一種缺血修飾白蛋白的定量測(cè)定方法、試劑及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本申請(qǐng)涉及一種人體血清中缺血修飾白蛋白的定量測(cè)定方法、試劑及試劑盒
【背景技術(shù)】
[0002] 缺血修飾白蛋白是在缺血/再灌注發(fā)生時(shí)，由于自由基等破壞了血清白蛋白的氨 基酸序列，而導(dǎo)致白蛋白與過(guò)渡金屬的結(jié)合能力改變，這種因缺血而發(fā)生與過(guò)渡金屬結(jié)合 能力改變的白蛋白。
[0003] 缺血修飾白蛋白能更早發(fā)現(xiàn)急性心肌缺血，是檢測(cè)早期心肌缺血的敏感指標(biāo)，也 是急性冠脈綜合征診斷的生物標(biāo)志，對(duì)腦出血初期、急性冠脈綜合征也有指示作用。
[0004] 目前測(cè)定缺血修飾白蛋白的方法包括比色測(cè)定法、液相色譜法、質(zhì)譜測(cè)定法以及 核磁共振法等。這些方法具有操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、價(jià)格昂貴、過(guò)度浪費(fèi)資源的缺點(diǎn)，不適于常 規(guī)檢驗(yàn)，尤其是大規(guī)模流行病學(xué)檢查或臨床大批量標(biāo)本諸多項(xiàng)目的同時(shí)檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本申請(qǐng)的目的是提供一種能夠應(yīng)用于大規(guī)模臨床試驗(yàn)的人體血清中缺血修飾白 蛋白的定量測(cè)定方法、試劑及試劑盒。
[0006] 本申請(qǐng)采用了以下技術(shù)方案：
[0007] 本申請(qǐng)的一方面公開(kāi)了一種定量測(cè)定人體血清中缺血修飾白蛋白含量的試劑，該 試劑由分別放置的試劑I和試劑II組成，其中，所述試劑I含有磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、 氯化鈷；所述試劑II含有磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、二硫基蘇糖醇。
[0008] 進(jìn)一步的，所述試劑I中磷酸二氫鈉含量為30-100mmol/L，磷酸氫二鈉含量為 30_100mmol/L，氯化鈷的濃度為 5_50mmol/L。
[0009] 進(jìn)一步的，所述試劑I中磷酸二氫鈉含量為80mmol/L，磷酸氫二鈉含量為80mmol/ L，氯化鈷的濃度為12mmol/L。
[0010] 進(jìn)一步的，所述試劑II中磷酸二氫鈉含量為30-100mmol/L，磷酸氫二鈉含量為 30-100mmol/L，二硫基蘇糖醇含量為 6-12mmol/L。
[0011] 進(jìn)一步的，所述試劑II中磷酸二氫鈉含量為80mmol/L，磷酸氫二鈉含量為 80mmol/L，二硫基蘇糖醇含量為10mmol/L。
[0012] 本申請(qǐng)的另一方面提供一種定量測(cè)定人體血清中缺血修飾白蛋白含量的試劑盒， 其中裝有上述定量測(cè)定人體血清中缺血修飾白蛋白含量的試劑，該試劑由分別放置的試劑 I及試劑II組成。
[0013] 本申請(qǐng)的另一方面提供一種定量測(cè)定人體血清中缺血修飾白蛋白含量的方法，該 方法包括向血清樣品中加入所述試劑I，37°c孵育5分鐘，在一定的波長(zhǎng)下測(cè)定樣品吸光度 Al ;然后向樣品中加入試劑II，繼續(xù)孵育5分鐘后在上述波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度A2,由下式（1) 計(jì)算ΛΑ樣本；用同樣的方法測(cè)定校準(zhǔn)液的吸光度值ΛΑ標(biāo)準(zhǔn)；再通過(guò)下式（2)計(jì)算得到血 清樣品的缺血修飾白蛋白含量：
[0014] Δ A = Α2-Α1 (I)
[0015] 血清中缺血修飾白蛋白含量（U/mL) = (ΛΑ空白-ΛΑ樣本V(AA空白-ΛΑ 標(biāo)準(zhǔn)）X標(biāo)準(zhǔn)液濃度（2)
[0016] 本方法的原理為：將血清中白蛋白與CO2+結(jié)合后剩余的有力CO2+與有機(jī)顯色物反 應(yīng)生成紅褐色產(chǎn)物，在510nm的波長(zhǎng)下比色，其吸光度與CO 2+濃度成正比，與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比 較，可計(jì)算出樣本中白蛋白-鈷的值。通過(guò)白蛋白-鈷的值可計(jì)算缺血修飾白蛋白的含量。
[0017] 本發(fā)明直接定量測(cè)定人血清樣品中缺血修飾白蛋白含量的試劑盒，是將分別放置 的上述試劑I和試劑II以不同的規(guī)格裝入試劑盒包裝中。該試劑盒具有多種不同的規(guī)格， 可以分別適用于目前在臨床實(shí)驗(yàn)室普遍使用的各種國(guó)內(nèi)外品牌的自動(dòng)生化分析儀器。
[0018] 本發(fā)明采用的試劑盒及檢測(cè)方法只需幾十微升血清，無(wú)需離心或電泳等分離處 理，操作簡(jiǎn)便，可滿足全自動(dòng)化分析的要求，適用于大規(guī)模樣品的及時(shí)準(zhǔn)確檢測(cè)。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 實(shí)施例一
[0020] 按照下述成分和比例配置下述本發(fā)明試劑I及試劑II :
[0021] 試劑 I:
[0022] 磷酸二氫鈉 80mmol/L
[0023] 磷酸氫二鈉 80mmol/L
[0024] 氯化鈷 12mmol/L
[0025] 試劑 II :
[0026] 磷酸二氫鈉 80mmol/L
[0027] 磷酸氫二鈉 80mmol/L
[0028] 二硫基蘇糖醇 10mmol/L
[0029] 在樣品管中將200 μ 1試劑I和30 μ 1血清樣品混合，在37 °C下孵育5分鐘，使用 日立7180型全自動(dòng)生化分析儀，在主波長(zhǎng)510nm，副波長(zhǎng)700nm處測(cè)定吸光度Al，然后向樣 品中加入100 μ 1試劑II，混勻，在37°C下孵育5分鐘，測(cè)定相同波長(zhǎng)下的吸光度A2。根據(jù) 如下公式（1)計(jì)算Λ A樣本。用同樣的方法和條件測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度值，并計(jì)算Λ A標(biāo) 準(zhǔn)。然后根據(jù)公式（2)計(jì)算得到血清樣品的缺血修飾白蛋白含量：
[0030] AA = Α2-Α1 (1)
[0031] 血清中缺血修飾白蛋白含量（U/mL) = (ΛΑ空白-ΛΑ樣本V(AA空白-ΛΑ 標(biāo)準(zhǔn)）X標(biāo)準(zhǔn)液濃度 （2)
[0032] 本申請(qǐng)所用標(biāo)準(zhǔn)品為伯樂(lè)標(biāo)準(zhǔn)品。
[0033] 實(shí)施例二
[0034] 按照下述成分和比例配置下述本發(fā)明試劑I及試劑II :
[0035] 試劑 I:
[0036] 磷酸二氫鈉 30mmol/L
[0037] 磷酸氫二鈉 30mmol/L
[0038] 氯化鈷 5mmol/L
[0039] 試劑 II :
[0040] 磷酸二氫鈉 30mmol/L
[0041] 磷酸氫二鈉 30mmol/L
[0042] 二硫基蘇糖醇5mmol/L
[0043] 在樣品管中將200 μ 1試劑I和30 μ 1血清樣品混合，在37 °C下孵育5分鐘，使用 雅培C16000型全自動(dòng)生化分析儀，在主波長(zhǎng)510nm，副波長(zhǎng)700nm處測(cè)定吸光度Al，然后向 樣品中加入IOOy 1試劑II，混勻，在37°C下孵育5分鐘，測(cè)定相同波長(zhǎng)下的吸光度A2。根 據(jù)如下公式（1)計(jì)算Λ A樣本。用同樣的方法和條件測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度值，并計(jì)算Λ A 標(biāo)準(zhǔn)。然后根據(jù)公式（2)計(jì)算得到血清樣品的缺血修飾白蛋白含量：
[0044] AA = Α2-Α1 (1)
[0045] 血清中缺血修飾白蛋白含量（U/mL) = (ΛΑ空白-ΛΑ樣本V(AA空白-ΛΑ 標(biāo)準(zhǔn)）X標(biāo)準(zhǔn)液濃度 （2)
[0046] 實(shí)施例三
[0047] 按照下述成分和比例配置下述本發(fā)明試劑I及試劑II :
[0048] 試劑 I:
[0049] 磷酸二氫鈉 IOOmmol/L
[0050] 磷酸氫二鈉 lOOmmol/L
[0051] 氯化鈷 50mmo I /T,
[0052] 試劑 II :
[0053] 磷酸二氫鈉 IOOmmol/L
[0054] 磷酸氫二鈉 lOOmmol/L
[0055] 二硫基蘇糖醇30mmol/L
[0056] 在樣品管中將200 μ 1試劑I和30 μ 1血清樣品混合，在37 °C下孵育5分鐘，使用 奧林帕斯AU400型全自動(dòng)生化分析儀，在主波長(zhǎng)510nm，副波長(zhǎng)700nm處測(cè)定吸光度Al,然 后向樣品中加入100 μ 1試劑Π，混勻，在37°C下孵育5分鐘，測(cè)定相同波長(zhǎng)下的吸光度A2。 根據(jù)如下公式（1)計(jì)算Λ A樣本。用同樣的方法和條件測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度值，并計(jì)算Λ A 標(biāo)準(zhǔn)。然后根據(jù)公式（2)計(jì)算得到血清樣品的缺血修飾白蛋白含量：
[0057] AA = Α2-Α1 (1)
[0058] 血清中缺血修飾白蛋白含量（U/mL) = (ΛΑ空白-ΛΑ樣本V(AA空白-ΛΑ 標(biāo)準(zhǔn)）X標(biāo)準(zhǔn)液濃度（2)
[0059] 實(shí)施例四
[0060] 使用本實(shí)施例1中所列的試劑,按照實(shí)施例1所述的方法和條件對(duì)100例血清樣 品的血清中缺血修飾白蛋白含量進(jìn)行測(cè)定，每份血清樣品同時(shí)以市售血清中缺血修飾白蛋 白含量測(cè)定試劑盒（濰坊三維生物工程集團(tuán)有限公司）進(jìn)行對(duì)照性測(cè)定。
[0061] I、SPSS定量統(tǒng)計(jì)分析
[0062] I. 1統(tǒng)計(jì)描述
[0063]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種定量測(cè)定人體血清中缺血修飾白蛋白含量的試劑，該試劑由分別放置的試劑I 和試劑II組成，其中，所述試劑I含有磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈷；所述試劑II含有 磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、二硫基蘇糖醇。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑，其特征在于，所述試劑I中磷酸二氫鈉含量為 30-100mmol/L，磷酸氫二鈉含量為30-100mmol/L，氯化鈷的濃度為5-50mmol/L。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑，其特征在于，所述試劑I中磷酸二氫鈉含量為SOmmol/ L，磷酸氫二鈉含量為80mmol/L，氯化鈷的濃度為12mmol/L。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑，其特征在于，所述試劑II中磷酸二氫鈉含量為 30-100mmol/L，磷酸氫二鈉含量為30-100mmol/L，二硫基蘇糖醇含量為6-12mmol/L。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑，其特征在于，所述試劑II中磷酸二氫鈉含量為 80mmol/L，磷酸氫二鈉含量為80mmol/L，二硫基蘇糖醇含量為10mmol/L。
6. -種定量測(cè)定人體血清中缺血修飾白蛋白含量的試劑盒，其特征在于，其中裝有權(quán) 利要求1至5中任一所述的定量測(cè)定人體血清中缺血修飾白蛋白含量的試劑，該試劑由分 別放置的試劑I及試劑II組成。
7. -種定量測(cè)定人體血清中缺血修飾白蛋白含量的方法，該方法包括向血清樣品中加 入所述試劑I，37°C孵育5分鐘，在一定的波長(zhǎng)下測(cè)定樣品吸光度A1 ;然后向樣品中加入試 劑II，繼續(xù)孵育5分鐘后在上述波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度A2,由下式（1)計(jì)算A A樣本；用同樣的 方法測(cè)定校準(zhǔn)液的吸光度值A(chǔ) A標(biāo)準(zhǔn)；再通過(guò)下式（2)計(jì)算得到血清樣品的缺血修飾白蛋 白含量： A A = A2-A1 (1) 血清中缺血修飾白蛋白含量卬/11^)=(厶六空白-厶六樣本）八厶六空白-厶八標(biāo) 準(zhǔn)）X標(biāo)準(zhǔn)液濃度 （2)。
【專利摘要】本申請(qǐng)涉及一種定量測(cè)定人體血清中缺血修飾白蛋白含量的試劑，該試劑由分別放置的試劑I和試劑II組成，其中所述試劑I含有磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈷；所述試劑II含有磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、二硫基蘇糖醇。本發(fā)明采用的試劑盒及檢測(cè)方法只需幾十微升血清，無(wú)需離心或電泳等分離處理，操作簡(jiǎn)便，可滿足全自動(dòng)化分析的要求，適用于大規(guī)模樣品的及時(shí)準(zhǔn)確檢測(cè)。
【IPC分類】G01N21-31, G01N21-78
【公開(kāi)號(hào)】CN104677898
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510070171
【發(fā)明人】梁朝陽(yáng)
【申請(qǐng)人】浙江凱成生物科技有限公司
【公開(kāi)日】2015年6月3日
【申請(qǐng)日】2015年2月10日