本發(fā)明屬于中藥提取技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種高純度單體獐牙菜苷系列成分的分離純化方法。

背景技術(shù)：

藏醫(yī)藥有著幾千年的歷史，是我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥學(xué)寶庫(kù)中的一顆璀璨明珠，為西部藏區(qū)名族的繁衍、生存、發(fā)展起著重要的作用。

藏茵陳系龍膽科植物印度獐牙菜全草。藏醫(yī)古典醫(yī)著《晶珠本草》以及現(xiàn)代藏藥學(xué)著作《藏藥晶鏡本草》將藏茵陳分為印度獐牙菜、藏獐牙菜、普蘭獐牙菜三種。

藏茵陳主要功能為清熱消炎、利膽退黃，是治療肝膽疾病的首選藥物，特別對(duì)肝膽實(shí)熱性疾病有較好療效?！栋倏迫珪蒯t(yī)分卷》匯集歷代經(jīng)典著作中以藏茵陳為主藥命名的著名方劑共十余方，例如三味藏茵陳湯、四味藏茵陳湯、六味藏茵陳膏、八味藏茵陳散、十五味藏茵陳酥油丸等。這些方劑治療肝膽疾病各有所長(zhǎng)。

獐牙菜苦苷與獐牙菜苷是存在于獐牙菜植物中的主要活性成分，且在植物體內(nèi)二者可以相互轉(zhuǎn)換，但目前關(guān)于其提取的研究并不多，且其提取效率也有待提高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種產(chǎn)率較高的高純度單體獐牙菜苷系列成分的分離純化方法。

本發(fā)明提供了一種高純度單體獐牙菜苷系列成分的分離純化方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1)將原料用醇提取，得到提取液；所述原料為獐牙菜屬植物或藥材；

S2)將所述提取液經(jīng)反相聚合物色譜填料吸附后，洗脫，得到洗脫液；

S3)將所述洗脫液經(jīng)硅膠柱層析色譜純化后，得到純化洗脫液；

S4)將所述純化洗脫液通過(guò)制備型高效液相色譜分離，得到高純度單體獐牙菜苷系列成分。

優(yōu)選的，所述提取的溫度為50℃～60℃；所述提取的時(shí)間為0.5～2h；所述提取的次數(shù)為2～6次。

優(yōu)選的，所述反相聚合物色譜填料為大孔樹脂填料或NM系列色譜填料。

優(yōu)選的，所述步驟S2)具體為：

將所述提取液經(jīng)反相聚合物色譜填料吸附后，先用水洗滌，然后用30％～50％的醇溶液洗脫，得到洗脫液。

優(yōu)選的，所述步驟S2)還包括：

洗脫后，減壓濃縮，再經(jīng)反相聚合物色譜填料吸附，洗脫，得到洗脫液。

優(yōu)選的，所述步驟S3)具體為：

將洗脫液減壓濃縮后，用硅膠拌樣，得到過(guò)柱原料；

用有機(jī)溶劑與醇溶劑對(duì)過(guò)柱原料進(jìn)行梯度洗脫，得到純化洗脫液；所述有機(jī)溶劑為二氯甲烷或乙酸乙酯。

優(yōu)選的，所述硅膠的目數(shù)為60～80目。

優(yōu)選的，所述梯度洗脫具體為：有機(jī)溶劑與醇溶劑的體積比為20:1；待小極性雜質(zhì)基本除凈后，有機(jī)溶劑與醇溶劑的體積比為5：1；收集有機(jī)溶劑與醇溶劑的體積比為5：1的洗脫液，得到純化洗脫液。

優(yōu)選的，所述步驟S4)具體為：

將所述純化洗脫液減壓濃縮后，通過(guò)制備型高效液相色譜分離，得到高純度單體獐牙菜苷系列成分；所述制備型高效液相色譜的色譜柱為C18色譜柱；所述制備型高效液相色譜的流動(dòng)相為甲醇水溶液；所述甲醇水溶液中甲醇的體積百分?jǐn)?shù)為20％～40％。

優(yōu)選的，所述步驟S4)中通過(guò)制備型高效液相色譜分離后，經(jīng)反相聚合物色譜填料吸附，洗脫后，減壓濃縮，干燥，得到高純度單體獐牙菜苷系列成分。

本發(fā)明提供了一種高純度單體獐牙菜苷系列成分的分離純化方法，包括以下步驟：S1)將原料用醇提取，得到提取液；所述原料為獐牙菜屬植物或藥材；S2)將所述提取液經(jīng)反相聚合物色譜填料吸附后，洗脫，得到洗脫液；S3)將所述洗脫液經(jīng)硅膠柱層析色譜純化后，得到純化洗脫液；S4)將所述純化洗脫液通過(guò)制備型高效液相色譜分離，得到高純度單體獐牙菜苷系列成分。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單，成本低，且可同時(shí)得到多種不同的獐牙菜苷系列成分，產(chǎn)品收率與純度均較高。

附圖說(shuō)明

圖1為原料藏茵陳藥材的HPLC譜圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中得到的獐牙菜苷的HPLC譜圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例1中得到的龍膽苦苷的HPLC譜圖；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例1中得到的獐牙菜苦苷的HPLC譜圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

本發(fā)明提供了一種高純度單體獐牙菜苷系列成分的分離純化方法，包括以下步驟：

S1)將原料用醇提取，得到提取液；所述原料為獐牙菜屬植物或藥材；

S2)將所述提取液經(jīng)反相聚合物色譜填料吸附后，洗脫，得到洗脫液；

S3)將所述洗脫液經(jīng)硅膠柱層析色譜純化后，得到純化洗脫液；

S4)將所述純化洗脫液通過(guò)制備型高效液相色譜分離，得到高純度單體獐牙菜苷系列成分。

按照本發(fā)明，所述原料為獐牙菜屬植物或藥材，優(yōu)選為獐牙菜或藏茵陳藥材，更優(yōu)選藏茵陳；本發(fā)明中優(yōu)選先將原料粉碎，然后再用醇提取，得到提取液；所述粉碎的程度優(yōu)選為3～10mm段，更優(yōu)選為3～8mm的段，再優(yōu)選為5mm的段；所述醇為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的醇即可，并無(wú)特殊的限制，本發(fā)明中優(yōu)選為乙醇和/或甲醇，更優(yōu)選為體積分?jǐn)?shù)為70％～80％的乙醇和/或甲醇；所述原料與醇的質(zhì)量體積比優(yōu)選為1g：(3～5)ml；所述提取的溫度優(yōu)選為50℃～60℃；所述提取的時(shí)間優(yōu)選為0.5～2h，更優(yōu)選為0.5～1.5h，再優(yōu)選為1h；為提高提取產(chǎn)率，優(yōu)選提取2～6次，更優(yōu)選提取3～5次，最優(yōu)選提取4次，將各次的提取液合并。

在本發(fā)明中，優(yōu)選先將提取液濃縮；所述濃縮的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法即可，并無(wú)特殊的限制，本發(fā)明優(yōu)選采用減壓濃縮；所述濃縮的溫度優(yōu)選為50℃～60℃；所述濃縮優(yōu)選至無(wú)醇溶劑為止。

濃縮后，用反向聚合物色譜填料吸附；所述反向聚合物色譜填料為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的反向聚合物色譜填料即可，并無(wú)特殊的限制，本發(fā)明中優(yōu)選為大孔樹脂填料或NM系列色譜填料；所述大孔樹脂為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的大孔樹脂即可，并無(wú)特殊的限制，本發(fā)明中優(yōu)選為AB-8大孔樹脂或D-101大孔樹脂；所述NM系列色譜填料為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的NM系列色譜填料即可，并無(wú)特殊的限制，本發(fā)明中優(yōu)選為NM100-反相聚合物色譜填料。

吸附后，優(yōu)選先用水洗滌，然后用30％～50％的醇溶液洗脫，得到洗脫液；所述醇溶液為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的醇溶液即可，并無(wú)特殊的限制，本發(fā)明中優(yōu)選為甲醇溶液和/或乙醇溶液。其中，在本發(fā)明中如無(wú)特殊說(shuō)明百分?jǐn)?shù)均為體積百分?jǐn)?shù)，如30％～50％的醇溶液為醇體積分?jǐn)?shù)為30％～50％的醇溶液。得到的洗脫液為獐牙菜苷、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷等產(chǎn)品段；洗脫的過(guò)程中優(yōu)選通過(guò)高效液相色譜進(jìn)行在線監(jiān)控，洗脫至無(wú)目標(biāo)產(chǎn)物；洗脫完之后優(yōu)選用70％～90％的醇溶液洗脫，收集待回收再利用。所述醇溶液為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的醇溶液即可，并無(wú)特殊的限制，本發(fā)明中優(yōu)選為甲醇溶液和/或乙醇溶液。

在本發(fā)明中，優(yōu)選進(jìn)行二次富集，以收集目標(biāo)產(chǎn)品的高醇溶液；所述二次富集的方法優(yōu)選為：將用30％～50％的醇溶液洗脫得到的洗脫液減壓濃縮，再經(jīng)反相聚合物色譜填料吸附，洗脫，得到洗脫液；所述減壓濃縮的溫度優(yōu)選為50℃～60℃；減壓濃縮優(yōu)選至無(wú)醇為止；所述反相聚合物色譜填料同上所述，在此不再贅述；經(jīng)反相聚合物色譜填料吸附后，優(yōu)選用80％～90％的醇溶液洗脫，更優(yōu)選用90％的醇溶液洗脫，得到洗脫液；所述醇溶液為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的醇溶液即可，并無(wú)特殊的限制，本發(fā)明中優(yōu)選為甲醇溶液和/或乙醇溶液。

將所述洗脫液用硅膠柱層析色譜純化，具體優(yōu)選按照以下步驟進(jìn)行：將洗脫液減壓濃縮后，用硅膠拌樣，得到過(guò)柱原料；用有機(jī)溶劑與醇溶劑對(duì)過(guò)柱原料進(jìn)行梯度洗脫，得到純化洗脫液；所述有機(jī)溶劑為二氯甲烷或乙酸乙酯；所述醇溶劑為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的醇溶劑即可，并無(wú)特殊的限制，本發(fā)明中優(yōu)選為甲醇或乙醇。通過(guò)硅膠柱層析色譜純化，可除去小極性雜質(zhì)，得到目標(biāo)成分的半成品段，純度達(dá)到80％左右。

在本發(fā)明中，優(yōu)選將洗脫液減壓濃縮至浸膏，然后再用硅膠拌樣，得到過(guò)柱原料；所述減壓濃縮的溫度優(yōu)選為50℃～60℃；所述硅膠的目數(shù)優(yōu)選為60～80目；所述浸膏與硅膠的的質(zhì)量比優(yōu)選為1：(2～4)。

用有機(jī)溶劑與醇溶劑對(duì)過(guò)柱原料進(jìn)行梯度洗脫；所述梯度洗脫的程序優(yōu)選具體為：有機(jī)溶劑與醇溶劑的體積比為(30～15):1，優(yōu)選為(25～15)：1，更優(yōu)選為20:1；待小極性雜質(zhì)基本除凈后，有機(jī)溶劑與醇溶劑的體積比為(10～3)：1，優(yōu)選為(8～3)：1，更優(yōu)選為5：1；收集有機(jī)溶劑與醇溶劑的體積比為(10～3)：1的洗脫液，得到純化洗脫液。有機(jī)溶劑與醇溶劑體積比為20:1時(shí)洗脫可除去小極性雜質(zhì)；在本發(fā)明中，得到純化洗脫液后，即獐牙菜苷系列成品色帶洗脫完全后，優(yōu)選換為有機(jī)溶劑與醇溶劑體積為3:1時(shí)洗脫，該段含少量產(chǎn)品后段，最后壓干硅膠柱試劑，洗脫完成。乙酸乙酯與甲醇體積為3:1時(shí)洗脫硅膠柱目的是收集產(chǎn)品后段的殘留產(chǎn)品。

將所述純化洗脫液通過(guò)制備型高效液相色譜分離；在本發(fā)明中優(yōu)選先將純化洗脫液濃縮至浸膏；所述濃縮的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法即可，并無(wú)特殊的限制，優(yōu)選為減壓濃縮；所述濃縮的溫度優(yōu)選為50℃～60℃。

然后將浸膏用有機(jī)溶劑溶解，作為制備型高效液相色譜的原料；所述有機(jī)溶劑為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的有機(jī)溶劑即可，并無(wú)特殊的限制，本發(fā)明中優(yōu)選為甲醇水溶液；所述甲醇水溶液中甲醇的體積百分?jǐn)?shù)優(yōu)選為10％～40％，更優(yōu)選為20％～30％；所述制備型高效液相色譜的色譜柱優(yōu)選為C18色譜柱；所述制備型高效液相色譜的流動(dòng)相優(yōu)選為甲醇水溶液；所述甲醇水溶液中甲醇的體積百分?jǐn)?shù)為20％～40％；流動(dòng)相的流速優(yōu)選為100～400ml/min，更優(yōu)選為200～300ml/min，再優(yōu)選為200ml/min。

通過(guò)制備型高效液相色譜，可以將獐牙菜苷及同類物質(zhì)的幾個(gè)成分分離開，收集到獐牙菜苷、獐牙菜苦苷與龍膽苦苷三個(gè)純品，產(chǎn)品純度達(dá)到99％。

通過(guò)制備型高效液相色譜分離后，優(yōu)選利用反相聚合物色譜填料富集，具體為：經(jīng)反相聚合物色譜填料吸附，洗脫后，減壓濃縮，干燥，得到高純度單體獐牙菜苷系列成分；所述反相聚合物色譜填料同上所述，在此不再贅述；所述洗脫優(yōu)選采用高濃度的醇溶液進(jìn)行，更優(yōu)選為80％～95％的醇溶液，再優(yōu)選為90％～95％的醇溶液，最優(yōu)選為95％的醇溶液；所述醇溶液為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的醇溶液即可，并無(wú)特殊的限制，本發(fā)明中優(yōu)選為甲醇溶液和/或乙醇溶液；所述減壓濃縮的溫度優(yōu)選為50℃～60℃；減壓濃縮優(yōu)選至無(wú)溶劑；所述干燥優(yōu)選為真空干燥；所述干燥的溫度優(yōu)選為40℃～60℃，更優(yōu)選為40℃～50℃，再優(yōu)選為45℃。

在本發(fā)明中，得到的高純度單體獐牙菜苷系列成分為獐牙菜苷、獐牙菜苦苷與龍膽苦苷三種，純度均達(dá)到99％以上。

按照本發(fā)明，優(yōu)選采用高效液相色譜(HPLC)對(duì)得到的高純度單體獐牙菜苷系列成分進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)；所述高效液相色譜的色譜柱優(yōu)選為C18色譜柱；所述高效液相色譜的流動(dòng)相優(yōu)選為乙腈與磷酸水溶液；所述乙腈與磷酸水溶液的體積比優(yōu)選為13：87；所述磷酸水溶液中磷酸的質(zhì)量體積比分?jǐn)?shù)優(yōu)選為0.2％；所述高效液相色譜的檢測(cè)波長(zhǎng)優(yōu)選為238nm。

本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單，成本低，且可同時(shí)得到多種不同的高純度單體獐牙菜苷系列成分，產(chǎn)品收率與純度均較高。

為了進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的一種高純度單體獐牙菜苷系列成分的分離純化方法進(jìn)行詳細(xì)描述。

以下實(shí)施例中所用的試劑均為市售。

實(shí)施例1

1.1提取:

藏茵陳藥材粉碎成5mm的段，用80％乙醇溶液回流提取，提取溫度60℃，提取4次，合并提取液，每次提取1h。

提取液濃縮：把提取液于60℃，減壓濃縮，濃縮至無(wú)醇，收集濃縮液，備用。

1.2富集：

采用反相聚合填料AB-8大孔樹脂。

過(guò)程：

處理好的濃縮液，上反相聚合填料進(jìn)行吸附，吸附完成后，先用水洗，水洗液棄去，然后用30％濃度的乙醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液；通過(guò)高效液相色譜進(jìn)行在線監(jiān)控，洗脫至基本無(wú)目標(biāo)產(chǎn)品后，用70％乙醇洗脫，收集洗脫液待回收利用；

二次富集：將中濃度醇洗脫得到的洗脫液減壓濃縮至無(wú)醇，上反相聚合物填料進(jìn)行吸附，吸附完成后用90％乙醇溶液洗脫，得到洗脫液。

1.3純化：

純化方法：硅膠柱層析色譜

純化原料：洗脫液60℃減壓濃縮至浸膏，用硅膠(60～80目)拌樣(浸膏與硅膠的質(zhì)量比為1:2)，成棕色分散的顆粒，作為過(guò)柱原料。

過(guò)柱體系：乙酸乙酯與甲醇的體積比為20:1，除去原料中小極性雜質(zhì)，TLC跟蹤在線檢測(cè)，雜質(zhì)色帶洗脫完成后，換為乙酸乙酯與甲醇的體積比為5：1洗脫，收集該色帶段洗脫液，得到純化洗脫液，該段主要為獐牙菜苷系列成分半成品段；產(chǎn)品色帶洗脫完全后換乙酸乙酯與甲醇的體積比為3：1洗脫，收集洗脫液，該段含少量產(chǎn)品后段，最后壓干硅膠柱試劑，洗脫完成。

收集乙酸乙酯與甲醇的體積比為5：1的洗脫液，得到純化洗脫液。

1.4分離

將純化洗脫液50℃減壓濃縮至浸膏，然后用20％甲醇水溶液溶解，得到制備原料。

將所述制備原料通過(guò)制備型高效液相色譜分離；所述制備型高效液相色譜的色譜柱為C18色譜柱；流動(dòng)相為甲醇水溶液其中甲醇的濃度為20％；流動(dòng)相的流速為200ml/min；根據(jù)產(chǎn)品的特征性質(zhì)，收集不同的信號(hào)峰的洗脫液，然后進(jìn)行分析高效液相在線檢測(cè)，可收集到獐牙菜苷、龍膽苦苷與獐牙菜苦苷的純品，純度一次可達(dá)到99％。

1.5純品富集干燥

將得到的獐牙菜苷、龍膽苦苷與獐牙菜苦苷三種單體的產(chǎn)品濃縮液分別上反相聚合物色譜填料AB-8大孔樹脂吸附，吸附完成后用高濃度95％乙醇洗脫，得到的洗脫液50℃減壓濃縮至干，45℃真空干燥，得到獐牙菜苷、獐牙菜苦苷及龍膽苦苷。

質(zhì)控檢測(cè)方法：

HPLC條件：C18柱；流動(dòng)相條件：乙腈-0.2％磷酸水(13:87)；檢測(cè)波長(zhǎng)：238nm。

圖1為原料藏茵陳藥材的HPLC色譜圖，其結(jié)果見表1。圖1中8.631min的峰是獐牙菜苦苷，12.390min的峰是龍膽苦苷，13.316min的峰是獐牙菜苷。

圖2為實(shí)施例1中得到的獐牙菜苷的HPLC色譜圖，結(jié)果見表2。收率為86％。

圖3為實(shí)施例1中得到的龍膽苦苷的HPLC色譜圖，結(jié)果見表3。收率為85％。

圖4為實(shí)施例1中得到的獐牙菜苦苷的HPLC色譜圖，結(jié)果見表4。收率為80.5％。

表1獐牙菜苷的HPLC檢測(cè)結(jié)果

表2龍膽苦苷的HPLC檢測(cè)結(jié)果

表3獐牙菜苦苷的HPLC檢測(cè)結(jié)果

實(shí)施例2

2.1提取:

藏茵陳藥材粉碎成5mm的段，用70％乙醇溶液回流提取，提取溫度60℃，提取4次，合并提取液，每次提取1h。

提取液濃縮：把提取液于60℃，減壓濃縮，濃縮至無(wú)醇，收集濃縮液，備用。

2.2富集：

采用反相聚合填料D-101大孔樹脂。

過(guò)程：

處理好的濃縮液，上反相聚合填料進(jìn)行吸附，吸附完成后，先用水洗，水洗液棄去，然后用40％濃度的乙醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液；通過(guò)高效液相色譜進(jìn)行在線監(jiān)控，洗脫至基本無(wú)目標(biāo)產(chǎn)品后，用80％乙醇洗脫，收集洗脫液待回收利用；

二次富集：將中濃度醇洗脫得到的洗脫液減壓濃縮至無(wú)醇，上反相聚合物填料進(jìn)行吸附，吸附完成后用90％乙醇溶液洗脫，得到洗脫液。

2.3純化：

純化方法：硅膠柱層析色譜

純化原料：洗脫液60℃減壓濃縮至浸膏，用硅膠(60～80目)拌樣(浸膏與硅膠的質(zhì)量比為1:3)，成棕色分散的顆粒，作為過(guò)柱原料。

過(guò)柱體系：乙酸乙酯與甲醇的體積比為20:1，除去原料中小極性雜質(zhì)，TLC跟蹤在線檢測(cè)，雜質(zhì)色帶洗脫完成后，換為乙酸乙酯與甲醇的體積比為5：1洗脫，收集該色帶段洗脫液，得到純化洗脫液，該段主要為獐牙菜苷系列成分半成品段；產(chǎn)品色帶洗脫完全后換乙酸乙酯與甲醇的體積比為3：1洗脫，收集洗脫液，該段含少量產(chǎn)品后段，最后壓干硅膠柱試劑，洗脫完成。

收集乙酸乙酯與甲醇的體積比為5：1的洗脫液，得到純化洗脫液。

2.4分離

將純化洗脫液50℃減壓濃縮至浸膏，然后用30％甲醇水溶液溶解，得到制備原料。

將所述制備原料通過(guò)制備型高效液相色譜分離；所述制備型高效液相色譜的色譜柱為C18色譜柱；流動(dòng)相為甲醇水溶液其中甲醇的濃度為30％；流動(dòng)相的流速為200ml/min；根據(jù)產(chǎn)品的特征性質(zhì)，收集不同的信號(hào)峰的洗脫液，然后進(jìn)行分析高效液相在線檢測(cè)，可收集到獐牙菜苷、龍膽苦苷與獐牙菜苦苷的純品，純度一次可達(dá)到99％。

2.5純品富集干燥

將得到的獐牙菜苷、龍膽苦苷與獐牙菜苦苷三種單體的產(chǎn)品濃縮液分別上反相聚合物色譜填料D-101大孔樹脂吸附，吸附完成后用高濃度95％乙醇洗脫，得到的洗脫液50℃減壓濃縮至干，45℃真空干燥，得到獐牙菜苷、獐牙菜苦苷及龍膽苦苷。

質(zhì)控檢測(cè)方法：

HPLC條件：C18柱；流動(dòng)相條件：乙腈-0.2％磷酸水(13:87)；檢測(cè)波長(zhǎng)：238nm。

獐牙菜苷的純度為99.56％；收率為81％。

龍膽苦苷的純度為99.4％；收率為84.5％。

獐牙菜苦苷的純度為99.8％；收率為80％。

實(shí)施例3

3.1提取:

藏茵陳藥材粉碎成5mm的段，用80％乙醇溶液回流提取，提取溫度60℃，提取4次，合并提取液，每次提取1h。

提取液濃縮：把提取液于60℃，減壓濃縮，濃縮至無(wú)醇，收集濃縮液，備用。

3.2富集：

采用NM100-反相聚合物色譜填料。

過(guò)程：

處理好的濃縮液，上反相聚合填料進(jìn)行吸附，吸附完成后，先用水洗，水洗液棄去，然后用50％濃度的乙醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液；通過(guò)高效液相色譜進(jìn)行在線監(jiān)控，洗脫至基本無(wú)目標(biāo)產(chǎn)品后，用90％乙醇洗脫，收集洗脫液待回收利用；

二次富集：將中濃度醇洗脫得到的洗脫液減壓濃縮至無(wú)醇，上反相聚合物填料進(jìn)行吸附，吸附完成后用90％乙醇溶液洗脫，得到洗脫液。

3.3純化：

純化方法：硅膠柱層析色譜

純化原料：洗脫液60℃減壓濃縮至浸膏，用硅膠(60～80目)拌樣(浸膏與硅膠的質(zhì)量比為1:4)，成棕色分散的顆粒，作為過(guò)柱原料。

過(guò)柱體系：乙酸乙酯與甲醇的體積比為20:1，除去原料中小極性雜質(zhì)，TLC跟蹤在線檢測(cè)，雜質(zhì)色帶洗脫完成后，換為乙酸乙酯與甲醇的體積比為5：1洗脫，收集該色帶段洗脫液，得到純化洗脫液，該段主要為獐牙菜苷系列成分半成品段；產(chǎn)品色帶洗脫完全后換乙酸乙酯與甲醇的體積比為3：1洗脫，收集洗脫液，該段含少量產(chǎn)品后段，最后壓干硅膠柱試劑，洗脫完成。

收集乙酸乙酯與甲醇的體積比為5：1的洗脫液，得到純化洗脫液。

3.4分離

將純化洗脫液50℃減壓濃縮至浸膏，然后用30％甲醇水溶液溶解，得到制備原料。

將所述制備原料通過(guò)制備型高效液相色譜分離；所述制備型高效液相色譜的色譜柱為C18色譜柱；流動(dòng)相為甲醇水溶液其中甲醇的濃度為40％；流動(dòng)相的流速為200ml/min；根據(jù)產(chǎn)品的特征性質(zhì)，收集不同的信號(hào)峰的洗脫液，然后進(jìn)行分析高效液相在線檢測(cè)，可收集到獐牙菜苷、龍膽苦苷與獐牙菜苦苷的純品，純度一次可達(dá)到99％。

3.5純品富集干燥

將得到的獐牙菜苷、龍膽苦苷與獐牙菜苦苷三種單體的產(chǎn)品濃縮液分別上NM100-反相聚合物色譜填料吸附，吸附完成后用高濃度95％乙醇洗脫，得到的洗脫液50℃減壓濃縮至干，45℃真空干燥，得到獐牙菜苷、獐牙菜苦苷及龍膽苦苷。

質(zhì)控檢測(cè)方法：

HPLC條件：C18柱；流動(dòng)相條件：乙腈-0.2％磷酸水(13:87)；檢測(cè)波長(zhǎng)：238nm。

獐牙菜苷的純度為99.5％；收率為82％。

龍膽苦苷的純度為99.95％；收率為83％。

獐牙菜苦苷的純度為99.0％；收率為81％。