本發(fā)明涉及質(zhì)控檢測領(lǐng)域，具體地涉及蛋白類藥物中唾液酸的檢測方法。
背景技術(shù)：
：唾液酸(SA)是一類神經(jīng)氨酸的衍生物，一個含有9個碳原子并具有吡喃糖結(jié)構(gòu)的酸性氨基糖，系統(tǒng)命名為5-氨基-3,5二脫氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖。根據(jù)5號碳上不同的連接基團，構(gòu)成了不同的唾液酸衍生物。最主要的兩種唾液酸為5-乙酰氨基-3,5-二脫氧-D-半乳壬酮糖(NANA，Neu5Ac，N-乙酰神經(jīng)氨酸)和3-脫氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖(KDN)，其余的唾液酸均是由這兩種衍生而成。而N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(NGNA)是NANA的乙?；恢蒙习l(fā)生了羥基化而得到的。NGNA和NANA通常以低聚糖，糖脂或者糖蛋白的形式存在。唾液酸修飾與蛋白類藥物的安全性及有效性息息相關(guān)，對唾液酸進行準確定量監(jiān)測既能監(jiān)控生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性，同時又利于藥物的質(zhì)量控制。目前唾液酸檢測方法主要分為兩類，第一種參考藥典方法，取適量蛋白樣品，加入一定濃度的硫酸或其他酸性試劑，高溫條件下將唾液酸水解，之后離心取上清采用陰離子交換色譜柱進行分離紫外檢測，進行定量。這種方法靈敏度較低，對于目前的藥物蛋白具有很大的局限性，僅能對一些唾液酸含量高的融合蛋白進行檢測。對于唾液酸含量較少的蛋白無法準確定量，尤其對于占據(jù)生物藥市場半壁江山的抗體類藥物無法采用該方法進行唾液酸準確定量。第二種方法為采用DMB(4,5-亞甲二氧基-1,2-苯二胺二鹽酸鹽)熒光標記，采用反相色譜柱，流動相選擇ACN/MeOH/H2O9/7/84等度分離，之后激發(fā)波長373nm，發(fā)射波長448nm檢測外標定量。然而，該方法不僅成本高，而且存在以下缺點：1)處理后的樣品含有干擾物質(zhì)(如無法徹底去除蛋白)，會顯著縮短色譜柱的壽命；(2)即使采用離心方式也無法充分去除蛋白，而采用溶劑處理，則會在色譜分離時產(chǎn)生溶劑效應；(3)每次樣品分析后需要較長時間的色譜柱沖洗；(4)標記試劑與雜質(zhì)峰可能會影響唾液酸分離及鑒定，標準品保留時間會發(fā)生漂移，重現(xiàn)性不好，方法的耐受性較差。綜上所述，本領(lǐng)域尚缺乏令人滿意的高準確性和高靈敏度的對蛋白類藥物中唾液酸進行檢測的方法。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的、高準確性和高靈敏度的對蛋白類藥物中唾液酸進行檢測的方法。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種高準確性和高靈敏度的對蛋白類藥物中唾液酸進行檢測的方法。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種對蛋白的唾液酸含量進行檢測的方法，包括步驟：(1)提供一待分析樣品，其中含有待分析蛋白；(2)對步驟(1)中的樣品進行酸水解，得到酸水解產(chǎn)物；(3)對(2)中所述的酸水解產(chǎn)物用標記試劑進行標記，獲得經(jīng)標記的混合物；(4)用有機溶劑對所述經(jīng)標記的混合物進行色譜預處理，獲得預處理的混合物；(5)將所述預處理的混合物上樣于親水相互作用色譜柱，進行色譜分離，獲得含標記的唾液酸的洗脫液；(6)對所述的洗脫液進行檢測，從而獲得所述蛋白的唾液酸含量的測定結(jié)果。在另一優(yōu)選例中，所述方法的唾液酸檢測信噪比大于3(如3-500，較佳地3-200，更佳地4-50，較佳地5-20)。在另一優(yōu)選例中，所述步驟(6)中，包括對將樣品的檢測結(jié)果與標準曲線或標準品進行比較，從而獲得所述蛋白的唾液酸含量的測定結(jié)果。在另一優(yōu)選例中，所述的樣品體積≥25微升，如25-2000微升，較佳地50-1500微升。在另一優(yōu)選例中，所述的樣品中，蛋白量含量≥50μg，優(yōu)選500μg。在另一優(yōu)選例中，所述方法的檢測靈敏度達到10pmol或更低。在另一優(yōu)選例中，對于10pmol的樣品，唾液酸檢測信噪比大于3。在另一優(yōu)選例中，所述方法中，步驟(2)之后，步驟(3)之前還包括瞬離步驟。在另一優(yōu)選例中，所述方法中，步驟(4)之后，步驟(5)之前還包括振蕩混勻步驟。在另一優(yōu)選例中，所述方法中，步驟(4)之后，步驟(5)之前還包括離心步驟。在另一優(yōu)選例中，所述方法中，所述離心步驟為5000-20000rpm離心1-15分鐘，如13000r/min離心5分鐘。在另一優(yōu)選例中，步驟(2)中所述酸水解所用酸選自下組：乙酸、三氟乙酸、硫酸、鹽酸、甲酸、三氯乙酸、磷酸、硝酸。在另一優(yōu)選例中，所述方法中，步驟(2)中所述酸水解中，所用酸的終濃度為1-3M，較佳地為2M。在另一優(yōu)選例中，所述方法中，步驟(2)中酸水解的反應條件為65-85℃反應1-4小時，較佳地為70-80℃反應1.5-3小時，更佳地為70-80℃反應2小時，又更佳地為80℃反應2小時。在另一優(yōu)選例中，所述方法中，步驟(3)中標記的反應條件為40-60℃避光反應1-3小時，較佳地為40-60℃避光反應1.5-2.5小時，更佳地在約50±2℃避光反應2±0.5小時，又更佳地在50℃避光反應2小時。在另一優(yōu)選例中，所述待分析蛋白為抗體蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述待分析蛋白為單抗蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述待分析蛋白為融合蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述標記試劑選自：4,5-亞甲二氧基-1,2-苯二胺二鹽酸鹽(DMB)，或具有式I結(jié)構(gòu)的標記化合物：式中，化合物1，X＝O，R＝CH3；化合物2，X＝O，R＝化合物3，X＝NH，R＝H；化合物4，X＝NH，R＝CH3；化合物5，X＝NH，R＝化合物6，X＝NH，R＝在另一優(yōu)選例中，所述有機溶劑選自下組：乙腈、甲醇、乙醇、DMSO、異丙醇、或其組合。在另一優(yōu)選例中，所述有機溶劑(預處理劑)選自下組：乙腈、含乙腈的混合溶劑。在另一優(yōu)選例中，在預處理步驟中，有機溶劑(預處理劑)的用量為60％-95％(終濃度)，較佳地為80％，按預處理混合物的總體積計。在另一優(yōu)選例中，所述分析方法不包括脫鹽步驟。在另一優(yōu)選例中，所述的方法為產(chǎn)品質(zhì)量控制方法。在另一優(yōu)選例中，所述的方法為特性研究方法。在另一優(yōu)選例中，所述的方法為非診斷性和非治療性的方法。在另一優(yōu)選例中，所述色譜柱為BEHamide柱。在另一優(yōu)選例中，所述BEHamide柱為聚糖BEHamide柱，例如WatersGlycanBEHAmide柱。在另一優(yōu)選例中，所述色譜分析的參數(shù)流速為0.1-0.8ml/min，較佳地為0.2-0.6ml/min，更佳地為0.4ml/min。在另一優(yōu)選例中，所述色譜分析的參數(shù)檢測波長為ex＝373nmem＝448nm。在另一優(yōu)選例中，所述色譜分析的參數(shù)運行時間為8-20分鐘，較佳地為12分鐘。在另一優(yōu)選例中，所述色譜分析的參數(shù)進樣量為0.2-15μl，較佳地為5μl。在另一優(yōu)選例中，所述色譜分析的參數(shù)進樣盤溫度為10℃以下，較佳地為4℃。在另一優(yōu)選例中，所述色譜分析的流動相包含水相和有機溶劑。在另一優(yōu)選例中，所述水相中添加有緩沖鹽。在另一優(yōu)選例中，所述水相的起始比例不高于40％，最佳地為15％。在另一優(yōu)選例中，所述色譜分析的流動相中的有機溶劑選自：甲醇、乙醇、丙醇、乙腈、或其組合。在另一優(yōu)選例中，所述色譜分析的流動相為水和乙腈。在另一優(yōu)選例中，所述色譜分析的流動相為水和甲醇。在另一優(yōu)選例中，所述色譜分析的流動相為水和乙醇。在另一優(yōu)選例中，所述色譜分析的流動相為水和丙醇。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種試劑盒，所述試劑盒包括：(1)酸水解試劑；(2)標記試劑；(3)任選的標準品和/或標準曲線，所述標準品選自NGNA、NANA或其組合；和(4)描述利用(1)所述酸水解試劑進行酸水解和利用(2)所述標記試劑進行唾液酸標記的使用說明書。應理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附圖說明圖1為唾液酸DMB標記反應原理。圖2顯示了BEHAmide色譜柱分離的效果以及本發(fā)明方法專屬性圖譜。圖3顯示了GlycanBEHAmide梯度優(yōu)化后進樣精密度。圖4顯示了本發(fā)明方法檢測標準品具有較寬的線性范圍，其中圖4A顯示了NANA線性，圖4B顯示了NGNA線性。圖5顯示了本發(fā)明方法檢測限及定量限圖譜。圖6顯示了唾液酸標準品與進樣量線性，其中圖6A顯示了NANA進樣量線性，圖6B顯示了NGNA進樣量線性。圖7顯示了唾液酸標準品不同進樣量圖譜。圖8顯示了蛋白處理量(μg)與唾液酸檢測峰面積線性圖。圖9顯示了不同處理量下的唾液酸檢測圖譜。圖10顯示了準確度實驗圖譜。圖11顯示了本發(fā)明方法重復性圖譜。具體實施方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，優(yōu)化了樣品處理流程及色譜分離方法，首次意外地發(fā)現(xiàn)，唾液酸DMB標記后的親水相互作用色譜分離模式(HILIC)，色譜條件簡單，重現(xiàn)性好，對蛋白藥物中主要的兩種唾液酸(NANA及NGNA)具有較好的分離效果；本發(fā)明人優(yōu)化了蛋白樣品的處理方式，酸解及標記結(jié)束后加入有機溶劑能有效去除樣品中的蛋白，同時能夠避免溶劑效應，并且專屬性及重現(xiàn)性良好，耐受性較強，靈敏度高，10pmol的唾液酸檢測信噪比遠大于3；標準品的處理與樣品同步進行，定量準確度高。此外，采用本發(fā)明，不僅可顯著提高檢測的效率及準確性，還使得每個樣品的檢測成本大幅下降。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。本發(fā)明方法可以對目前的所有蛋白類藥物包括唾液酸含量較少的單抗藥物進行唾液酸準確定量分析，為藥物的構(gòu)效關(guān)系研究及質(zhì)量控制提供依據(jù)。術(shù)語本發(fā)明中提及的縮略詞與全稱見下表1。表1.縮略詞與全稱唾液酸含量的檢測方法本發(fā)明提供了一種唾液酸含量的檢測方法。它包括：(a)提供樣品：(b)酸解；(c)標記：(d)預處理；(e)色譜分析：上樣于親水相互作用色譜柱，進行色譜分離，獲得含標記的唾液酸的洗脫液；(f)對所述的洗脫液進行檢測，從而獲得所述蛋白的唾液酸含量的測定結(jié)果。生物體內(nèi)唾液酸種類豐富繁多，但蛋白藥物根據(jù)不同的宿主細胞，主要為NANA及NGNA，而CHO細胞系表達的蛋白中，唾液酸修飾以NANA為主，本發(fā)明采用DMB試劑對酸解釋放的唾液酸進行標記反應，之后采用FLD-HILIC-UHPLC方法對蛋白中的NANA及NGNA進行外標一點法定量檢測。其他類型的唾液酸也可在此基礎(chǔ)上進行檢測定量。在本發(fā)明中，采用酸(如乙酸)將糖蛋白中NGNA和NANA水解下來，并采用DMB進行熒光標記(反應機理如圖1所示)，并經(jīng)特殊處理后用親水色譜分離進行分離(如通過FLD-UHPLC)，從而準確地獲得NGNA和NANA的定量分析結(jié)果。典型地，本發(fā)明的檢測方法包括以下步驟：取適量蛋白，酸解一段時間(如約1-6小時，如2小時)，接著采用DMB等標記物進行標記(如0.5-6小時)；之后對標記產(chǎn)物進行特定的預處理(如加入乙腈沉淀蛋白，并取上清)，然后進行親水相互作用色譜分析。一個典型的本發(fā)明方法包括：(a)提供樣品：如下配置蛋白樣品溶液：取蛋白500μg，加水至25μl；(b)酸解：加入25μl4M乙酸，80℃反應2小時，每隔30分鐘，瞬離一次；(c)標記：上一反應結(jié)束后，再加入已分裝的DMB標記試劑50μl，50℃避光反應2小時；(d)預處理：上一反應結(jié)束后，加入400μl乙腈，充分渦旋振蕩混勻，13000r/min離心5分鐘，取上清；(e)色譜分析：上樣于親水相互作用色譜柱，進行色譜分離，獲得含標記的唾液酸的洗脫液；(f)對所述的洗脫液進行檢測，從而獲得所述蛋白的唾液酸含量的測定結(jié)果。預處理在本發(fā)明的預處理步驟中，優(yōu)選的(預)處理劑包括乙腈或含乙腈的混合溶劑，特別優(yōu)選的是乙腈。在本發(fā)明中，所述的含乙腈的混合溶劑指乙腈與其他溶劑構(gòu)成的混合溶劑，所述其他溶劑選自下組：甲醇、乙醇、DMSO、異丙醇、或其組合。在混合溶劑中，乙腈的含量通?！?0％，較佳地≥50％，更佳地≥70％或90％，按混合溶劑的總體積計。在本發(fā)明中，在預處理步驟中，預處理劑(如乙腈)的添加量應能夠使得預被處理的混合液中的蛋白能夠基本上(通常≥80％，較佳地≥90％，更佳地≥95％)發(fā)生沉淀或析出，而經(jīng)標記的NGNA和NANA基本上(通?！?0％，較佳地≥90％，更佳地≥95％)仍保留在溶液中。典型地，在所述的預處理混合物中，預處理劑(如乙腈)的用量(終濃度)應不低于60％，如60％-95％(終濃度)，較佳地為80％，按預處理混合物的總體積計。在本發(fā)明中，所述的預處理時間沒有特別限制，通常為2-120分鐘，較佳地5-30分鐘。在本發(fā)明中，所述的預處理的溫度沒有特別限制，通常為室溫，如4-35℃，或15-25℃。本發(fā)明的研究表明，在預處理步驟，優(yōu)選的處理劑為乙腈或含乙腈的混合溶劑，特別優(yōu)選的是乙腈。若不加乙腈，無法有效沉淀去除蛋白。此外，采用乙腈作為處理劑時，可在親水色譜時有效避免出現(xiàn)溶劑效應。色譜檢測本發(fā)明方法的一個特征是對經(jīng)預處理的樣品進行親水相互作用色譜分析。在本發(fā)明中，可以采用市售的或常規(guī)方法制備的親水相互作用色譜柱進行親水色譜分析檢測。代表性的例子包括(但并不限于)：BEHamide柱，聚糖BEH柱等。一些典型的市售的BEHamide柱包括聚糖BEHamide柱，例如WatersGlycanBEHAmide柱。在本發(fā)明中，可按親水相互作用色譜相應的洗脫條件或廠商建議的條件下進行色譜分離。優(yōu)選地，可采用乙腈與水的梯度洗脫液進行洗脫。唾液酸含量檢測試劑盒本發(fā)明還提供了一種唾液酸含量檢測試劑盒。通常，本發(fā)明試劑盒包括：(1)酸水解試劑；(2)標記試劑；(3)任選的標準品和/或標準曲線，所述標準品選自NGNA、NANA或其組合；和(4)描述利用(1)所述酸水解試劑進行酸水解和利用(2)所述標記試劑進行唾液酸標記的使用說明書。本發(fā)明的主要優(yōu)點包括：(1)本發(fā)明方法色譜條件簡單，重現(xiàn)性好，對蛋白藥物中主要的兩種唾液酸(NANA及NGNA)具有較好的分離效果；(2)本發(fā)明方法酸解及標記結(jié)束后加入有機溶劑能有效去除樣品中的蛋白，同時能夠避免溶劑效應；(3)本發(fā)明方法準確可靠、專屬性及重現(xiàn)性良好、(具有較好的穩(wěn)定性、耐受性較強)、靈敏度較高，10pmol的唾液酸檢測信噪比遠大于3；(4)唾液酸標準品與蛋白樣品同步處理，定量準確度高，方法加標回收率較高；(5)本發(fā)明方法對蛋白樣品和唾液酸標準品同步進行酸解和標記處理，提高了方法的準確性；(6)檢測成本低，按每個樣品的檢測成本不高于人民幣20元。下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆：實驗室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。材料和通用方法1試劑本發(fā)明中用到的試劑信息如下表2所示。表2試劑信息2.材料、實驗樣品與儀器設(shè)備本發(fā)明中用到的材料、實驗樣品和儀器設(shè)備信息分別見下表3-5。表3材料信息表4樣品信息表5儀器設(shè)備信息2.通用方法樣品處理酸解-標記-預處理-親水色譜取蛋白樣品500μg，加水至25μl，之后加入25μl4M乙酸混勻，80℃反應2小時，再加入已分裝的標記試劑50μl，50℃避光反應2小時，反應結(jié)束后加入400μl乙腈，混勻后13000r/min離心5分鐘，取上清色譜分析。標準品溶液配制標準品溶液配制處理如下：取已分裝的1μmolNANA及NGNA，于同一離心管，加入980μl超純水混勻得到1nmol/ml。混標樣品作為標準品溶液1。取100μl標準品溶液1，加入900μl超純水，得到0.1μmol/ml的NANA及NGNA的混標樣品，作為標準品溶液2。取10μl標準品溶液2(1nmol)，加入15μl超純水，加入25μl4M乙酸，80℃酸解2小時，反應結(jié)束后加入已分裝的DMB標記試劑50μl，50℃避光反應2小時，之后，加入400μl乙腈終止反應，13000r/min離心5分鐘，取上清色譜分析。空白處理取25μl超純水,分別加入25μl4M乙酸，80℃酸解2小時，反應結(jié)束后加入已分裝的DMB標記試劑50μl，50℃避光反應2小時，之后，加入400μl乙腈終止反應，13000r/min離心5分鐘，取上清色譜分析。色譜檢測色譜柱WatersGlycanBEHAmide；流速0.4ml/min；檢測波長ex＝373nm,em＝448nm；運行時間12分鐘；進樣量5μl。進樣盤溫度設(shè)置4℃。洗脫梯度如表2所示。判斷標準NANA及NGNA具有較好的分離度，出峰位置無明顯干擾，且具有高穩(wěn)定性。實施例1親水色譜柱分離的效果及專屬性考察取蛋白樣品500μg，加水至25μl，之后加入25μl4M乙酸混勻，80℃反應2小時，再加入已分裝的標記試劑50μl，50℃避光反應2小時，反應結(jié)束后加入400μl乙腈，混勻后13000r/min離心5分鐘，取上清色譜分析。色譜參數(shù)為：色譜柱WatersGlycanBEHAmide；流速0.4ml/min；檢測波長ex＝373nm,em＝448nm；運行時間12分鐘；進樣量5μl。進樣盤溫度設(shè)置4℃。洗脫液為乙腈/水的梯度洗脫液(85/15)。色譜分析洗脫梯度如表6.表6BEHamide的洗脫梯度時間流速ACN(％)H2O(％)0.00.485154.50.485154.60.440606.00.440606.10.4851512.00.48515WatersGlycanBEHAmide色譜柱分離的效果如圖2所示。結(jié)果表明，相比反相色譜分離模式，采用HILIC模式對于唾液酸的分離具有明顯的優(yōu)勢，空白溶液在NANA及NGNA出峰位置無明顯干擾，兩者的分離度大于4。專屬性考察結(jié)果如圖2所示?？瞻兹芤褐?，NANA及NGNA出峰位置無顯著干擾，IBI301a20150601WR，IBI303c20130301及IBI305e20130902三批不同項目蛋白樣品在NANA及NGNA出峰位置附近無其他明顯干擾峰，表明本發(fā)明的專屬性非常好。實施例2進樣精密度實驗重復實施例1，制備1nmol的唾液酸標準品，連續(xù)進樣6次，考察峰面積及保留時間的穩(wěn)定性。實驗結(jié)果表明，連續(xù)進樣6次實驗的保留時間基本相同。進樣精密度實驗結(jié)果如表7所示。表7進樣精密度結(jié)果次數(shù)NANARTNANA面積NGNARTNGNA面積13.003962133.7041097223.003906133.7040743533.003932923.7141056043.003912163.7040697853.003865823.7040206563.003895683.70404223平均值3.003912473.70407039RSD(％)0.00.80.10.9實驗結(jié)果表明，連續(xù)六次進樣的NANA及NGNA的峰面積及相對保留時間非常穩(wěn)定(RSD均不大于1.0％)。進樣精密度結(jié)果如圖3所示，NANA及NGNA保留時間非常穩(wěn)定，表明色譜梯度較佳。實施例3唾液酸標準品線性考察唾液酸標準品處理取已分裝的1μmolNANA及NGNA，各取10μl于同一離心管，加入980μl超純水混勻得到1μmol/ml混標樣品作為標準品儲備1，取100μl儲備1加入900超純水得到0.1μmol/ml的NANA及NGNA的混標樣品作為標準品儲備2，取100μl儲備2加入900超純水得到0.01μmol/ml的NANA及NGNA的混標樣品作為標準品儲備3，按照表8制備不同摩爾量的標準品溶液，80℃酸解2小時，反應結(jié)束后加入已分裝的標記試劑50μl,50℃避光反應2小時，之后加入400μl乙腈終止反應，13000r/min離心5分鐘取上清色譜分析。表8標準品線性樣品制備色譜檢測色譜柱WatersGlycanBEHAmide；流速0.4ml/min；檢測波長ex＝373nmem＝448nm；運行時間12分鐘；進樣量5μl。進樣盤溫度設(shè)置4℃。標準品線性實驗結(jié)果如表9和圖4所示。其中圖4A顯示了NANA線性，圖4B顯示了NGNA線性。表9標準品線性檢測結(jié)果結(jié)果表明，唾液酸標準品處理量在0.01nmol～10nmol的范圍內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)r均大于0.999，表明該方法檢測標準品具有較寬的線性范圍。實施例4檢測限及定量限考察重復實施例3，采用線性梯度的標準品，進行檢測限及定量限考察。結(jié)果如圖5所示。NANA及NGNA出峰位置無顯著干擾，再次提示，本發(fā)明方法的專屬性非常好。根據(jù)線性的實驗結(jié)果，唾液酸標準品0.01nmol為線性最低量(下限)，且信噪比大于3，確定為該方法的檢測限。唾液酸標準品0.03nmol的信噪比大于10，確定為該方法的優(yōu)選的定量限。實施例5進樣量線性考察重復實施例3，制備1nmol的唾液酸標準品，考察不同進樣量與峰面積的線性關(guān)系。實驗結(jié)果如表10和圖6所示。表10唾液酸標準品不同進樣量考察結(jié)果進樣量(μl)NANA面積NGNA面積0.2520460211510.53663837533176924801075389401406572107787018140521511624981217060相關(guān)系數(shù)r1.00001.0000結(jié)果表明，進樣量從0.25μl到15μl范圍內(nèi)，NANA及NGNA的峰面積均呈線性增加，相關(guān)系數(shù)r均大于0.999。另外峰型并未受進樣量增大而受影響(如圖7所示).這些結(jié)果表明，本發(fā)明方法的進樣量有較大的線性范圍。實施例6穩(wěn)定性考察在本實施例中，采用通用方法或各實施例方法制備唾液酸標記物、唾液酸分裝標準品、DMB標記溶液，并考察其穩(wěn)定性。結(jié)果表明：(1)NANA及NGNA標記物在4℃放置5天峰面積未見顯著變化，回收率均在90％～110％范圍內(nèi)，標準品標記后4℃穩(wěn)定性良好。(2)NANA及NGNA分裝標準品在-20℃保存2個月未見顯著變化，回收率均在85％～115％范圍內(nèi)，標準品-20℃穩(wěn)定性良好。為了有效期，可考慮將分裝的1μmol的唾液酸標準品-80℃保存。(3)DMB標記溶液在-20℃保存超過一天就有顯著變化，標記效率明顯下降，建議新鮮配置DMB標記溶液。實施例7蛋白樣品處理量線性考察在本實施例中，取不同量的待測樣品，按實施例1方法進行酸解、標記、預處理和親水色譜，從而考察蛋白樣品處理量線性。方法：分別取待測蛋白(b20140202批次蛋白)50μg，100μg，200μg，500μg，800μg，1000μg離心管中,加水至25μl，加入25μl4M乙酸，80℃反應2小時，再加入已分裝的DMB標記試劑50μl，50℃避光反應2小時，反應結(jié)束后加入400μl乙腈，混勻13000r/min離心5分鐘，取上清色譜分析。實驗結(jié)果如圖8和9所示。結(jié)果表明，待測蛋白(IBI302b20140202)樣品中NANA含量較高，蛋白處理量從50μg到1000μg范圍內(nèi)，NANA的峰面積呈線性增加，峰面積與樣品處理量相關(guān)系數(shù)r為0.9976，表明本發(fā)明方法的樣品處理量有較大的線性范圍。NGNA因含量較低，50μg蛋白處理量無法檢測到，線性較差。根據(jù)該線性結(jié)果，樣品處理量可根據(jù)濃度及樣品量做適當調(diào)整。若樣品濃度較低或樣品量較少時可減少樣品的處理量進行檢測；若蛋白唾液酸含量較低，為了提高靈敏度，也可根據(jù)項目需求增加樣品的處理量。實施例8準確度考察在本實施例中，進一步考察本發(fā)明方法的準確度。1.步驟：標準品溶液：取已分裝的1μmolNANA及NGNA，于同一離心管，加入980μl超純水混勻得到1μmol/ml混標樣品作為標準品溶液1，取100μl標準品溶液1加入900超純水得到0.1μmol/ml的NANA及NGNA的混標樣品作為標準品溶液2，取100μl標準品溶液2加入900超純水得到0.01μmol/ml的NANA及NGNA的混標樣品作為標準品溶液3，取10μl標準品溶液3(0.1nmol)，加入15μl超純水，加入25μl4M乙酸，80℃酸解2小時，反應結(jié)束后加入已分裝的DMB標記試劑50μl，50℃避光反應2小時，之后加入400μl乙腈終止反應，13000r/min離心5分鐘，取上清色譜分析。平行制備三份樣品。樣品溶液：分別取待測蛋白(c20130301批次)蛋白500μg，加水至25μl，之后加入25μl4M乙酸混勻，80℃反應2小時，再加入已分裝的標記試劑50μl，50℃避光反應2小時，反應結(jié)束后加入400μl乙腈，混勻后13000r/min離心5分鐘，取上清色譜分析。平行制備三份樣品。加標樣品溶液：分別取待測蛋白(c20130301批次蛋白)500μg，加入10μl標準品溶液3，加超純水至25μl，之后加入25μl4M乙酸混勻，80℃反應2小時，反應結(jié)束后加入DMB標記試劑50μl，50℃避光反應2小時，反應結(jié)束后加入400μl乙腈，混勻13000r/min離心105分鐘，取上清色譜分析。平行制備三份樣品。2.結(jié)果準確性實驗結(jié)果如表11和圖10所示。表11準確度結(jié)果結(jié)果表明，0.1nmolNANA及NGNA的加標回收率均在80％-120％范圍內(nèi)，表明該方法具有較好的準確性。其中回收率計算公式為：(加標回收率樣品平均峰面積-樣品檢測平均峰面積)/標準品檢測平均峰面積*100％。實施例9精密度考察在本實施例中，進一步考察本發(fā)明方法的精密度。1.步驟：標準品溶液：取已分裝的1μmolNANA及NGNA，于同一離心管，加入980μl超純水混勻得到1μmol/ml混標樣品作為標準品溶液1，取100μl標準品溶液1加入900超純水得到0.1μmol/ml的NANA及NGNA的混標樣品作為標準品溶液2，取10μl標準品溶液2(1nmol)，加入15μl超純水，加入25μl4M乙酸，80℃酸解2小時，反應結(jié)束后加入已分裝的DMB標記試劑50μl，50℃避光反應2小時，之后加入400μl乙腈終止反應，13000r/min離心5分鐘，取上清色譜分析。平行制備三份樣品。蛋白樣品溶液：取待測蛋白(b20140202批次蛋白)500μg，加水至25μl，之后加入25μl4M乙酸，80℃反應2小時，每隔30分鐘，瞬離一次，反應結(jié)束后再加入已分裝的DMB標記試劑50μl，50℃避光反應2小時，反應結(jié)束后加入400μl乙腈，充分渦旋振蕩混勻，13000r/min離心5分鐘，取上清色譜分析，平行制備六份樣品，檢測唾液酸摩爾比，考察方法精密度。2.試驗結(jié)果精密度結(jié)果見表12及圖11所示。表12精密度結(jié)果結(jié)果表明，由兩名實驗人員不同天做重復性試驗，NANA及NGNA的檢測結(jié)果均符合要求，兩次重復實驗各六組數(shù)據(jù)NANA含量的RSD均小于5％，NGNA含量因較低，RSD均小于10％；總共12組數(shù)據(jù)NANA及NGNA含量的RSD均小于10％，表明方法具有很好的精密度。實施例10耐受性考察重復實施例11(精密度考察)，制備標準品及樣品分別用不同色譜柱及不同儀器進行檢測，考察方法的耐受性。結(jié)果如表13所示。表13耐受性結(jié)果結(jié)果表明，不同色譜柱及不同儀器對待測蛋白(IBI302b20140202)進行唾液酸檢測無明顯差異，均在可接受范圍內(nèi)，表明方法對色譜柱及儀器的耐受性較好。實施例11唾液酸含量檢測試劑盒制備唾液酸含量檢測試劑盒，其組成及配制方法如下表14所示。表14.唾液酸含量檢測試劑盒制備結(jié)論本研究建立了唾液酸含量FLD-UHPLC的檢測方法，確定了蛋白的處理量為500μg，酸解2小時后采用DMB標記2小時，之后加入乙腈沉淀蛋白取上清色譜分析。本發(fā)明方法的專屬性、檢測限、線性、準確性、精密度及穩(wěn)定性等結(jié)果，匯總于表15。表15匯總分析表結(jié)果表明：(1)空白溶液在NANA及NGNA出峰位置無明顯干擾，方法具有非常好的專屬性；(2)標準品在0.01nmol～10nmol具有優(yōu)良的線性關(guān)系；(3)唾液酸標準品0.01nmol的信噪比均大于3，設(shè)為方法的檢測限，表明方法具有很高的靈敏度；(4)各批次樣品在唾液酸0.1nmol水平的加標回收率在80％～120％范圍內(nèi)，方法具有較好的準確性；(5)不同人員不同日期測定12份平行樣本唾液酸含量RSD小于10％，提示本發(fā)明方法具有較好的精密度；(6)DMB標記后的樣品在4℃放置5天依然穩(wěn)定；(7)分裝的1μmol唾液酸標準品-20℃放置2個月依然穩(wěn)定；(8)不同儀器及不同色譜柱對檢測結(jié)果無顯著影響，方法具有較好的耐受性。此外，本發(fā)明研究還發(fā)現(xiàn)，樣品濃縮脫鹽會造成蛋白的一定損失，從而影響唾液酸含量檢測值，因此優(yōu)選取消脫鹽步驟。酸解過程中反應體積較小僅50μl，高溫條件下溶液會蒸發(fā)，導致唾液酸水解不充分，應該定時瞬離樣品，使乙酸溶液處于離心管底部，保證唾液酸充分水解。蛋白處理量優(yōu)選在50μg-1000μg范圍內(nèi)。對比例1脫鹽-酸解-標記-反向色譜(對照方法)取測試樣品500μg，加水至500μl，13000r/min離心15min進行超濾濃縮脫鹽，之后回收蛋白(約20μl)，加入200μl2M乙酸，80℃反應2小時，反應結(jié)束后13000r/min離心10分鐘，取上清100μl，再加入已分裝的DMB標記試劑100μl，50℃避光反應2小時，反應結(jié)束后離心，取上清，進行反向色譜分析。反向色譜分析的條件：色譜柱WatersBEHC18；流速0.25ml/min；檢測波長ex＝373nmem＝448nm；流動相ACN/MeOH/H2O9/7/84；運行時間10分鐘；進樣盤溫度設(shè)置4℃。并根據(jù)實驗結(jié)果進行實時調(diào)整。結(jié)果檢測結(jié)果表明，采用反向色譜分析時，當流速為0.25ml/min時，NANA及NGNA出峰位置可以實現(xiàn)基線分離，但分離度約為1.5；當流速降為0.2ml/min，出峰時間雖有延后，分離度沒有改善，仍為約1.5，難以達到準確檢測的分離度要求。此外，反向色譜分析還具有如下缺點：1)處理后的樣品無法徹底去除蛋白，會顯著縮短色譜柱的壽命，每次樣品分析后需要較長時間的色譜柱沖洗。2)標記試劑與雜質(zhì)峰可能會影響唾液酸分離及鑒定，標準品保留時間會發(fā)生漂移，重現(xiàn)性不好，方法的耐受性較差。3)唾液酸高溫條件下會有降解，外標定量準確度較低。實施例12采用不同溶劑作為預處理劑進行預處理重復實施例1，不同點在于，采用不同的溶劑替代乙腈作為預處理劑，用量為400μl。結(jié)果表明，大多數(shù)溶劑無法進行有效進行預處理且分離度不高。C1-C3烷醇可以用于預處理，但是存在一定的溶劑效應。按處理效果排序，(a)乙腈＞(b)乙腈與C1-C3烷醇的混合溶劑(其中，在混合溶劑中，乙腈的含量通?！?0％，較佳地≥50％，更佳地≥70％或90％，按混合溶劑的總體積計)＞C1-C3烷醇(如異丙醇、乙醇、甲醇)，其中，“＞”表示“優(yōu)于”。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。當前第1頁1 2 3