本發(fā)明涉及萘普替尼原料及其相關(guān)制劑的分析方法，具體涉及一種用高效液相色譜梯度法進(jìn)行測(cè)定的方法，屬于藥物分析檢測(cè)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

萘普替尼是一種苯胺喹唑啉類抗癌新藥，臨床擬用于晚期非小細(xì)胞肺癌的治療。其化學(xué)名稱為(E)-N-[4-(3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-乙氧基喹唑啉-6-基]-4-(二甲氨基)丁-2-烯酰胺二甲苯磺酸鹽結(jié)晶水合物，分子式為C₂₂H₂₃ClFN₅O₂·(C₇H₈O₃S)₂，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：

萘普替尼在合成和儲(chǔ)藏過(guò)程中在2位雙鍵上容易產(chǎn)生順式異構(gòu)體，另同時(shí)也可能存在各中間體、副產(chǎn)物和降解產(chǎn)物，采用一般的分析方法難于分離萘普替尼與它的光學(xué)異構(gòu)體，本文通過(guò)調(diào)節(jié)不同的流動(dòng)相組成、比例、不同的洗脫方式，不同的PH值及不同的無(wú)機(jī)鹽濃度首次實(shí)現(xiàn)了同時(shí)測(cè)定萘普替尼光降解產(chǎn)物及其它相關(guān)有關(guān)物質(zhì)的目的，很好地保證了萘普替尼原料的質(zhì)量可控，具有現(xiàn)實(shí)意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種高效液相色譜梯度法同時(shí)測(cè)定萘普替尼光降解產(chǎn)物及其它有關(guān)物質(zhì)的方法，可用于萘普替尼制備過(guò)程及最終產(chǎn)品的質(zhì)量控制。

本發(fā)明的技術(shù)方案為：

一種高效液相色譜梯度法同時(shí)測(cè)定萘普替尼光降解產(chǎn)物及其它相關(guān)有關(guān)物質(zhì)的方法，其特征在于，該檢測(cè)方法包括以下步驟：

(1)制備標(biāo)準(zhǔn)品溶液

以所述標(biāo)準(zhǔn)品溶液在下述色譜條件下進(jìn)行系統(tǒng)適用性試驗(yàn)，校定檢測(cè)系統(tǒng)：

色譜條件：色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠柱，以磷酸鹽緩沖液-甲醇(82∶18)為流動(dòng)相A，以磷酸鹽緩沖液-甲醇(40∶60)為流動(dòng)相B，梯度洗脫，磷酸鹽緩沖液的濃度為0.04～0.1mol/L，pH值為7.0～7.8，柱溫為25～35℃，流速為0.9～1.1ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為247nm；

標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備：分別取起始原料、中間體1、中間體2、中間體3、雜質(zhì)A、光照產(chǎn)物(雜質(zhì)B)和萘普替尼對(duì)照品加流動(dòng)相A制成每1ml中約含0.0025～0.5mg的混合溶液；

精密量取10μl所述混合溶液注入液相色譜儀，記錄色譜圖，校定檢測(cè)系統(tǒng)至萘普替尼主峰與相鄰雜質(zhì)B的峰的分離度應(yīng)大于1.5，理論板數(shù)和拖尾因子按萘普替尼主峰計(jì)算應(yīng)不低于10000和不大于1.5；

(2)制備供試品溶液和對(duì)照品溶液

取萘普替尼待測(cè)樣品，加流動(dòng)相A制成濃度為0.5mg/ml的溶液，作為供試品溶液；取萘普替尼對(duì)照品，加流動(dòng)相A制成濃度為0.005mg/ml的溶液，作為對(duì)照品溶液。

(3)通過(guò)高效液相色譜測(cè)定待測(cè)樣品中雜質(zhì)B及相關(guān)有關(guān)物質(zhì)的含量

以對(duì)照品溶液注入經(jīng)上述步驟(1)校定后的液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度，再將供試品溶液注入液相色譜儀，在步驟(1)所述的色譜條件下進(jìn)行高效液相色譜測(cè)定，記錄色譜圖至萘普替尼主峰保留時(shí)間的3～4倍。

(4)計(jì)算待測(cè)樣品中各雜質(zhì)的含量

按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，各雜質(zhì)峰面積之和不得過(guò)1.0％。

其中，上述的梯度洗脫中，流動(dòng)相A比例的變化范圍為于0～10分鐘，線性梯度洗脫，流動(dòng)相A的比例從75％變化為55％，流動(dòng)相B的比例從25％變化為45％；于10～20分鐘，等度洗脫，流動(dòng)相A的比例保持55％不變，流動(dòng)相B的比例保持45％不變；于20～30分鐘，線性梯度洗脫，流動(dòng)相A的比例從55％變化為0％，流動(dòng)相B的比例從45％變化為100％；于30～40分鐘，等度洗脫，流動(dòng)相A的比例保持0％不變，流動(dòng)相B的比例保持100％不變，于40～45分鐘，流動(dòng)相A和B回到初始比例，色譜柱重新平衡。

更優(yōu)選地，上述磷酸鹽選自磷酸二氫鈉，濃度為0.05mol/L，pH值為7.5。

上述色譜條件為：色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠柱(100×4.6mm，3.5μm)，以體積比為82∶18的磷酸鹽緩沖液-甲醇為流動(dòng)相A，以體積比為40：60的磷酸鹽緩沖液-甲醇為流動(dòng)相B，梯度洗脫，柱溫為30℃，流速為1.0ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為247nm。

更優(yōu)選地，上述色譜柱為Waters XBridge C₁₈色譜柱。

上述萘普替尼樣品包括萘普替尼原料、萘普替尼中間體、萘普替尼片和萘普替尼膠囊。

本發(fā)明通過(guò)使用高效液相色譜梯度法同時(shí)測(cè)定萘普替尼的光降解產(chǎn)物及其它有關(guān)物質(zhì)，通過(guò)對(duì)色譜條件的探索，確定了可以有效分離萘普替尼及有關(guān)物質(zhì)的色譜條件，本方法專屬性好、分離度佳、靈敏度高、重現(xiàn)性好，對(duì)評(píng)價(jià)合成和制劑工藝的優(yōu)劣、終產(chǎn)品質(zhì)量控制及穩(wěn)定性樣品檢測(cè)具有重要的意義，本發(fā)明首次測(cè)定了萘普替尼光降解產(chǎn)物及其它有關(guān)物質(zhì)的含量，未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)。

本發(fā)明中，所述"有關(guān)物質(zhì)"是指在藥物制備和貯存過(guò)程中，可能生成和降解產(chǎn)生的雜質(zhì)(包括中間體、副產(chǎn)物等有機(jī)雜質(zhì))。其中，萘普替尼的有關(guān)物質(zhì)包括：雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、中間體1、中間體2、中間體3、起始原料。

本發(fā)明方法適用于萘普替尼中間體、萘普替尼原料及含萘普替尼的相關(guān)制劑，如固體制劑包括片劑以及膠囊等。本發(fā)明檢測(cè)方法準(zhǔn)確，操作簡(jiǎn)單，時(shí)間迅速，可以充分滿足有關(guān)物質(zhì)檢查與分解產(chǎn)物測(cè)定的要求，較好地控制樣品中的特定雜質(zhì)與非特定雜質(zhì)，保證產(chǎn)品質(zhì)量，在實(shí)際質(zhì)量控制工作中實(shí)用性強(qiáng)。

附圖說(shuō)明

圖1是系統(tǒng)適用性典型HPLC圖譜，1是雜質(zhì)A，2是光照產(chǎn)物(雜質(zhì)B)，3是萘普替尼，4是中間體2，5是中間體3，6是起始原料，7是中間體1；

圖2是萘普替尼原料供試品溶液的色譜圖(批號(hào)：20141201)；

圖3是萘普替尼粗品供試品溶液的色譜圖(批號(hào)：20141201)；

圖4是萘普替尼片劑供試品溶液的色譜圖(批號(hào)：20150204)；

圖5是萘普替尼膠囊供試品溶液的色譜圖(批號(hào)：20150301)；

具體實(shí)施方式

儀器：Agilent 1260系列高效液相色譜儀；

試劑：磷酸二氫鈉(分析純)，氫氧化鈉(分析純)，甲醇(色譜純，Merk公司)；

色譜柱：Waters XBridge C₁₈色譜柱(100×4.6mm，3.5μm)；

標(biāo)準(zhǔn)品的化學(xué)名、結(jié)構(gòu)式及來(lái)源：

萘普替尼：自制，純度：97.6％，批號(hào)：20141001；取萘普替尼原料經(jīng)甲醇-水重結(jié)晶，干燥，即得；

雜質(zhì)A：

化學(xué)名：1-[4-(3-氯-4-氟苯基氨基)-7-乙氧基喹唑啉-6-基]-5-羥基吡咯烷-2-酮

結(jié)構(gòu)式：

來(lái)源：自制，純度：98.6％，批號(hào)：20141105，取萘普替尼原料溶于甲醇-水，60℃降解2小時(shí)，經(jīng)制備液相色譜收集，濃縮，冷凍干燥即得；

雜質(zhì)B：

化學(xué)名：(Z)-N-[4-(3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-乙氧基喹唑啉-6-基]-4-(二甲氨基)丁-2-烯酰胺

結(jié)構(gòu)式：

來(lái)源：自制，純度：98.2％，批號(hào)：20141117，取萘普替尼原料溶于甲醇-水，置光照(5000±500lx)條件下放置5天，取出，經(jīng)制備液相色譜收集，濃縮，冷凍干燥即得；

起始原料：化學(xué)名：N-(3-氯-4-氟苯基)-7-氟-6-硝基-4-喹唑啉胺，批號(hào)：BM-20140410，市售；

中間體1：

化學(xué)名：N-(3-氯-4-氟苯基)-7-乙氧基-6-硝基-4-喹唑啉胺

結(jié)構(gòu)式：

來(lái)源：自制，純度：95.0％，批號(hào)：20140501，參照公開(kāi)號(hào)為CN 103755688A、名稱為《一種阿法替尼化合物的制備方法》中的方法制得；

中間體2：

化學(xué)名：N-(3-氯-4-氟苯基)-7-乙氧基-4,6-喹唑啉二胺

結(jié)構(gòu)式：

來(lái)源：自制，純度：95.4％，批號(hào)：20140501，參照公開(kāi)號(hào)為CN 103755688A、名稱為《一種阿法替尼化合物的制備方法》中的方法制得；

中間體3：

化學(xué)名：二乙基-[4-(3-氯-4-氟苯基氨基)-7-乙氧基喹唑啉-6-氨基]-2-氧乙基磷酸酯

結(jié)構(gòu)式：

來(lái)源：自制，純度：97.7％，批號(hào)：20140501，參照公開(kāi)號(hào)為CN 103755688A、名稱為《一種阿法替尼化合物的制備方法》中的方法制得；

萘普替尼原料及粗品：參照專利號(hào)為ZL201410822395.3、名稱為《萘普替尼對(duì)甲苯磺酸鹽的α晶型及制備方法和含有其的藥物組合物》中的方法制得；

CN105777655A公開(kāi)了萘普替尼以N-(3-氯-4-氟苯基)-7-氟-6-硝基-4-喹唑啉胺為起始原料，參考專利WO2007085638類似的方法來(lái)制備，成鹽過(guò)程參考專利WO2012121764的制備方法。

萘普替尼片劑及膠囊：參照本公司專利《一種含(E)-N-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-乙氧基喹唑啉-6-基)-4-(二甲氨基)丁-2-烯酰胺或其鹽的制劑組合物及其雜質(zhì)控制方法》中的方法制得。

萘普替尼片劑及膠囊的制備方法如下：

1、制備二甲苯磺酸萘普替尼的膠囊劑

表1制備二甲苯磺酸萘普替尼的膠囊劑的原料及比重

制備方法：根據(jù)表1所示的組分和量，將活性成分二甲苯磺酸萘普替尼過(guò)60-100目篩處理，然后與甘露醇、膠態(tài)二氧化硅、山崳酸甘油酯過(guò)40-60目篩一次并總混，總混完成后，直接置于膠囊自動(dòng)填充機(jī)中，根據(jù)內(nèi)容物重量填裝于4號(hào)、3號(hào)、2號(hào)明膠空心膠囊中即可。

2、制備二甲苯磺酸萘普替尼的片劑

2.1

表2制備二甲苯磺酸萘普替尼的片劑的原料及比重

制備方法：根據(jù)表2所示的組分和量，將活性成分二甲苯磺酸萘普替尼過(guò)60-100目篩處理，其他輔料過(guò)40-60目篩，再一起進(jìn)行總混后進(jìn)行壓片，按照規(guī)格1～4分別采用6mm、6mm、7mm和9mm圓形淺凹沖模壓成素片。對(duì)素片噴涂包衣材料(HPMC、三乙酸甘油酯或者二氧化鈦)，包衣時(shí)控制片表面受熱溫度在40-55℃之間。

2.2

表3制備二甲苯磺酸萘普替尼的片劑的原料及比重

制備方法：與2.1相同。

2.3

表4制備二甲苯磺酸萘普替尼的片劑的原料及比重

制備方法：與2.1相同。

2.4

表5制備二甲苯磺酸萘普替尼的片劑的原料及比重

制備方法：與2.1相同。

2.5制備含有穩(wěn)定劑的二甲苯磺酸萘普替尼的片劑

表6制備二甲苯磺酸萘普替尼的片劑的原料及比重

制備方法：將活性成分二甲苯磺酸萘普替尼過(guò)60-100目篩處理，酒石酸粉碎后過(guò)80-120目篩處理，將篩分后的二甲苯磺酸萘普替尼、酒石酸和膠態(tài)二氧化硅進(jìn)行預(yù)混合，再與其他輔料總混，然后進(jìn)行壓片，按照規(guī)格1～4分別分別采用6mm、6mm、7mm和9mm圓形淺凹沖模壓成素片。對(duì)素片噴涂包衣材料(HPMC、三乙酸甘油酯或者二氧化鈦)，包衣時(shí)控制片表面受熱溫度在40-55℃之間。

2.6制備含有穩(wěn)定劑的二甲苯磺酸萘普替尼的片劑

表7制備二甲苯磺酸萘普替尼的片劑的原料及比重

制備方法：與2.5相同。

【實(shí)施例1】高效液相色譜梯度法的條件篩選

1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

1.1流動(dòng)相的選擇

以萘普替尼與雜質(zhì)B(光照產(chǎn)物)的分離度，主峰理論板數(shù)和對(duì)稱因子作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，照下表8進(jìn)行梯度洗脫，篩選最佳磷酸鹽緩沖液濃度，最佳流動(dòng)相的pH值，最終確定磷酸二氫鈉緩沖液最佳濃度為0.05mol/L，流動(dòng)相的最佳pH值為7.5左右。磷酸鹽緩沖液濃度和pH值選擇結(jié)果見(jiàn)下表9～10。

表8.流動(dòng)相與洗脫時(shí)間

表9.磷酸鹽濃度選擇結(jié)果

表10.pH值選擇結(jié)果

1.2色譜柱的選擇

以萘普替尼與雜質(zhì)B(光照產(chǎn)物)的分離度，主峰理論板數(shù)和對(duì)稱因子作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，嘗試用不同品牌、不同型號(hào)的色譜柱，最后確定采用Waters XBridge C₁₈柱(100×4.6mm，3.5μm)，色譜柱選擇結(jié)果見(jiàn)表11。

表11.色譜柱選擇結(jié)果

1.3柱溫的選擇

以萘普替尼與雜質(zhì)B(光照產(chǎn)物)的分離度，主峰理論板數(shù)和對(duì)稱因子作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選擇柱溫為25℃、28℃、30℃、32℃和35℃進(jìn)行考察，最后確定柱溫為30℃，柱溫選擇結(jié)果見(jiàn)表12。

表12.柱溫選擇結(jié)果

1.4儀器及流速

Agilent 1260系列，DAD檢測(cè)器；流速為1.0ml/min。

在上述色譜條件下，萘普替尼主峰保留時(shí)間適中，理論板數(shù)高，峰形對(duì)稱，主峰與相鄰雜峰的分離度符合要求。

1.5靈敏度的測(cè)定

取適量萘普替尼對(duì)照品，用流動(dòng)相A配制成每1ml含0.5mg萘普替尼的溶液，作為供試品溶液。再分別用流動(dòng)相A稀釋成一系列不同濃度的溶液，分別進(jìn)樣10μl，使之產(chǎn)生主峰為基線噪音三倍的信號(hào)。經(jīng)試驗(yàn)，最小檢知量為0.6ng，(S/N≥3)，若以有關(guān)物質(zhì)檢查時(shí)的濃度0.5mg/ml計(jì)算，其檢出限度為0.01％。

1.6溶液穩(wěn)定性

取同一份供試品溶液，分別于0、0.5、1、2、4、6、8、10、12小時(shí)分別進(jìn)樣測(cè)定，其主峰面積及有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果在12小時(shí)內(nèi)基本穩(wěn)定。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，此方法簡(jiǎn)單靈敏，重現(xiàn)性好，可對(duì)樣品中萘普替尼的質(zhì)量進(jìn)行較好的控制。

色譜條件的確定：經(jīng)上述選擇試驗(yàn)，確定的色譜條件為：以十八烷基硅烷鍵合硅膠(100×4.6mm，3.5μm)為填充劑，以磷酸鹽緩沖液-甲醇(82∶18)為流動(dòng)相A，以磷酸鹽緩沖液-甲醇(40：60)為流動(dòng)相B，梯度洗脫，柱溫為30℃，流速為1.0ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為247nm；其中所述的梯度洗脫中，流動(dòng)相A比例的變化范圍為于0～10分鐘，線性梯度洗脫，流動(dòng)相A的比例從75％變化為55％，流動(dòng)相B的比例從25％變化為45％；于10～20分鐘，等度洗脫，流動(dòng)相A的比例保持55％不變，流動(dòng)相B的比例保持45％不變；于20～30分鐘，線性梯度洗脫，流動(dòng)相A的比例從55％變化為0％，流動(dòng)相B的比例從45％變化為100％；于30～40分鐘，等度洗脫，流動(dòng)相A的比例保持0％不變，流動(dòng)相B的比例保持100％不變，于40～45分鐘，流動(dòng)相A和B回到初始比例，色譜柱重新平衡。

1.7系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：

分別取起始原料、中間體1、中間體2、中間體3、雜質(zhì)A、光照產(chǎn)物(雜質(zhì)B)和萘普替尼對(duì)照品加流動(dòng)相A制成每1ml中約含0.0025～0.5mg的混合溶液；精密量取10μl所述混合溶液注入液相色譜儀，記錄色譜圖，校定檢測(cè)系統(tǒng)至萘普替尼主峰與相鄰雜質(zhì)B的峰的分離度應(yīng)大于1.5，理論板數(shù)和拖尾因子按萘普替尼主峰計(jì)算應(yīng)不低于10000和不大于1.5；圖譜如附圖1所示，萘普替尼與光照產(chǎn)物的分離度為2.84，萘普替尼主峰的理論板數(shù)和拖尾因子分別為26395和1.00，分離度、理論塔板數(shù)、拖尾因子滿足上述要求，因此，確定的色譜條件可用于萘普替尼原料、萘普替尼粗品、萘普替尼片劑、萘普替尼膠囊有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定。

2供試品溶液的制備

取萘普替尼待測(cè)樣品，加流動(dòng)相A制成濃度為0.5mg/ml的溶液，作為供試品溶液；

3對(duì)照品溶液的制備

取萘普替尼對(duì)照品，加流動(dòng)相A制成濃度為0.005mg/ml的溶液，作為對(duì)照品溶液。

4測(cè)定法

精密量取對(duì)照品溶液10μl注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度，使主成分色譜峰高約為滿量程的10～20％，再精密量取供試品溶液10μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖至萘普替尼主峰保留時(shí)間的3～4倍，供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰，量取各雜質(zhì)峰面積的和，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，各雜質(zhì)峰面積之和不得過(guò)1.0％。

【實(shí)施例2】萘普替尼原料有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定

取萘普替尼原料適量，精密稱定，加流動(dòng)相A制成濃度0.5mg/ml的溶液，作為供試品溶液。另取萘普替尼對(duì)照品，加流動(dòng)相A稀釋并制成濃度為0.005mg/ml的溶液，作為對(duì)照品溶液。在下列選定的色譜條件下：Waters XbridgeC₁₈柱(100×4.6mm，3.5μm)，以磷酸鹽緩沖液-甲醇(82∶18)為流動(dòng)相A，以磷酸鹽緩沖液-甲醇(40∶60)為流動(dòng)相B，照下表13進(jìn)行梯度洗脫，柱溫為30℃，流速為1.0ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為247nm；理論板數(shù)按萘普替尼主峰計(jì)算應(yīng)不低于10000，主峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)大于1.5。精密量取對(duì)照品溶液10μl注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度，使主成分色譜峰高約為滿量程的10～20％，再精密量取供試品溶液10μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖至萘普替尼主峰保留時(shí)間的3～4倍，供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰，計(jì)算各雜質(zhì)峰面積的和，按外標(biāo)法計(jì)算不得過(guò)1.0％)。分別對(duì)三個(gè)批次(20141001、20141101、20141201)的萘普替尼原料進(jìn)行測(cè)定，其中，萘普替尼原料有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定結(jié)果如下表15所示，圖譜如附圖2所示。

表13.流動(dòng)相與洗脫時(shí)間

表14.萘普替尼原料有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果

【實(shí)施例3】萘普替尼粗品有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定

取萘普替尼粗品適量，精密稱定，加流動(dòng)相A制成濃度0.5mg/ml的溶液，作為供試品溶液。另取萘普替尼對(duì)照品，加流動(dòng)相A稀釋并制成濃度為0.005mg/ml的溶液，作為對(duì)照品溶液。在下列選定的色譜條件下：Waters Xbridge C₁₈柱(100×4.6mm，3.5μm)，以磷酸鹽緩沖液-甲醇(82∶18)為流動(dòng)相A，以磷酸鹽緩沖液-甲醇(40∶60)為流動(dòng)相B，照下表15進(jìn)行梯度洗脫，柱溫為30℃，流速為1.0ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為247nm；理論板數(shù)按萘普替尼主峰計(jì)算應(yīng)不低于10000，主峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)大于1.5。精密量取對(duì)照品溶液10μl注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度，使主成分色譜峰高約為滿量程的10～20％，再精密量取供試品溶液10μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖至萘普替尼主峰保留時(shí)間的3～4倍，供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰，計(jì)算各雜質(zhì)峰面積的和，按外標(biāo)法計(jì)算不得過(guò)1.0％)。分別對(duì)三個(gè)批次(20141001、20141101、20141201)的萘普替尼粗品進(jìn)行測(cè)定，其中，萘普替尼粗品有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定結(jié)果如下表16所示。圖譜如附圖3所示。

表15.流動(dòng)相與洗脫時(shí)間

表16.萘普替尼粗品有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果

【實(shí)施例4】萘普替尼片劑有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定

取萘普替尼片細(xì)粉適量，精密稱取適量(約相當(dāng)于萘普替尼25mg)，加流動(dòng)相A制成濃度0.5mg/ml的溶液，作為供試品溶液。另取萘普替尼對(duì)照品，加流動(dòng)相A稀釋并制成濃度為0.005mg/ml的溶液，作為對(duì)照品溶液。在下列選定的色譜條件下：Waters Xbridge C₁₈柱(100×4.6mm，3.5μm)，以磷酸鹽緩沖液-甲醇(82∶18)為流動(dòng)相A，以磷酸鹽緩沖液-甲醇(40∶60)為流動(dòng)相B，照下表17進(jìn)行梯度洗脫，柱溫為30℃，流速為1.0ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為247nm；理論板數(shù)按萘普替尼主峰計(jì)算應(yīng)不低于10000，主峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)大于1.5。精密量取對(duì)照品溶液10μl注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度，使主成分色譜峰高約為滿量程的10～20％，再精密量取供試品溶液10μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖至萘普替尼主峰保留時(shí)間的3～4倍，供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰，量取各雜質(zhì)峰面積的和，按外標(biāo)法計(jì)算不得過(guò)1.0％。分別對(duì)三個(gè)批次(20150202、20150203、20150204)的萘普替尼片劑進(jìn)行測(cè)定，其中，萘普替尼片有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定結(jié)果如下表18所示。圖譜如附圖4所示。

表17.流動(dòng)相與洗脫時(shí)間

表18萘普替尼片有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果

【實(shí)施例5】萘普替尼膠囊有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定

取萘普替尼膠囊粉末混勻，精密稱取適量(約相當(dāng)于萘普替尼25mg)，加流動(dòng)相A制成濃度0.5mg/ml的溶液，作為供試品溶液。另取萘普替尼對(duì)照品，加流動(dòng)相A稀釋并制成濃度為0.005mg/ml的溶液，作為對(duì)照品溶液。在下列選定的色譜條件下：Waters Xbridge C₁₈柱(100×4.6mm，3.5μm)，以磷酸鹽緩沖液-甲醇(82∶18)為流動(dòng)相A，以磷酸鹽緩沖液-甲醇(40∶60)為流動(dòng)相B，照下表19進(jìn)行梯度洗脫，柱溫為30℃，流速為1.0ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為247nm；理論板數(shù)按萘普替尼主峰計(jì)算應(yīng)不低于10000，主峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)大于1.5。精密量取對(duì)照品溶液10μl注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度，使主成分色譜峰高約為滿量程的10～20％，再精密量取供試品溶液10μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖至萘普替尼主峰保留時(shí)間的3～4倍，供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰，量取各雜質(zhì)峰面積的和，按外標(biāo)法計(jì)算不得過(guò)1.0％。分別對(duì)三個(gè)批次(20150301、20150302、20150303)的萘普替尼膠囊進(jìn)行測(cè)定，其中，萘普替尼膠囊有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定結(jié)果如下表20所示。圖譜如附圖5所示。

表19.流動(dòng)相與洗脫時(shí)間

表20.萘普替尼膠囊有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果