本發(fā)明屬于中藥活性物質(zhì)提取領(lǐng)域，具體涉及附子中反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷的提取工藝及耐寒作用。

背景技術(shù)：

附子為毛茛科植物烏頭(Aconitum carmichaelii Debx.)的子根。附子具有補(bǔ)火助陽、逐風(fēng)寒濕邪之功效。主治亡陽虛脫、肢冷脈微、陽痿、宮冷、心腹冷痛、虛寒吐瀉、陰寒水腫、寒濕痹痛等。2012年成都中醫(yī)藥大學(xué)耿昭在《附子的化學(xué)成分研究》的碩士論文中首次報(bào)道了從附子中分離出反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷，報(bào)道稱該物質(zhì)為白色膠狀物，易溶于水、甲醇，難溶于氯仿，分離工藝是在正丁醇部分中經(jīng)氯仿、甲醇混合溶劑洗脫得到，該文獻(xiàn)記載5.5kg附子分離得到8mg反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷，收率僅0.000145％，分離過程較難重現(xiàn)。2013年成都中醫(yī)藥大學(xué)李小紅、郭力等在《附子的化學(xué)成分研究》(中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013,19(19)86-89)報(bào)道了從附子中分離出反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷，稱該物質(zhì)為無色針狀結(jié)晶，分離工藝是95％乙醇回流提取，再經(jīng)硅膠柱層析分離精制得到，該文獻(xiàn)記載5kg附子分離得到100mg反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷，收率僅為0.002％。

反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷，CAS號：117405-51-3，分子式：C₁₆H₂₀O₉，分子量：356.3，結(jié)構(gòu)式如下：

耐寒性指耐受寒冷而能生存的特性。組織液和細(xì)胞液等處于冰點(diǎn)以下的溫度時(shí)，生物表現(xiàn)其耐寒性必須具有高的耐過冷的能力或具有高的耐凍性。目前，尚未見到反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷與動(dòng)物耐寒有直接關(guān)聯(lián)的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種促進(jìn)機(jī)體冷習(xí)服能力的單體藥物的提取方法及應(yīng)用。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：

將附子原料藥粉碎、過篩，得附子粉末，將附子粉末與95％乙醇混合后進(jìn)行回流提取，得浸提液；將浸提液減壓濃縮，得浸膏；將浸膏經(jīng)中等極性溶劑萃取得反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷粗品，將反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷粗品依次經(jīng)過硅膠柱層析、反相硅膠柱層析分離后進(jìn)行重結(jié)晶，得到反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷。

所述附子原料藥選自生附子。

所述附子粉末為30～40目。

所述95％乙醇的用量為每1kg附子原料藥使用12～16L。

所述回流提取進(jìn)行2～3次，每次1～2小時(shí)，回流溫度控制為75～79℃。

所述硅膠柱層析的條件包括：硅膠粒徑為300～400目，等度洗脫，流動(dòng)相為乙醇與水的混合溶劑(乙醇體積分?jǐn)?shù)85～95％)；所述反相硅膠柱層析的條件包括：硅膠柱為反相C18硅膠柱，等度洗脫，流動(dòng)相為乙腈與水的混合溶劑(乙腈體積分?jǐn)?shù)為5～15％)。

所述中等極性溶劑萃取具體包括以下步驟：將浸膏與水混合后用NaOH進(jìn)行堿化，然后用三氯甲烷或二氯甲烷萃取，上層水相冷凍干燥，得反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷粗品。

所述重結(jié)晶具體包括以下步驟：將反相硅膠柱層析的洗脫液冷凍干燥后用水溶解，然后用HCl調(diào)pH至5～6后靜置沉淀(4～10℃)，分離沉淀得到粗結(jié)晶，將粗結(jié)晶用水溶解后靜置沉淀(4～10℃)，將沉淀真空干燥，得到反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：

本發(fā)明提出的提取方法，通過優(yōu)化提取分離工藝，使得附子中反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷的提取效率從文獻(xiàn)的0.000145％、0.002％，提高到本發(fā)明的0.2827％。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)并揭示了反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷具有促進(jìn)機(jī)體冷習(xí)服的的作用，可在制備提高機(jī)體耐寒能力的藥物中應(yīng)用。

附圖說明

圖1是提取的反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷的質(zhì)譜圖譜；其中，(a)為鈉譜，(b)為氫譜。

圖2是提取的反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷的紅外圖譜。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。所述實(shí)施例是對本發(fā)明的解釋，而不是限定。

(一)附子中反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷的提取工藝

1、儀器、材料與試劑

附子藥材(生附子)于2016年5月購自安國藥材市場，產(chǎn)地四川江油(批號：20160508)，經(jīng)陜西中藥研究所鑒定為毛茛科植物烏頭(Aconitum carmichaelii Debx.)的子根。

反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷對照品(山東博洛德生物科技公司，批號：AWSTG20160612，純度99.5％)。

硅膠(300～400目，青島海洋化工公司)。

反相C18硅膠柱(75m，日本Cosmosil公司)。

乙腈、甲醇(色譜純，上?；瘜W(xué)試劑有限公司)；其他試劑均為分析純。

高效液相色譜儀系統(tǒng)：LC-20AD輸液泵、SPD-M20A紫外檢測器、CTO-20A柱溫箱、LC-Solution色譜工作站(日本島津公司)；ODS色譜柱(C18-AR-Ⅱ，4.6mm×250mm，日本Cosmosil公司)。

ME215S型電子天平(德國Starorious公司)；UV-2600紫外可見分光光度計(jì)(日本Shimadzu公司)；BP-Purifier-100制備中壓液相系統(tǒng)(蘇州利穗有限公司)；C18填料(75m，日本Cosmosil公司)；400MHz核磁共振儀(美國Bruker公司)。

2、方法

2.1 反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷液相分析(HPLC)條件

流動(dòng)相：水:甲醇:0.05％磷酸(體積比66:24:10)

流速：1.0mL/min

柱溫：30℃

檢測波長：290nm

進(jìn)樣量：10μL

2.2 提取與分離

2.2.1 反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷的提取

稱取附子藥材(生附子)，粉碎，過40目篩，將40目粗粉3980g用95％乙醇(即體積分?jǐn)?shù)95％的乙醇水溶液)回流提取2次(每次2h，放冷，濾過)，95％乙醇用量按照1kg附子藥材計(jì)為12L，回流溫度控制在75～79℃，合并2次濾液，在65℃下減壓濃縮回收乙醇，得到反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷醇浸膏，浸膏收率10.04％。

HPLC檢測其中反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷的含量，醇浸膏中反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷含量為2.819％。

2.2.2 反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷的硅膠柱精制

2.2.2.1 醇浸膏精制

將醇浸膏用水溶解(例如膏:水質(zhì)量比＝0.8:1)，用NaOH調(diào)至呈堿性(例如pH＝10)，中等極性溶劑(例如三氯甲烷)萃取3次，下層濃縮得總生物堿，上層水相冷凍干燥，得反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷粗品。

2.2.2.2 硅膠分離

取300～400目硅膠100g，裝入中壓柱(15cm×2.5cm)，柱體積70mL，將反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷粗品1.0g硅膠拌樣，上樣后以95％乙醇等度洗脫，流速為50mL/min，檢測波長為290nm，每50mL接收一瓶，收集第30分鐘到第60分鐘的洗脫液，低溫(40～60℃)濃縮得膏狀物。

2.2.2.3 反相硅膠分離

取反相C18硅膠柱(15cm×2.5cm)，將2.2.2.2制備的膏狀物上柱，體積分?jǐn)?shù)11％乙腈水溶液等度洗脫，流速為50mL/min，檢測波長為290nm。每50mL收集一瓶，收集第15分鐘到第30分鐘的洗脫液，HPLC檢測其反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷的含量，得率為0.2827％。收集目標(biāo)物即洗脫液，低溫(40～60℃)濃縮盡量除去溶劑后冷凍干燥，室溫下，加3～5倍質(zhì)量蒸餾水溶解，用HCl調(diào)pH至5～6(此處對于pH有嚴(yán)格要求，否則無法形成結(jié)晶析出)，重結(jié)晶(4℃冰箱內(nèi)靜置)，濾過，室溫下，粗結(jié)晶再用5倍質(zhì)量蒸餾水溶解，重結(jié)晶(4℃冰箱內(nèi)靜置)，濾過，真空干燥(40～60℃)，最終樣品經(jīng)過鑒定為反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷(參見圖1以及圖2)，純度為99.8％。

(二)反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷的耐寒作用研究

1、材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明系雄性健康小鼠18g～22g，由中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育場提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)樣品資料

1^#樣品：附子藥材(生附子)40目粗粉(去離子水配成溶液)；

2^#樣品：附子藥材(生附子)95％乙醇提取物(干燥成粉，用去離子水配成溶液)；

3^#樣品：附子藥材(生附子)水煎煮提取物(干燥成粉，用去離子水配成溶液)；

4^#樣品：附子藥材(生附子)醇浸膏硅膠柱層析洗脫物(干燥成粉，用去離子水配成溶液)；

5^#樣品：反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷對照品(去離子水配成溶液)；

6^#樣品：空白對照(去離子水)。

1.3 小鼠耐寒實(shí)驗(yàn)

昆明系雄性健康小鼠18g～22g，隨機(jī)分組，每組12只，連續(xù)灌胃給藥，以生附子原粉當(dāng)量折算，劑量為0.003g/kg/d，1～5組小鼠分別給予上述1^#～5^#號樣品，空白對照組小鼠給予等體積去離子水。動(dòng)物4℃環(huán)境暴露，同時(shí)給藥期間正常飲水飲食，連續(xù)給藥5天后，在-10℃觀察小鼠凍亡時(shí)間(禁水禁食)，結(jié)果見表1。

2、結(jié)果與分析

表1.小鼠耐寒實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果

參見表1，2、4、5組小鼠在-10℃條件存活時(shí)間分別是54.5±6.3、63.7±4.9、74.6±5.7，與空白對照組(或第1組)相比均有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，分別是P<0.01，即2、4、5組小鼠較空白對照組(或第1組)小鼠存活時(shí)間極顯著的延長。第5組與第2、4組相比，小鼠存活時(shí)間明顯延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。

3、結(jié)論

附子中分離得到的反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷具有促進(jìn)動(dòng)物(特別是哺乳動(dòng)物)冷習(xí)服，增加機(jī)體耐寒能力的作用。