一種通過檢測反應(yīng)液中氨基酸濃度確定酶促反應(yīng)底物濃度的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于酶促反應(yīng)應(yīng)用領(lǐng)域，涉及一種通過檢測反應(yīng)液中氨基酸濃度確定酶促 反應(yīng)底物濃度的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 酶，指具有生物催化功能的高分子物質(zhì)，大部分為蛋白質(zhì)。它具有：高效性、專一 性、低反應(yīng)條件等特性?；谶@些特性酶被廣泛的應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)以及檢測中，傳統(tǒng)利用酶 促反應(yīng)檢測底物的方法是通過氣相色譜法、液相色譜法、旋光法、薄層色譜法、電噴霧質(zhì)譜 法等方法檢測酶促反應(yīng)產(chǎn)物的量來間接表征底物的量，步驟繁瑣、抗干擾能力。酶與底物結(jié) 合的過程中可能由于酶活性中心的氨基酸在與底物和水之間的質(zhì)子流的流動導(dǎo)致酶的電 荷狀態(tài)失衡從而導(dǎo)致酶分子上氨基酸，脫落氨基酸的量與底物濃度成正比，基于此現(xiàn)象，本 發(fā)明利用分光光度計檢測酶促反應(yīng)脫落氨基酸的量來表征底物的量，操作簡便、靈敏。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為解決現(xiàn)有技術(shù)中檢測酶促反應(yīng)中底物濃度的方法步驟繁瑣，抗干擾能力低等弊 端，本發(fā)明提供一種快速、準確檢測酶促反應(yīng)底物的方法，即能進行定性測定也能定量測 定，操作簡單、檢測靈敏。
[0004] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0005] 一種通過檢測反應(yīng)液中氨基酸濃度確定酶促反應(yīng)底物濃度的方法，步驟如下：
[0006] 針對不同的氨基酸檢測方法，在不同條件下進行酶促反應(yīng)，并測定反應(yīng)溶液中的 氨基酸濃度，分別作出氨基酸濃度-反應(yīng)溫度曲線、氨基酸濃度-反應(yīng)pH曲線和氨基酸濃 度-酶濃度曲線，在氨基酸濃度-反應(yīng)溫度曲線和氨基酸濃度-反應(yīng)PH曲線上，選擇氨基 酸濃度響應(yīng)最大的值，確定酶促反應(yīng)的溫度和PH條件，在氨基酸濃度-酶濃度曲線上，選擇 氨基酸濃度增長率最大的區(qū)間，確定酶濃度條件，在上述確定的溫度、PH和酶濃度條件下作 出反應(yīng)液中氨基酸濃度-初始反應(yīng)底物濃度的標準曲線，取待測濃度的底物溶液，在已確 定的溫度、PH和酶濃度條件下進行酶促反應(yīng)，測定反應(yīng)液中的氨基酸濃度，對應(yīng)所述標準曲 線，得出底物濃度。
[0007] 進一步地，現(xiàn)有技術(shù)中可用于氨基酸檢測的方法均可適用于本發(fā)明，其中優(yōu)選為 茚三酮法、臨苯二甲醛熒光法、氨基酸分析儀、離子交換色譜法、液相色譜法和氣相色譜法。
[0008] 進一步地，所述酶促反應(yīng)的酶包括源于枯草芽孢桿菌和米曲霉的α -淀粉酶、糖 化酶、蔗糖酶和己糖激酶。
[0009] 進一步地，所述標準曲線的制作過程中，酶促反應(yīng)中酶與底物完全反應(yīng)。
[0010] 在上述技術(shù)方案中，對于溫度和PH酶促反應(yīng)條件，以反應(yīng)液中氨基酸響應(yīng)最大為 基準。根據(jù)選定的氨基酸檢測方法不同，對于同一種酶，確定的酶促反應(yīng)條件可能是不同 的。例如，采用檢測氨基酸的茚三酮法應(yīng)用于本發(fā)明中時，由于α-氨基酸與茚三酮顯色反 應(yīng)的最佳pH為5-7,而此pH值不一定是酶的最適pH，而氨基酸的脫落可能由于酶分子電荷 失衡導(dǎo)致的，體系的PH對酶的分子電荷可能有影響，因此反應(yīng)的pH值還會影響氨基酸的脫 落，綜合以上各個影響因素，為了利用反應(yīng)后的溶液直接用于茚三酮顯色反應(yīng)，也為了避免 對反應(yīng)液的后處理會引起的測定誤差，確定的酶促反應(yīng)條件為氨基酸響應(yīng)最大的pH值，其 也更接近于茚三酮顯色反應(yīng)的PH范圍，在此條件下也更能降低所選氨基酸測定方法下檢 測到的底物的最低限，使得檢測更為靈敏。
[0011] 本發(fā)明的有益效果：
[0012] 本發(fā)明通過直接測定酶促反應(yīng)的反應(yīng)液中氨基酸的量，對反應(yīng)底物進行定性和定 量測定，操作簡便、解決了現(xiàn)有技術(shù)中此種檢測步驟繁瑣的弊端，而且采用氨基酸的量直接 對應(yīng)底物的量，檢測靈敏度高。
【附圖說明】
[0013] 圖1.實施例1中不同溫度下茚三酮顯色的OD值；
[0014] 圖2.實施例1中不同pH下茚三酮顯色的OD值；
[0015] 圖3.實施例1中不同蔗糖酶濃度下茚三酮顯色的OD值；
[0016] 圖4.實施例1中0057(|值-蔗糖溶液濃度標準曲線；
[0017] 圖5.實施例2中不同溫度下茚三酮顯色的OD值；
[0018] 圖6.實施例2中不同pH下茚三酮顯色的OD值；
[0019] 圖7.實施例2中不同蔗糖酶濃度下茚三酮顯色的OD值；
[0020]圖8.實施例2中0057(|值-淀粉溶液濃度標準曲線。
【具體實施方式】
[0021] 下述非限制性實施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以 任何方式限制本發(fā)明。
[0022] 實施例1
[0023] 茚三酮法確定蔗糖酶酶促反應(yīng)中的底物濃度
[0024] 第一步、氨基酸響應(yīng)最大的酶促反應(yīng)條件的選擇：
[0025] 1.溫度的選擇：
[0026] 取111〇.02%的蔗糖酶溶液與1.51^8%的蔗糖溶液分別在40°0、45°0、50°〇、 55°〇、60°0、65°0、70°0、75°0下預(yù)熱111^11后，將蔗糖加入到蔗糖酶溶液中反應(yīng)21^11后（反 應(yīng)在pH = 6. 9的0. 02M PBS緩沖體系下進行），反應(yīng)充分后，在每個溫度下的反應(yīng)液中，加 入ImL濃度為5g/L的茚三酮溶液，95°C水浴30min后，取出室溫放置Ih后，在570nm下測 定其吸光值，如圖1所示，根據(jù)圖1的結(jié)果，選擇50°C為酶促反應(yīng)條件。
[0027] 2. pH 的選擇
[0028] 分別配制 pH 為 4· 8、5· 0、5· 5、6· 0、6· 5、7· 0、7· 5、8· 0、8· 5、8· 98 的 8%蔗糖溶液與 0. 02%的蔗糖溶液（試劑均由0. 02M的PBS緩沖液溶解）在50°C反應(yīng)，操作步驟同上，結(jié)果 如圖2所示，選擇pH = 8為酶促反應(yīng)條件。
[0029] 3.酶濃度的選擇：
[0030] 分別配制濃度為0.04%、0.06%、0.08%、0.1%、0.2%、0.3%的蔗糖酶溶液分別 加入I. 5mL0. 25% pH為8的蔗糖溶液，操作步驟同上，結(jié)果如圖3所示，考慮到酶成本、吸光 值增長率等因素可選擇酶濃度在0. 08 %~0. 2 %之間，此實施例中選擇0. 1 %為酶促反應(yīng) 條件。
[0031] 第二步、OD57tl值-反應(yīng)底物濃度標準曲線的制作：
[0032] 將ImLO. 1 %的酶與I. 5mL不同濃度梯度下的底物在50°C、pH = 8的反應(yīng)條件下 預(yù)熱Imin后，將底物加到酶溶液中，反應(yīng)3min后加入ImL濃度為5g/L的茚三酮溶液，95°C 水浴30min，后取出室溫放置Ih后，在570nm下測定其吸光值，做出00 57。值-反應(yīng)底物濃度 標準曲線，結(jié)果如圖4所示。
[0033] 第三步、方法檢出限、精密度以及加標回收率的測定：
[0034] 檢出限實驗：按試驗方法，用相應(yīng)緩沖液代替底物標準液，以酶、茚三酮與緩沖液 混合溶液作參比測定吸光值，平行測定11次，計算空白液的標準偏差，根據(jù)工作曲線斜率， 計算出檢出限C = 3Sb/K = 60 μ g/mL。
[0035] 精密度實驗：吸取3組不同濃度的底物標準液按實驗方法測定吸光度。平行測定 5次，計算變異系數(shù)RSD值在2 % -6 %。
[0036] 加標回收率：分別吸取I. 5mL3個不同濃度的底物標準液按上述試驗方法測定吸 光度，結(jié)果見表1計算加標回收率為96% -101%。
[0037] 4.檢測待測底物濃度：
[0038] 為驗證實驗的準確度，配制已知濃度的蔗糖溶液：配制I. 5mLpH為8濃度為0. 02M 的PBS溶解的0. 06%、0. 07%、0. 08%的蔗糖溶液，與ImL PBS緩沖液溶解的0. 1 %的蔗糖 酶溶液反應(yīng)，茚三酮法測定反應(yīng)液中的氨基酸含量，得到OD57tl，通過圖4得到蔗糖濃度，與 理論濃度對比，三個樣本的測定準確度分別為96. 67%、95. 71 %、101. 25%，如表1所示。說 明此方法的準確性良好。
[0039] 表1待測底物準確度實驗結(jié)果
[0040]
【主權(quán)項】
1. 一種通過檢測反應(yīng)液中氨基酸濃度確定酶促反應(yīng)底物濃度的方法，其特征在于步驟 如下： 針對不同的氨基酸檢測方法，在不同條件下進行酶促反應(yīng)，并測定反應(yīng)溶液中的氨基 酸濃度，分別作出氨基酸濃度-反應(yīng)溫度曲線、氨基酸濃度-反應(yīng)pH曲線和氨基酸濃度-酶 濃度曲線，在氨基酸濃度-反應(yīng)溫度曲線和氨基酸濃度-反應(yīng)pH曲線上，選擇氨基酸濃度 響應(yīng)最大的值，確定酶促反應(yīng)的溫度和pH條件，在氨基酸濃度-酶濃度曲線上，選擇氨基酸 濃度增長率最大的區(qū)間，確定酶濃度條件，在上述確定的溫度、pH和酶濃度條件下作出反應(yīng) 液中氨基酸濃度-初始反應(yīng)底物濃度的標準曲線，取待測濃度的底物溶液，在已確定的溫 度、pH和酶濃度條件下進行酶促反應(yīng)，測定反應(yīng)液中的氨基酸濃度，對應(yīng)所述標準曲線，得 出底物濃度。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過檢測反應(yīng)液中氨基酸濃度確定酶促反應(yīng)底物濃度的方 法，其特征在于：所述氨基酸檢測方法包括茚三酮法、臨苯二甲醛熒光法、氨基酸分析儀、離 子交換色譜法、液相色譜法和氣相色譜法。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過檢測反應(yīng)液中氨基酸濃度確定酶促反應(yīng)底物濃度的方 法，其特征在于：所述酶促反應(yīng)的酶包括源于枯草芽孢桿菌和米曲霉的a-淀粉酶、糖化 酶、蔗糖酶和己糖激酶。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過檢測反應(yīng)液中氨基酸濃度確定酶促反應(yīng)底物濃度的方 法，其特征在于：所述標準曲線的制作過程中，所述酶促反應(yīng)中酶與底物完全反應(yīng)。
【專利摘要】一種通過檢測反應(yīng)液中氨基酸濃度確定酶促反應(yīng)底物濃度的方法，步驟如下：在不同條件下進行酶促反應(yīng)，測定反應(yīng)溶液中的氨基酸濃度，針對一種氨基酸檢測方法，確定酶促反應(yīng)后的溶液中氨基酸響應(yīng)最大的酶促反應(yīng)條件，確定酶促反應(yīng)的溫度、pH和酶濃度條件，在已確定的條件下作出反應(yīng)液中氨基酸濃度-反應(yīng)底物濃度的標準曲線，取待測濃度底物的溶液，在已確定的條件下進行酶促反應(yīng)，測定反應(yīng)液中的氨基酸濃度，對應(yīng)所述標準曲線，得出底物濃度。本發(fā)明通過直接測定酶促反應(yīng)的反應(yīng)液中氨基酸的量，對反應(yīng)底物進行定性和定量測定，操作簡便、解決了現(xiàn)有技術(shù)中此種檢測步驟繁瑣的弊端，而且采用氨基酸的量直接對應(yīng)底物的量，檢測靈敏度高。
【IPC分類】G01N21-31, G01N21-80
【公開號】CN104677905
【申請?zhí)枴緾N201510103433
【發(fā)明人】趙長新, 周彥品, 王金輝, 李瑞龍, 陳瑞華
【申請人】大連工業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年6月3日
【申請日】2015年3月9日