3-0-龍膽二糖苷純度分別達(dá)到99%以上；同時(shí)，本方法操作簡(jiǎn)便、分離效率高，原料可回收，可大量、高純度且同時(shí)分離制備槲皮素-3-0-龍膽二糖苷與山柰酚-3-0-龍膽二糖苷單體；

2.在本發(fā)明中，針對(duì)龍脷葉藥材中存在的各種成分的理化性質(zhì)，本技術(shù)方案通過(guò)步驟的適當(dāng)順序搭配，以及適當(dāng)?shù)膮?shù)組合，有效提取出了槲皮素-3-O-龍膽二糖苷及山柰酚-3-O-龍膽二糖苷成分，并除去了大量雜質(zhì)，由此獲得可以進(jìn)入制備型高效液相色譜系統(tǒng)的樣品溶液，不至對(duì)高效液相色譜系統(tǒng)造成很大的影響，盡量延長(zhǎng)其使用周期，節(jié)約了生產(chǎn)成本；

3.在本發(fā)明（1）步驟中，每千克原料加入乙醇溶液6升，在該比例下，既能有效浸泡原料，又能減少乙醇使用量，從而降低溶劑的使用成本；而采用70%乙醇回流提取，既可將槲皮素-3-0-龍膽二糖苷和山柰酚-3-0-龍膽二糖苷這兩種黃酮類成分有效的提取出來(lái)，又使其他雜質(zhì)成分溶出率較低，確保制備時(shí)雜質(zhì)干擾少；

4.在本發(fā)明（2）步驟中，提取液Ⅰ回收乙醇，能減少濃縮液中的乙醇含量；通過(guò)濃縮，既可回收乙醇又減少了后續(xù)步驟中富集液的體積；

5.在本發(fā)明（3）步驟中，通過(guò)大孔吸附樹(shù)脂柱進(jìn)行吸附，用純化水清洗至無(wú)色，通過(guò)純化水確保除去大極性雜質(zhì)和一些糖類成分；而60-70%乙醇溶液在保證產(chǎn)品被洗脫出來(lái)的同時(shí)，極性較小的雜質(zhì)卻不會(huì)被洗脫下來(lái)；

6.在本發(fā)明（4）步驟中，洗脫液通過(guò)聚酰胺樹(shù)脂柱的吸附，能有效達(dá)到分離槲皮素-3-0-龍膽二糖苷和山柰酚-3-0-龍膽二糖苷，又能起到除去一部分雜質(zhì)的作用；而通過(guò)10%乙醇洗脫掉一些大極性的色素和雜質(zhì)，減少制備時(shí)的雜質(zhì)干擾；90%乙醇既能快速的洗脫產(chǎn)品，濃縮時(shí)又能把制備原料減少到最少體積；

7.在本發(fā)明（5）步驟中，采用制備型高效液相色譜系統(tǒng)對(duì)槲皮素-3-O-龍膽二糖苷、山柰酚-3-O-龍膽二糖苷單體進(jìn)行分離、純化，達(dá)到了很好的分離效果，高效制備液相色譜相對(duì)于其他的常規(guī)分離方法（比如硅膠柱洗脫分離）既能對(duì)產(chǎn)品快速分離，而且對(duì)產(chǎn)品的收率有很大的提高，成本大大降低。并且通過(guò)在線紫外檢測(cè)，針對(duì)性的收集槲皮素-3-O-龍膽二糖苷、山柰酚-3-O-龍膽二糖苷單體，目標(biāo)明確，避免了常規(guī)柱層析等造成的資源浪費(fèi)，而且便于控制產(chǎn)品質(zhì)量，產(chǎn)品純度可達(dá)99%以上；

8.在高效液相色譜分離過(guò)程中，各色譜條件的選擇及其組合極為重要，因?yàn)樗苯佑绊懳镔|(zhì)的出峰時(shí)間、峰形等；色譜條件主要包括色譜柱（包括填料、柱長(zhǎng)、柱溫等）、流動(dòng)相（包括成分、流速等）、檢測(cè)器及檢測(cè)波長(zhǎng)等。本發(fā)明通過(guò)大量的試驗(yàn)研究和對(duì)比分析，確定了以上所述的色譜條件，從而使物質(zhì)的出峰時(shí)間、峰形、分離效果等達(dá)到最佳化，實(shí)現(xiàn)了槲皮素-3-O-龍膽二糖苷、山柰酚-3-O-龍膽二糖苷單體的高效分離；

9.在本發(fā)明中，各工藝步驟中的有機(jī)試劑均可回收再利用，溶劑消耗量少，節(jié)約成本。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明中槲皮素-3-O-龍膽二糖苷單體產(chǎn)品的HPLC圖譜

圖2為本發(fā)明中山柰酚-3-O-龍膽二糖苷單體產(chǎn)品的HPLC圖譜。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅是本發(fā)明的一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其它實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

實(shí)施例1

如圖1、圖2所示：從龍脷葉中同時(shí)分離槲皮素-3-0-龍膽二糖苷和山柰酚-3-0-龍膽二糖苷的方法，包括如下工藝步驟：

（1）提取

將龍脷葉藥材稱取1Kg，粉碎成1～4mm的粗粉，然后加入70%乙醇溶液6L，回流提取3次，2小時(shí)/次，過(guò)濾，合并濾液，共30L，為提取液Ⅰ；

（2）濃縮

將步驟（1）所得的提取液Ⅰ回收乙醇后，濃縮至小體積，所得濃縮液為5L，為提取液Ⅱ；

（3）大孔樹(shù)脂柱富集與洗脫

將步驟（2）所得的提取液Ⅱ用大孔樹(shù)脂進(jìn)行吸附，用10L純化水清洗樹(shù)脂至無(wú)色后，再用15L的60%乙醇溶液洗脫產(chǎn)品段，至流出液無(wú)色，收集、合并洗脫液，將洗脫液減壓濃縮，回收乙醇，得5L提取液Ⅲ；

（4）聚酰胺樹(shù)脂柱富集與洗脫

將步驟（3）所得的提取液Ⅲ過(guò)聚酰胺樹(shù)脂柱進(jìn)行吸附，先用10L的10%乙醇溶液清洗樹(shù)脂至無(wú)色后，再用16L的90％乙醇溶液洗脫產(chǎn)品，至流出液無(wú)色，收集、合并洗脫液，將洗脫液減壓濃縮，回收乙醇后，得1L含產(chǎn)品的濃縮液，為提取液Ⅳ；

（5）高效制備液相色譜分離

色譜條件如下：填料為C18的色譜柱；

流動(dòng)相組成為：甲醇-0.1%磷酸水溶液（V/V），二者體積比為46比54；

檢測(cè)波長(zhǎng)為350nm；取步驟（4）所得的提取液Ⅳ用0.45μm有機(jī)膜過(guò)濾，收集濾液，然后濾液進(jìn)樣，進(jìn)行槲皮素-3-0-龍膽二糖苷單體與山柰酚-3-0-龍膽二糖苷單體的制備分離，并針對(duì)性收集槲皮素-3-0-龍膽二糖苷與山柰酚-3-0-龍膽二糖苷兩種單體的制備餾分溶液，分別得槲皮素-3-0-龍膽二糖苷制備溶液5L、山柰酚-3-0-龍膽二糖苷制備溶液6L；在此過(guò)程中，紫外檢測(cè)器在線檢測(cè)；

（6）產(chǎn)品回收

將步驟（5）中進(jìn)行高效制備液相色譜分離得到的槲皮素-3-0-龍膽二糖苷、山柰酚-3-0-龍膽二糖苷兩種單體的制備餾分溶液，加熱回收甲醇，槲皮素-3-0-龍膽二糖苷、山柰酚-3-0-龍膽二糖苷單體在水溶液中大量析出，放置室溫后用漏斗過(guò)濾析出晶體，過(guò)濾固體于65℃條件下干燥12小時(shí)，即得到槲皮素-3-0-龍膽二糖苷固體1.1g、山柰酚-3-0-龍膽二糖苷固體1.3g。

所述槲皮素-3-0-龍膽二糖苷、山柰酚-3-0-龍膽二糖苷單體產(chǎn)品的純度復(fù)檢采用反相分析型液相色譜（RP-HPLC）法，色譜條件如下：以C18為填充劑；以甲醇-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相，兩者體積比為46比54）；流速1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為350nm。

整個(gè)生產(chǎn)流程用時(shí)約4天。

計(jì)算得產(chǎn)品收率為：

槲皮素-3-O-龍膽二糖苷：（1.1/1000）×100%=0.11%；

山柰酚-3-O-龍膽二糖苷：（1.3/1000）×100%=0.13%。

通過(guò)更換流動(dòng)相組分，利用反相分析型液相色譜（RP-HPLC）復(fù)檢產(chǎn)品純度，測(cè)得結(jié)果為槲皮素-3-O-龍膽二糖苷99.15%，山柰酚-3-O-龍膽二糖苷99.35%。

實(shí)施例2

從龍脷葉中同時(shí)分離槲皮素-3-0-龍膽二糖苷和山柰酚-3-0-龍膽二糖苷的方法，包括如下工藝步驟：

（1）提取

將龍脷葉藥材稱取10Kg，粉碎成1～4mm的粗粉，加入60L體積濃度為70%乙醇溶液，提取3次，3小時(shí)/次，過(guò)濾，合并濾液，共90L，為提取液Ⅰ；

（2）濃縮

將步驟（1）所得的提取液Ⅰ回收乙醇后，濃縮至小體積，所得濃縮液為15L，為提取液Ⅱ；

（3）大孔樹(shù)脂富集與解析

將步驟（2）所得的提取液Ⅱ用大孔樹(shù)脂進(jìn)行吸附，用80L純化水清洗樹(shù)脂至無(wú)色后，再用120L的65％乙醇溶液洗脫產(chǎn)品段，至流出液無(wú)色，收集、合并洗脫液，將洗脫液減壓濃縮，回收乙醇，得18L提取液Ⅲ；

（4）聚酰胺樹(shù)脂柱富集與洗脫

將步驟（3）所得的提取液Ⅲ過(guò)聚酰胺樹(shù)脂柱進(jìn)行吸附，先用100L的10%乙醇溶液清洗樹(shù)脂至無(wú)色后，再用180L的90％乙醇溶液洗脫產(chǎn)品，至流出液無(wú)色，收集、合并洗脫液，將洗脫液減壓濃縮，回收乙醇后，得20L含產(chǎn)品的濃縮液，為提取液Ⅳ；

（5）高效制備液相色譜分離

色譜條件如下：填料為C18的色譜柱；

流動(dòng)相組成為：甲醇-0.1%磷酸水溶液（V/V），二者體積比為46比54；

檢測(cè)波長(zhǎng)為350nm；取步驟（4）所得的提取液Ⅳ用0.45μm有機(jī)膜過(guò)濾，收集濾液，然后濾液進(jìn)樣，進(jìn)行槲皮素-3-0-龍膽二糖苷單體與山柰酚-3-0-龍膽二糖苷單體的制備分離，并針對(duì)性收集槲皮素-3-0-龍膽二糖苷與山柰酚-3-0-龍膽二糖苷兩種單體的制備餾分溶液，分別得槲皮素-3-0-龍膽二糖苷制備溶液60L、山柰酚-3-0-龍膽二糖苷制備溶液75L；在此過(guò)程中，紫外檢測(cè)器在線檢測(cè)；

（6）產(chǎn)品回收

將步驟（5）中進(jìn)行高效制備液相色譜分離得到的槲皮素-3-0-龍膽二糖苷、山柰酚-3-0-龍膽二糖苷兩種單體的制備餾分溶液，加熱回收甲醇，槲皮素-3-0-龍膽二糖苷、山柰酚-3-0-龍膽二糖苷單體在水溶液中大量析出，放置室溫后用漏斗過(guò)濾析出晶體，過(guò)濾固體于65℃條件下干燥12小時(shí)，即得到槲皮素-3-0-龍膽二糖苷固體12、山柰酚-3-0-龍膽二糖苷固體14g。

所述槲皮素-3-0-龍膽二糖苷、山柰酚-3-0-龍膽二糖苷單體產(chǎn)品的純度復(fù)檢采用反相分析型液相色譜（RP-HPLC）法，色譜條件如下：以C18為填充劑；以甲醇-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相，兩者體積比為46比54；流速1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為350 nm。

整個(gè)生產(chǎn)流程用時(shí)約6天。

計(jì)算得產(chǎn)品收率為：

槲皮素-3-O-龍膽二糖苷：（12/1000）×100%=0.12%；

山柰酚-3-O-龍膽二糖苷：（14/1000）×100%=0.14%。

通過(guò)更換流動(dòng)相組分，利用反相分析型液相色譜（RP-HPLC）復(fù)檢產(chǎn)品純度，測(cè)得結(jié)果為槲皮素-3-O-龍膽二糖苷99.25%，山柰酚-3-O-龍膽二糖苷99.45%。

實(shí)施例3

從龍脷葉中同時(shí)分離槲皮素-3-0-龍膽二糖苷和山柰酚-3-0-龍膽二糖苷的方法，包括如下工藝步驟：

（1）提取

將龍脷葉藥材稱取20Kg，粉碎成1～4mm的粗粉，然后加入120L的70%乙醇溶液，提取4次，3小時(shí)/次，過(guò)濾，合并濾液，共185L，為提取液Ⅰ；

（2）濃縮

將步驟（1）所得的提取液Ⅰ回收乙醇后，濃縮至小體積，所得濃縮液為30L，為提取液Ⅱ；

（3）大孔樹(shù)脂富集與解析

將步驟（2）所得的提取液Ⅱ用大孔樹(shù)脂進(jìn)行吸附，用150L純化水清洗樹(shù)脂至無(wú)色后，再用200L的70％乙醇溶液洗脫產(chǎn)品段，至流出液無(wú)色，收集、合并洗脫液，將洗脫液減壓濃縮，回收乙醇，得25L提取液Ⅲ；

（4）聚酰胺樹(shù)脂柱富集與洗脫

將步驟（3）所得的提取液Ⅲ過(guò)聚酰胺樹(shù)脂柱進(jìn)行吸附，先用100L的10%乙醇溶液清洗樹(shù)脂至無(wú)色后，再用200L的90％乙醇溶液洗脫產(chǎn)品，至流出液無(wú)色，收集、合并洗脫液，將洗脫液減壓濃縮，回收乙醇后，得21L含產(chǎn)品的濃縮液，為提取液Ⅳ；

（5）高效制備液相色譜分離

色譜條件如下：填料為C18的色譜柱；

流動(dòng)相組成為：甲醇-0.1%磷酸水溶液（V/V），二者體積比為46比54；

檢測(cè)波長(zhǎng)為350nm；

取步驟（4）所得的提取液Ⅳ用0.45μm有機(jī)膜過(guò)濾，收集濾液，然后濾液進(jìn)樣，進(jìn)行槲皮素-3-0-龍膽二糖苷單體與山柰酚-3-0-龍膽二糖苷單體的制備分離，并針對(duì)性收集槲皮素-3-0-龍膽二糖苷與山柰酚-3-0-龍膽二糖苷兩種單體的制備餾分溶液，分別得槲皮素-3-0-龍膽二糖苷制備溶液80L、山柰酚-3-0-龍膽二糖苷制備溶液95L；在此過(guò)程中，紫外檢測(cè)器在線檢測(cè)；

（6）產(chǎn)品回收

將步驟（5）中進(jìn)行高效制備液相色譜分離得到的槲皮素-3-0-龍膽二糖苷、山柰酚-3-0-龍膽二糖苷兩種單體的制備餾分溶液，加熱回收甲醇，槲皮素-3-0-龍膽二糖苷、山柰酚-3-0-龍膽二糖苷單體在水溶液中大量析出，放置室溫后用漏斗過(guò)濾析出晶體，過(guò)濾固體于65℃條件下干燥12小時(shí)，即得到槲皮素-3-0-龍膽二糖苷固體25g、山柰酚-3-0-龍膽二糖苷固體27g。

所述槲皮素-3-0-龍膽二糖苷、山柰酚-3-0-龍膽二糖苷單體產(chǎn)品的純度復(fù)檢采用反相分析型液相色譜（RP-HPLC）法，色譜條件如下：以C18為填充劑；以甲醇-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相，兩者體積比為4比54；流速1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為350nm。

整個(gè)生產(chǎn)流程用時(shí)約7天。

計(jì)算得產(chǎn)品收率為：

槲皮素-3-O-龍膽二糖苷：（25/2000）×100%=0.125%；

山柰酚-3-O-龍膽二糖苷：（27/2000）×100%=0.135%。

通過(guò)更換流動(dòng)相組分，利用反相分析型液相色譜（RP-HPLC）復(fù)檢產(chǎn)品純度，測(cè)得結(jié)果為槲皮素-3-O-龍膽二糖苷99.45%，山柰酚-3-O-龍膽二糖苷99.35%。

實(shí)施例4

在實(shí)施例1-3基礎(chǔ)上，流動(dòng)相還可以為乙腈-0.1%磷酸水溶液，且兩者體積比為25比75；

在進(jìn)行高效液相色譜法分離前，通過(guò)液-質(zhì)聯(lián)用法確定高效液相色譜中槲皮素-3-0-龍膽二糖苷、山柰酚-3-0-龍膽二糖苷單體的峰形，即，取步驟（5）中所得混合液進(jìn)樣，進(jìn)行槲皮素-3-0-龍膽二糖苷、山柰酚-3-0-龍膽二糖苷單體的制備分離，根據(jù)質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果，確定槲皮素-3-0-龍膽二糖苷與山柰酚-3-0-龍膽二糖苷單體在液相色譜中對(duì)應(yīng)的峰形。