本發(fā)明屬于超高效液相色譜質(zhì)譜儀器分析領(lǐng)域，特別是涉及一種解決易氧化分析物在超高效液相色譜電噴霧質(zhì)譜上氧化反應(yīng)問題的方法。

背景技術(shù)：
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超高效液相色譜-質(zhì)譜(UPLC-MS)是近十多年來迅速發(fā)展起來的高通量分析技術(shù)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于環(huán)境科學(xué)、藥物研發(fā)、臨床化學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、疾病診斷、營(yíng)養(yǎng)食品科學(xué)、毒理學(xué)及天然產(chǎn)物化學(xué)等領(lǐng)域。UPLC-MS已經(jīng)成為多類分析實(shí)驗(yàn)室普遍使用的檢測(cè)技術(shù)，主要用于檢測(cè)極性和中等極性有機(jī)化學(xué)物。UPLC-MS由產(chǎn)生和耐受超高壓的液相色譜系統(tǒng)和質(zhì)譜檢測(cè)器組成，UPLC的核心是超高效液相色譜柱和耐高壓液相泵。超高效液相色譜柱的填料顆粒直徑一般在2.0μm以下，最先進(jìn)的色譜柱填料直徑已達(dá)到1.7μm。超高效液相色譜柱具有遠(yuǎn)超普通液相色譜柱的柱效，具有強(qiáng)大的分離能力，能在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到良好的分離效果，使分析效率得以顯著提高。UPLC-MS的接口一般有電噴霧離子源(ESI)、大氣壓化學(xué)電離源(APCI)和大氣壓光學(xué)電離源(APPI)三種，其中以ESI源的應(yīng)用最為普遍。UPLC與MS的結(jié)合具有快速、高效和可靠的分析能力，已經(jīng)成為分析各類化合物的黃金法則。然而，具有強(qiáng)大分析能力的UPLC-MS也并不是完美無缺的，該技術(shù)隱藏著一些缺陷。例如，一些易氧化和易還原的化合物可能會(huì)在ESI源上發(fā)生氧化還原反應(yīng)(Kanev IL,Mikheev AY,Shlyapnikov YM,Shlyapnikova EA,Morozova TY,Morozov VN.Anal.Chem.2014,86,1511-1517；Pasilis SP,Kertesz V,Van Berkel GJ.Anal.Chem.2008,80,1208-1214；Boys BL,Kuprowski MC,Noe JJ,Konermann L.Anal.Chem.2009,81,4027-4034.)，從而導(dǎo)致檢測(cè)信號(hào)的降低或?qū)衔镨b定造成誤判。此外，使用UPLC-MS時(shí)，UPLC柱能產(chǎn)生強(qiáng)大的剪切力，可導(dǎo)致大分子化合物如聚合物斷鏈，從而影響分析結(jié)果(Uliyanchenko E,Van der Wal S,Schoenmakers PJ.2011,1218,6930-6942；Uliyanchenko E,Cools PJ,van der Wal S,Schoenmakers PJ.Anal.Chem.2012,84,7802-7809.)。

最近，我們?cè)谝豁?xiàng)研究中首次發(fā)現(xiàn)，UPLC能導(dǎo)致還原性分析物在UPLC柱上發(fā)生氧化反應(yīng)(圖1)，造成分析物信號(hào)降低和不穩(wěn)定，進(jìn)而導(dǎo)致定量分析不能進(jìn)行，定性分析也有誤判的風(fēng)險(xiǎn)。在該研究中，我們已經(jīng)確證了氧化反應(yīng)發(fā)生在UPLC柱的出口篩板上(Tang C,Tan J,Jin J,Xi S,Li H,Xie Q,Peng X.Rapid Commun.Mass Spectrom.2015,29,1863-1873.)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的是提供一種解決超高效液相色譜電噴霧質(zhì)譜上發(fā)生氧化反應(yīng)問題的方法。

本發(fā)明的解決超高效液相色譜電噴霧質(zhì)譜上發(fā)生氧化反應(yīng)問題的方法，其特征在于，在超高效液相色譜電噴霧質(zhì)譜的流動(dòng)相中加入(NH₄)₂S作為還原劑，以此為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫。

優(yōu)選：所述的方法包括以下步驟：

a、配置還原劑溶液：取(NH₄)₂S，用水配置至1mmol/L的(NH₄)₂S溶液，以此作為流動(dòng)相A；

b、色譜條件：

超高效液相色譜儀：AcquityTM Waters UPLC；

色譜柱：Waters公司生產(chǎn)的各類UPLC柱；

流動(dòng)相：流動(dòng)相A為1mmol/L的(NH₄)₂S溶液，流動(dòng)相B為甲醇或乙腈；

c、質(zhì)譜條件：

質(zhì)譜儀：Waters Synapt Q-TOF質(zhì)譜

離子源：電噴霧離子源，正或負(fù)離子模式；

毛細(xì)管電壓：2.5KV；

錐孔電壓：50V；

脫溶劑氣溫度：400℃；離子源溫度：100℃；脫溶劑氣流速：600L/h；錐孔氣流速：50L/h；四極桿采集質(zhì)量數(shù)范圍：100-1000u。

本發(fā)明的有益效果如下：

本發(fā)明經(jīng)發(fā)明人大量的實(shí)驗(yàn)，得出解決超高效液相色譜電噴霧質(zhì)譜上氧化反應(yīng)問題最佳方法和條件，該方法以一種易氧化的多酚類天然產(chǎn)物黃芩苷為示例化合物，利用在流動(dòng)相中加入還原劑(NH₄)₂S的方法，抑制易氧化分析物在UPLC柱上的氧化反應(yīng)，或者在ESI源上將分析物在UPLC柱上氧化后的產(chǎn)物還原至原始形態(tài)，聯(lián)合Q-TOF-HRMS技術(shù)對(duì)氧化產(chǎn)物和分析物進(jìn)行確證，測(cè)定分析物在無還原劑條件下和有還原劑條件下的UPLC-ESI-MS上的氧化反應(yīng)比率。得出：采用本發(fā)明所述方法，黃芩苷在UPLC-ESI-MS系統(tǒng)中的氧化率顯著降低，僅用以30％流動(dòng)相A(1mmol/L的(NH₄)₂S溶液)等濃度洗脫時(shí)(400μL/min)，黃芩苷在UPLC-ESI-MS系統(tǒng)中的氧化率就可從60％左右降至不可觀測(cè)。本發(fā)明的方法還原效率高、簡(jiǎn)便實(shí)用、成本低廉，且因?yàn)?NH₄)₂S是一種易分解性鹽，在ESI源上易分解，不會(huì)污染離子源，對(duì)分析物沒有離子抑制，還能顯著提高分析物的質(zhì)譜信號(hào)。

附圖說明：

圖1為分析物在UPLC柱上發(fā)生氧化反應(yīng)的示意圖；

圖2為(NH₄)₂S抑制分析物在UPLC柱上發(fā)生氧化反應(yīng)及在ESI源中發(fā)生還原反應(yīng)的示意圖；圖3為黃芩苷在無還原劑條件下和有還原劑條件下的UPLC-ESI-MS上的氧化反應(yīng)產(chǎn)物及原形化合物質(zhì)譜圖。

具體實(shí)施方式

以下將結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。

實(shí)施例1：解決黃芩苷在超高效液相色譜電噴霧質(zhì)譜上發(fā)生氧化反應(yīng)問題的方法

本實(shí)施例以黃芩苷為檢測(cè)對(duì)象，通過在流動(dòng)相中加入還原性鹽的方法抑制分析物在UPLC-ESI-MS上的氧化反應(yīng)，或在ESI源上將在UPLC柱上產(chǎn)生的黃芩苷氧化物還原至黃芩苷，并利用ESI-QTOF-MS監(jiān)測(cè)黃芩苷和黃芩苷氧化物，以分析黃芩苷在UPLC-ESI-MS上的氧化率和(NH₄)₂S在UPLC-ESI-MS上對(duì)黃芩苷氧化反應(yīng)的抑制效率。

其具體方案如下：

一、實(shí)驗(yàn)儀器與裝置

超高效液相色譜-四極桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀：美國(guó)Waters公司產(chǎn)品，配有電噴霧離子源(ESI)及Masslynx數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；

Milli-Q超純水系統(tǒng)：美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品。

二、主要材料與試劑

黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥98％，上海詩丹德生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；

(NH₄)₂S溶液：(S％≥8％)，廣州化學(xué)試劑廠；

乙腈：色譜純，美國(guó)Thermo Fisher公司產(chǎn)品；甲酸：色譜級(jí)，上海安譜公司產(chǎn)品；甲醇：色譜純，美國(guó)Thermo Fisher公司產(chǎn)品。

稱取黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品10.0mg(精確至0.01mg)于玻璃瓶中，用甲醇溶解，配成1mg/mL的單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-20℃冰箱保存。吸取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇/水(1:1,v/v)溶液配制成所需黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)溶液(濃度為1μg/mL)，配好后立即使用。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1、配置(NH₄)₂S稀溶液

用移液槍準(zhǔn)確吸取市售(NH₄)₂S溶液，加入超純水稀釋至1mmol/L，搖勻得(NH₄)₂S稀溶液，用作UPLC流動(dòng)相A。

2、檢測(cè)

取1.5mL黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)溶液(1μg/mL)加入2mL的進(jìn)樣小瓶中，置于UPLC的樣品盤上；以1mmol/L的(NH₄)₂S溶液為流動(dòng)相A(以不含(NH₄)₂S的超純水作為流動(dòng)相作為對(duì)照)；啟用UPLC-MS，進(jìn)樣分析黃芩苷溶液。

超高效液相色譜-四極桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜工作條件如下：

2.1色譜條件

色譜柱：BEH C18UPLC柱(2.1×50mm,1.7μm,Waters)；柱溫：30℃；進(jìn)樣體積：5μL；流速：400μL/min；流動(dòng)相：A為1mmol/L的(NH₄)₂S溶液，B為乙腈；等度洗脫程序：體積分?jǐn)?shù)30％A。

2.2質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源(ESI)，正或負(fù)離子模式；毛細(xì)管電壓：2.5KV；錐孔電壓：50V；脫溶劑氣溫度：400℃；離子源溫度：100℃；脫溶劑氣流速：600L/h；錐孔氣流速：50L/h；四極桿采集質(zhì)量數(shù)范圍：100～1000u。數(shù)據(jù)采集模式：棒狀(centroid)；掃描采集時(shí)間：0.2s；TOF運(yùn)行模式：V模式；以200ng/mL亮氨酸腦啡肽(m/z＝554.2615)溶液進(jìn)行實(shí)時(shí)校準(zhǔn)。

四、結(jié)果與討論

4.1UPLC-MS上的氧化反應(yīng)對(duì)分析結(jié)果的影響

如圖1所示，黃芩苷在UPLC柱上能發(fā)生氧化反應(yīng)，生成帶鄰苯醌結(jié)構(gòu)的化合物。一半以上的黃芩苷都被氧化成了鄰苯醌類化合物，而且反應(yīng)的比率還不穩(wěn)定，這樣就導(dǎo)致黃芩苷的定量分析結(jié)果顯著變差，甚至由此不能進(jìn)行定量分析；另外，在定性分析中，這種氧化反應(yīng)也可能導(dǎo)致誤判的鑒定結(jié)果，即把黃芩苷在UPLC柱上的氧化產(chǎn)物當(dāng)作實(shí)際樣品中的化合物；尤其是在色譜分離能力不夠的情況下，這種誤判更容易發(fā)生。

4.2流動(dòng)相中加入還原劑(NH₄)₂S對(duì)UPLC-MS上的氧化反應(yīng)的影響

如圖2和圖3所示，在流動(dòng)相中加入還原劑(NH₄)₂S后，黃芩苷在整個(gè)UPLC-ESI-MS系統(tǒng)中的氧化反應(yīng)比率顯著下降，用ESI-MS幾乎不能檢測(cè)到黃芩苷氧化物的母離子，氧化產(chǎn)物子離子的相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度也非常低。這說明流動(dòng)相中的還原劑(NH₄)₂S能有效地抑制黃芩苷的氧化反應(yīng)，或?qū)ⅫS芩苷氧化物還原至黃芩苷。如圖3所示，在沒有還原劑的條件下，黃芩苷在UPLC-ESI-MS系統(tǒng)中的氧化比率為59.2％；而以1mmol/L的(NH₄)₂S溶液為流動(dòng)相A時(shí)，黃芩苷在UPLC-ESI-MS系統(tǒng)中的氧化比率急劇下降至不可觀測(cè)。

4.3還原劑種類對(duì)還原效率的影響

本發(fā)明還試用其他的還原劑，包括維生素C、氫醌、多巴胺、兒茶酚、鄰苯二胺、五倍子酸丙酯、間苯二酚、甲醛和間苯三酚。其中維生素C、氫醌、多巴胺、兒茶酚、鄰苯二胺和五倍子酸丙酯都能降低黃芩苷在UPLC-ESI-MS系統(tǒng)中的氧化比率，在相同物質(zhì)的量濃度下，維生素C、鄰苯二胺和五倍子酸丙酯還原黃芩苷氧化物的效率還比較高，然而都沒能超過(NH₄)₂S在ESI源上對(duì)黃芩苷氧化物的還原效率。

4.3最高效、最適用還原劑的選擇

本發(fā)明最終挑選(NH₄)₂S為解決UPLC-ESI-MS上的氧化反應(yīng)問題的還原劑，因?yàn)?NH₄)₂S被證明為最高效、最適用的還原劑。盡管維生素C、氫醌、多巴胺、兒茶酚、鄰苯二胺和五倍子酸丙酯等還原劑也都能比較有效地解決發(fā)生在UPLC-ESI-MS上的氧化反應(yīng)問題，但是它們的還原效率明顯不如(NH₄)₂S。其次，(NH₄)₂S能在ESI源(400℃)中分解為氣體，因而不會(huì)在ESI源中沉積；而其他還原劑都是分子量相對(duì)于(NH₄)₂S較大的有機(jī)物，不大可能在ESI源中分解成氣體，因而可能會(huì)在ESI源中沉積，可能會(huì)污染離子源和堵塞噴霧針。最后，(NH₄)₂S被發(fā)現(xiàn)一般不會(huì)對(duì)分析物產(chǎn)生離子抑制效應(yīng)，相反，在負(fù)ESI源條件下，它還能促進(jìn)分析物的離子化，提高分析物的質(zhì)譜信號(hào)；其他還原劑本身能在ESI源中離子化，因而會(huì)跟分析物競(jìng)爭(zhēng)離子化，一般酸性還原劑會(huì)在負(fù)ESI源中抑制分析物離子化，堿性還原劑會(huì)在正ESI源中對(duì)分析物有離子抑制作用。

4.4結(jié)論

本實(shí)施例通過在流動(dòng)相中加入低濃度還原劑(NH₄)₂S的方法解決了黃芩苷在UPLC-ESI-MS系統(tǒng)中的氧化反應(yīng)問題。該方法優(yōu)選(NH₄)₂S為最高效、最適用的還原劑，1mmol/L的(NH₄)₂S稀溶液為流動(dòng)相，即可將黃芩苷的氧化率從約60％降至不可觀測(cè)。

結(jié)果表明：以(NH₄)₂S稀溶液為流動(dòng)相能有效地抑制還原性分析物在UPLC-ESI-MS上的氧化反應(yīng)，或者將分析物在UPLC柱上的氧化產(chǎn)物還原至原分析物形態(tài)，能成功解決易氧化分析物在UPLC-ESI-MS系統(tǒng)中的氧化反應(yīng)問題，使應(yīng)用UPLC-ESI-MS分析易氧化分析物的工作得以順利進(jìn)行。

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。