本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種卡泊三醇中間體L及其潛在基因毒性雜質(zhì)的分離與測定方法。

背景技術(shù)：

卡泊三醇化學(xué)名稱為9，10-開環(huán)膽甾-24-環(huán)丙基-5，7，10(19)，22-四烯-1，3，24三醇，其分子式為C₂₇H₄₀O₃，分子量：412.61。卡泊三醇主要用于尋常型銀屑病的局部治療。化合物L(fēng)是合成卡泊三醇的一個重要的中間體，其結(jié)構(gòu)式如下：

基因毒性雜質(zhì)是指能直接或間接損傷細(xì)胞DNA，產(chǎn)生致突變和致癌作用的物質(zhì)。在生產(chǎn)過程中，可能產(chǎn)生基因毒性雜質(zhì)的環(huán)節(jié)包括新藥合成、原料純化、儲存運(yùn)輸(與包裝物接觸)等，故在新藥合成階段應(yīng)該指明涉及到的所有具有基因毒性或有致癌性的化學(xué)物質(zhì)，如所用試劑、中間體、副產(chǎn)品等。更進(jìn)一步，在藥物活性物質(zhì)中沒有出現(xiàn)的基因毒性反應(yīng)物和有基因毒性結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，都應(yīng)該被考慮。具有毒性作用的基團(tuán)一般具有親電試劑的性質(zhì)，這些基團(tuán)在生理條件下同體內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)或其他重要成分中的親核中心發(fā)生取代反應(yīng)，使這些成分發(fā)生不可逆的損傷，表現(xiàn)為毒性、致突變或致癌等作用。表現(xiàn)為毒性、致突變或致癌等作用的基團(tuán)舉例如下：

在中間體L的合成中，使用到的原料如咪唑、三苯基氧磷等，這些原料殘留雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)式如下：

咪唑和三苯基氧磷因含有某些表現(xiàn)為毒性、致突變或致癌等作用的基團(tuán)因而警示其可能具有基因毒性，卡泊三醇中間體L在合成過程中殘留的上述雜質(zhì)除去不完全最終會影響藥物的純度和質(zhì)量。因此，為了控制中間體L的質(zhì)量，需要對中間體L及其潛在基因毒性雜質(zhì)進(jìn)行分離和測定。但是，目前還沒有分離及測定中間體L及其潛在基因毒性雜質(zhì)的HPLC方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種高效液相色譜法分離測定卡泊三醇中間體L及其潛在基因毒性雜質(zhì)的方法，利用高效液相色譜法，能夠?qū)崿F(xiàn)中間體L及雜質(zhì)的有效分離與測定。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：

高效液相色譜法分離卡泊三醇中間體L及潛在基因毒性雜質(zhì)的方法，所述的方法是采用以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱，進(jìn)樣，然后采用流動相進(jìn)行洗脫分離。

本發(fā)明所述的方法適用于卡泊三醇中間體L及潛在基因毒性雜質(zhì)的分離，可用于單獨(dú)分離某一種雜質(zhì)，也可同時分離卡泊三醇中間體L及雜質(zhì)。

本發(fā)明所述的高效液相色譜法分離卡泊三醇中間體L及潛在基因毒性雜質(zhì)的方法，所述的潛在基因毒性雜質(zhì)為咪唑。

進(jìn)一步，所述流動相為乙腈與0.3％二乙胺水溶液的混合液。

進(jìn)一步，所述流動相中乙腈與0.3％二乙胺水溶液的體積比為4-6：94-96。進(jìn)一步，所述0.3％二乙胺水溶液采用磷酸調(diào)節(jié)pH為3.1±0.2。

本發(fā)明所述的高效液相色譜法分離卡泊三醇中間體L及潛在基因毒性雜質(zhì)的方法，所述潛在基因毒性雜質(zhì)為三苯基氧膦。

進(jìn)一步，所述流動相為乙腈與0.5％冰乙酸水溶液的混合液。

進(jìn)一步，所述流動相中乙腈與0.5％冰乙酸水溶液的體積比為40-60：40-60。

本發(fā)明所述的高效液相色譜法分離卡泊三醇中間體L及潛在基因毒性雜質(zhì)的方法，具體步驟如下：取中間體L及潛在基因毒性雜質(zhì)對照品加稀釋劑溶解制備成已知濃度的對照品溶液，取供試品加稀釋劑溶解制備成供試品溶液，分別取對照品溶液及供試品溶液進(jìn)樣，進(jìn)行高效液相色譜分析，記錄色譜圖，比較供試品溶液與對照品溶液中對應(yīng)出峰時間的雜質(zhì)的峰面積，計算供試品中所含卡泊三醇中間體L及潛在基因毒性雜質(zhì)的含量；所述 稀釋劑為流動相或流動相中的任一種有機(jī)溶劑。

進(jìn)一步，進(jìn)行高效液相色譜分析，所述流動相流速為0.5-1.5ml/min，優(yōu)選1ml/min；所述高效液相色譜分析采用紫外檢測器進(jìn)行檢測，檢測波長為220±5nm。

進(jìn)一步，進(jìn)行高效液相色譜分析，所述色譜柱的規(guī)格為4.6×250mm，5μm。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明的高效液相色譜法分離卡泊三醇中間體L及潛在基因毒性雜質(zhì)的方法，該方法能夠?qū)崿F(xiàn)卡泊三醇中間體L與雜質(zhì)的有效分離，實(shí)現(xiàn)了雜質(zhì)有效控制，從根本上確定了產(chǎn)品質(zhì)量，具有簡便，快速，準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)；同時采用高效液相色譜法操作簡單，專屬性強(qiáng)，靈敏度高。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1中稀釋劑的HPLC圖，圖中的色譜峰為稀釋劑的色譜峰。

圖2為實(shí)施例1中咪唑?qū)φ掌返腍PLC圖，圖中的色譜峰為咪唑?qū)φ掌返纳V峰，保留時間在2.3min左右。

圖3為實(shí)施例1中供試品的HPLC圖，圖中的色譜峰為供試品的色譜峰，在此系統(tǒng)供試品未出峰，與稀釋劑的色譜峰一致。

圖4為實(shí)施例1中混合液的HPLC圖，圖中的色譜峰為咪唑的色譜峰，保留時間在2.3min左右。

圖5為實(shí)施例2中稀釋劑的HPLC圖，圖中的色譜峰為稀釋劑的色譜峰。

圖6為實(shí)施例2中X定位溶液的HPLC圖，圖中的色譜峰為X的色譜峰，保留時間在1.9min左右。

圖7為實(shí)施例2中三苯基氧膦對照品的HPLC圖，圖中的色譜峰為三 苯基氧膦的色譜峰，保留時間在8.6min左右。

圖8為實(shí)施例2中S-聯(lián)萘酚對照品的HPLC圖，圖中的色譜峰為S-聯(lián)萘酚的色譜峰，保留時間在20.3min左右。

圖9為實(shí)施例2中供試品的HPLC圖，圖中的色譜峰為供試品的色譜峰，在此系統(tǒng)供試品未出峰，與稀釋劑的色譜峰一致。

圖10為實(shí)施例2中混合液的HPLC圖，圖中的色譜峰依次為X、三苯基氧膦、S-聯(lián)萘酚的色譜峰，保留時間依次為：1.9min、8.7min、20.4min。

具體實(shí)施方式

所舉實(shí)施例是為了更好地對本發(fā)明的內(nèi)容進(jìn)行說明，但并不是本發(fā)明的內(nèi)容僅限于所舉實(shí)施例。所以熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)上述發(fā)明內(nèi)容對實(shí)施方案進(jìn)行非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例中所涉及的對照品來源：

L：重慶華邦制藥有限公司，批號：Cal-L-140903，99.0％；

咪唑：成都科龍化工試劑廠，批號：2014061601 99.3％；

三苯基氧膦：阿拉丁試劑，批號：F1410025 98％；

實(shí)施例1

本實(shí)施例中采用的儀器及色譜條件如下：

儀器：高效液相色譜儀；

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18(4.6×250mm，5μm)；

流動相：乙腈：0.3％二乙胺水溶液(磷酸調(diào)pH＝3.1)＝5:95；

波長：220nm；

柱溫：30℃；

流速：1.0ml/min；

進(jìn)樣體積：10μl；

稀釋劑：乙腈。

(1)咪唑?qū)φ掌啡芤海悍Q取咪唑10.05mg，置100ml量瓶中，加稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，得咪唑儲備液，移取該溶液1ml，置100ml量瓶中，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得。

(2)供試品溶液：稱取待測品L 10.25mg，置10ml量瓶中，加稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

(3)混合溶液：稱取中間體L對照品10.29mg，移取咪唑儲備液溶液0.1ml，置同一10ml量瓶中，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得。

(4)測定方法：分別取稀釋劑、供試品溶液、咪唑?qū)φ掌啡芤汉突旌先芤焊?0μl進(jìn)樣，按上述色譜條件進(jìn)行高效液相色譜分析，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1-4，比較供試品溶液與對照品溶液中咪唑的峰面積，可以看出，在該條件下L不出峰，與稀釋劑色譜峰一致，且不影響咪唑的測定，咪唑的保留時間在2.3min，待測供試品L均未檢出雜質(zhì)咪唑。

實(shí)施例2

本實(shí)施例中采用的儀器及色譜條件如下：

儀器：SHIMADZU LC-2010AHT；

色譜柱：VP-0DS C18(4.6×250mm，5μm)；

流動相：乙腈：0.5％冰乙酸＝48：52；

波長：225nm；

柱溫：30℃；

流速：1.0ml/min；

進(jìn)樣體積：20μl；

稀釋劑：乙腈。

本實(shí)施例中所分離的雜質(zhì)除了三苯基氧磷外，可能還包括X與S-聯(lián)萘酚。

雜質(zhì)X與S-聯(lián)萘酚的結(jié)構(gòu)式如下：

(1)三苯基氧磷對照品溶液：稱取雜質(zhì)三苯基氧磷10.23mg，置100ml量瓶中，加稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，得三苯基氧磷儲備液，移取該溶液1.0ml至100ml量瓶中，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得。

(2)X定位溶液：稱取雜質(zhì)X 10.12mg，置100ml量瓶中，加稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，得X儲備液，移取該溶液2.5ml至100ml量瓶中，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得。

(3)S-聯(lián)萘酚定位溶液：稱取雜質(zhì)S-聯(lián)萘酚10.35mg，置100ml量瓶中，加稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，得S-聯(lián)萘酚儲備液，移取該溶液2.5ml至100ml量瓶中，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得。

(4)供試品溶液：稱取待測供試品L10.26mg，置10ml量瓶中，加稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

(5)混合溶液：稱取中間體L的對照品10.21mg，分別移取三苯基氧磷、X、S-聯(lián)萘酚儲備液，各0.5ml，置同一10ml量瓶中，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得。

(6)測定方法：分別取稀釋劑、三苯基氧磷對照品溶液、供試品溶液X定位溶液、S-聯(lián)萘酚定位溶液及混合溶液20μl進(jìn)樣，按上述色譜條件進(jìn)行高效液相色譜分析，記錄色譜圖，比較供試品溶液與對照品溶液中三苯基氧磷的峰面積，結(jié)果見圖5-10，可以看出，在該條件下L不出峰，與稀釋劑色譜峰一致，且不影響三苯基氧膦的測定；X和S-聯(lián)萘酚與三苯基氧膦完全分開，分離度符合要求；三苯基氧膦的保留時間在8.6min，待測供試品L均未檢出雜質(zhì)三苯基氧膦。

最后說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng) 當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的宗旨和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。