技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微流控和腫瘤篩查技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種腫瘤標(biāo)志物群檢測(cè)用微流控芯片。

背景技術(shù)：

我國(guó)惡性腫瘤發(fā)病率日益上升，嚴(yán)重威脅人民健康。應(yīng)對(duì)腫瘤威脅的最佳對(duì)策是“早發(fā)現(xiàn)、早治療”?！霸绨l(fā)現(xiàn)”是“早治療”的前提，將極大提高治愈率，也可為患者和社會(huì)節(jié)省大量的醫(yī)療費(fèi)用。腫瘤篩查是早期發(fā)現(xiàn)癌癥和癌前病變的重要途徑，推廣普及腫瘤篩查，提高早期診斷率，是診治惡性腫瘤的主要有效手段。

目前，腫瘤篩查一般使用低劑量CT掃描或血清腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)，均需在具有一定規(guī)模的醫(yī)療機(jī)構(gòu)中進(jìn)行，由具備相應(yīng)資質(zhì)的專業(yè)技術(shù)人員在專業(yè)儀器上操作完成，無(wú)法在城鎮(zhèn)和農(nóng)村廣泛開展。偏高的價(jià)格也難以惠及低收入階層，制約了腫瘤篩查工作的推廣。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)快捷、低成本，無(wú)需借助專業(yè)儀器，實(shí)現(xiàn)自助式檢測(cè)的腫瘤標(biāo)志物群檢測(cè)用微流控芯片。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：一種腫瘤標(biāo)志物群檢測(cè)用微流控芯片，包括基板以及位于其上方的蓋板，所述蓋板為透明材質(zhì)，所述蓋板上設(shè)采血微針陣列，所述采血微針陣列由多個(gè)采血微針組成，每根采血微針的內(nèi)部有微管；所述蓋板和基板二者膠合或熱壓鍵合形成溢流腔、進(jìn)樣腔、反應(yīng)腔、毛細(xì)管流道和廢液腔，所述進(jìn)樣腔和反應(yīng)腔在垂直空間上連通，進(jìn)樣腔在上，反應(yīng)腔在下；所述進(jìn)樣腔內(nèi)設(shè)置吸水紙和濾紙；所述反應(yīng)腔位于濾紙下方，所述反應(yīng)腔內(nèi)置微柱陣列，反應(yīng)腔的底面和微柱陣列的表面涂有偶聯(lián)了發(fā)色基團(tuán)的標(biāo)記抗體；所述毛細(xì)管流道通過(guò)延時(shí)閥與反應(yīng)腔連通；所述毛細(xì)管流道的尾端區(qū)域的底部設(shè)置印有固相化的抗體試劑的多個(gè)檢測(cè)條帶和質(zhì)量控制條帶，每一個(gè)檢測(cè)條帶用于檢測(cè)一種腫瘤標(biāo)志物；所述毛細(xì)管流道外，與檢測(cè)條帶和質(zhì)量控制條帶一一對(duì)應(yīng)的位置處印有標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)色帶和標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量控制色帶。

所述采血微針陣列由微電子機(jī)械系統(tǒng)的加工工藝制作，內(nèi)置微管道，與進(jìn)樣腔連通。

所述吸水紙與采血微針內(nèi)的微管的底部緊密相連；所述濾紙位于吸水紙的下方、反應(yīng)腔的上方。

所述進(jìn)樣腔的頂部和溢流腔之間通過(guò)溢流槽連通。

所述延時(shí)閥為位于反應(yīng)腔和毛細(xì)管流道之間的一段長(zhǎng)約5毫米的毛細(xì)管，其底面具有疏水特性。

由上述技術(shù)方案可知，本發(fā)明的有益效果為：第一，實(shí)現(xiàn)了自助式檢測(cè)：無(wú)需進(jìn)醫(yī)院，無(wú)需專業(yè)設(shè)備的輔助，受檢者自行操作，自我檢查；第二，采血量極低：僅需一滴指尖血，就可以同時(shí)檢測(cè)多種腫瘤標(biāo)志物指標(biāo)；第三，高通量：同一毛細(xì)管流道，一次可以檢測(cè)多種腫瘤標(biāo)志物；第四，腫瘤標(biāo)志物指標(biāo)可視化讀取，無(wú)需激發(fā)等光學(xué)設(shè)備器材；第五，高度集成、精密：只用一個(gè)流道，只用一種發(fā)色基團(tuán)，就可同步檢出多項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物，無(wú)需多色標(biāo)記；第六，腫瘤標(biāo)志物的定量檢測(cè)：通過(guò)精巧的溢流槽和溢流腔設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)精確定量進(jìn)樣，又利用檢測(cè)條帶與標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)色帶的對(duì)比，實(shí)現(xiàn)多種腫瘤標(biāo)志物的定量檢測(cè)，并提高檢測(cè)的穩(wěn)定性和可靠性。第七，檢測(cè)速度快：整個(gè)檢測(cè)過(guò)程只需15分鐘；第八，采用MEMS采血微針陣列，采血安全、無(wú)痛感；第九，利用毛細(xì)管浸潤(rùn)原理實(shí)現(xiàn)血清樣品的自動(dòng)進(jìn)樣和輸送及流速控制，整個(gè)過(guò)程無(wú)需外界控制或提供能量，無(wú)需使用任何其他設(shè)備；第十，芯片由塑料制成，適合大批量生產(chǎn)，成本極低，適合一次性使用。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明中透明蓋板的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為本發(fā)明中基板及其上安裝的各個(gè)部件的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖3為本發(fā)明的剖視圖；

圖4為本發(fā)明中兩個(gè)微針的放大結(jié)構(gòu)示意圖。

具體實(shí)施方式

如圖1、2、3所示，一種腫瘤標(biāo)志物群檢測(cè)用微流控芯片，包括基板1以及位于其上方的蓋板2，所述蓋板2為透明材質(zhì)，所述蓋板2上設(shè)采血微針陣列3，所述采血微針陣列3由多個(gè)采血微針組成，每根采血微針的內(nèi)部有微管14；所述蓋板2和基板1二者膠合或熱壓鍵合形成溢流腔4、進(jìn)樣腔16、反應(yīng)腔5、毛細(xì)管流道8和廢液腔15，所述進(jìn)樣腔16和反應(yīng)腔5在垂直空間上連通，進(jìn)樣腔16在上，反應(yīng)腔5在下；所述進(jìn)樣腔16內(nèi)設(shè)置吸水紙6和濾紙18；所述毛細(xì)管流道8通過(guò)延時(shí)閥9與反應(yīng)腔5連通；所述毛細(xì)管流道8的尾端區(qū)域的底部設(shè)置印有固相化的抗體試劑的多個(gè)檢測(cè)條帶13和質(zhì)量控制條帶12，每一個(gè)檢測(cè)條帶13用于檢測(cè)一種腫瘤標(biāo)志物；所述毛細(xì)管流道8外，與檢測(cè)條帶13和質(zhì)量控制條帶12一一對(duì)應(yīng)的位置處印有標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)色帶10和標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量控制色帶11，用作讀取檢測(cè)反應(yīng)和質(zhì)量控制反應(yīng)強(qiáng)度的對(duì)照參考。

如圖1、2所示，所述基板1和蓋板2利用膠水粘合，以防泄露。基板1和蓋板2的材料均為生物兼容性的塑料，蓋板2為透明材質(zhì)。為適于大批量生產(chǎn)，基板1和透明蓋板2均采用注塑或熱壓成型工藝生產(chǎn)。

如圖4所示，所述采血微針陣列3由微電子機(jī)械系統(tǒng)的加工工藝制作，每根采血微針的高度為300微米，底部直徑為250微米，尖端直徑為100微米。被檢測(cè)者手指按壓采血微針陣列3，采血微針可穿破手指的角質(zhì)層和表皮，血液即可通過(guò)微針內(nèi)的微管14滲入微流控芯片。由于采血微針尺寸小，刺入皮膚時(shí)幾乎不接觸任何神經(jīng)；拔出后，在皮膚上留下的針孔極小，皮膚可很快愈合，不會(huì)導(dǎo)致傷口感染，所以這種采血方法安全、無(wú)痛感。

如圖2、3所示，所述吸水紙6與采血微針內(nèi)的微管14的底部緊密相連，以吸收從微管14滲入的血樣，并增強(qiáng)微管14對(duì)血樣的吸力；所述濾紙18在吸水紙6的下方，反應(yīng)腔5的上方，對(duì)全血起過(guò)濾作用，血清可透過(guò)，流入下面的反應(yīng)腔5，血細(xì)胞則不能透過(guò)。吸水紙6較厚，具有較大孔隙，吸水性強(qiáng)，與采血微針陣列3內(nèi)的微管14相連，增強(qiáng)了微管14對(duì)指尖血的吸力，提高采血效率。濾紙6在吸水紙18的下方，較薄，孔隙較小，對(duì)全血起過(guò)濾作用：血清可透過(guò)濾紙6的孔隙流入下面的反應(yīng)腔5，血細(xì)胞則不能透過(guò)。

如圖2、3所示，所述進(jìn)樣腔16的頂部和溢流腔4之間通過(guò)溢流槽17連通。所述進(jìn)樣腔16的一側(cè)設(shè)置溢流槽17，連通溢流腔4，使得過(guò)量注入的血樣可以溢入溢流腔4，保證進(jìn)入進(jìn)樣腔的血樣的體積精確定量。

如圖2、3所示，所述反應(yīng)腔5位于濾紙18下方，所述反應(yīng)腔5內(nèi)置微柱陣列7，反應(yīng)腔5的底面和微柱陣列7的表面涂有偶聯(lián)了發(fā)色基團(tuán)的標(biāo)記抗體。待測(cè)樣品的血清透過(guò)濾紙6流入反應(yīng)腔5后，標(biāo)記抗體從反應(yīng)腔5的底面和微柱陣列7的表面溶解下來(lái)，與血清中的待測(cè)蛋白（腫瘤標(biāo)志物）起免疫反應(yīng)，形成牢固的抗原－抗體結(jié)合，從而使偶聯(lián)在標(biāo)記抗體上的發(fā)色基團(tuán)牢固地附著到被測(cè)蛋白（腫瘤標(biāo)志物）上，即待測(cè)蛋白（腫瘤標(biāo)志物）被發(fā)色基團(tuán)標(biāo)記，為后續(xù)檢測(cè)提供必備的條件。

如圖2、3所示，所述延時(shí)閥9為位于反應(yīng)腔5和毛細(xì)管流道8之間的一段長(zhǎng)為5毫米的毛細(xì)管。該段毛細(xì)管的底面為疏水性，導(dǎo)致液體浸潤(rùn)該管道底的過(guò)程緩慢，從而起到阻止血清流入毛細(xì)管流道8的“閥”作用，保證血清樣品在反應(yīng)腔５里停留足夠長(zhǎng)時(shí)間，以充分完成待測(cè)蛋白（腫瘤標(biāo)志物）與標(biāo)記抗體的免疫反應(yīng)，確保待測(cè)蛋白被發(fā)色基團(tuán)標(biāo)記。經(jīng)過(guò)特定的一段時(shí)間后，該段毛細(xì)管流道8的管底被血清完全浸潤(rùn)，表面覆蓋了液體膜，就變成親水的，失去阻礙血清樣品的作用，相當(dāng)于閥門打開，血清樣品在毛細(xì)管力牽引下可順利流過(guò)。

如圖2、3所示，所述毛細(xì)管流道利用毛細(xì)管浸潤(rùn)原理實(shí)現(xiàn)血清樣品沿管道的自動(dòng)輸送，毛細(xì)管力成為牽引血清樣品沿微管道流動(dòng)的動(dòng)力。整個(gè)過(guò)程無(wú)需外界控制或提供能量?？赏ㄟ^(guò)設(shè)置毛細(xì)管流道8特定區(qū)域的親、疏水特性，控制血清樣品以合適的速度流過(guò)位于毛細(xì)管流道8尾端的若干檢測(cè)條帶13和質(zhì)量控制條帶12區(qū)域，使待測(cè)蛋白（腫瘤標(biāo)志物）檢測(cè)所需的特異性免疫反應(yīng)充分完成，并保證未起特異性免疫反應(yīng)的蛋白和附著其上的發(fā)色基團(tuán)隨血清流到廢液腔15，不殘留在檢測(cè)條帶13和質(zhì)量控制條帶12區(qū)域。

如圖2所示，所述檢測(cè)條帶13和質(zhì)量控制條帶12位于毛細(xì)管流道8的尾端區(qū)域的底部，通過(guò)在毛細(xì)管流道8的底部分別印刷不同的抗體試劑制成。這些抗體試劑本身無(wú)色，固化后牢固地附著在毛細(xì)管流道8的底部，遇血清沖洗，也不會(huì)從管道底部脫落。血清樣品流過(guò)檢測(cè)條帶13和質(zhì)量控制條帶12時(shí)，血清樣品中特定的待測(cè)蛋白（腫瘤標(biāo)志物）分別與這些固相化的抗體試劑起特異性免疫反應(yīng)，形成不同的抗原-抗體結(jié)合體，從而分別被捕獲在相應(yīng)的檢測(cè)條帶上。由于待測(cè)蛋白（腫瘤標(biāo)志物）已在反應(yīng)腔5中通過(guò)標(biāo)記抗體被發(fā)色基團(tuán)染色，所以檢測(cè)條帶13顯出發(fā)色基團(tuán)的顏色。被捕獲的待測(cè)蛋白（腫瘤標(biāo)志物）越多，檢測(cè)條帶13的顏色就越深，因此，可以通過(guò)測(cè)量反應(yīng)后檢測(cè)條帶13的灰度值，來(lái)判斷待測(cè)血樣中腫瘤標(biāo)志物的濃度。每個(gè)檢測(cè)條帶13含有特定的檢測(cè)抗體試劑，用于捕獲一種腫瘤標(biāo)志物。雖然不同的腫瘤標(biāo)志物在反應(yīng)腔5里被同一種發(fā)色基團(tuán)標(biāo)記，但由于毛細(xì)管流道8里各檢測(cè)條帶13是事先精確定位的，相互之間留有足夠的間隔，并檢測(cè)抗體牢固附著在流道底上，所以檢測(cè)時(shí)各檢測(cè)條帶13互不混淆，顯現(xiàn)的色帶之間保持間隔，可以憑色帶的位置識(shí)別檢測(cè)的是哪一種腫瘤標(biāo)志物，從而實(shí)現(xiàn)“一個(gè)流道，一種發(fā)色基團(tuán)，同時(shí)檢測(cè)多種腫瘤標(biāo)志物”。

如圖2、3所示，毛細(xì)管流道8外，與檢測(cè)條帶13和質(zhì)量控制條帶12一一對(duì)應(yīng)的位置印有標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)色帶10和標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量控制色帶11，用作讀取檢測(cè)反應(yīng)和質(zhì)量控制反應(yīng)強(qiáng)度的對(duì)照參考。質(zhì)量控制條帶12用于驗(yàn)證芯片是否有效：如果芯片有效，血清樣品流過(guò)后，質(zhì)量控制色帶12出現(xiàn)的顏色應(yīng)該與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量控制色帶11的顏色接近，否則，則說(shuō)明芯片失效。對(duì)檢測(cè)條帶13、質(zhì)量控制條帶12、標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)色帶10和標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量控制色帶11拍攝數(shù)字照片，再利用圖像處理軟件分別對(duì)質(zhì)量控制條帶12與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量控制色帶11、檢測(cè)條帶13與標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)色帶10進(jìn)行單位面積上的灰度值對(duì)比，可以判斷芯片檢測(cè)是否有效，并換算出各檢測(cè)條帶對(duì)應(yīng)的腫瘤標(biāo)志物的濃度。

本發(fā)明的工作流程如下：

1）指尖血進(jìn)樣：被檢測(cè)者手指按壓芯片蓋板2上的采血微針陣列3，采血微針刺穿手指的角質(zhì)層和表皮，血液即可通過(guò)采血微針內(nèi)的微管14滲入芯片的進(jìn)樣腔16，被上層的濾紙18吸收。過(guò)量的血樣通過(guò)溢流槽17流入溢流腔4，保證進(jìn)入反應(yīng)腔5的血樣的精確定量。

2）血清分離：指尖血被吸入進(jìn)樣腔16內(nèi)的上層濾紙后，在重力作用下，透過(guò)下層濾紙進(jìn)入反應(yīng)腔5。下層濾紙的孔隙小，血清可以透過(guò)，流入反應(yīng)腔5，血細(xì)胞則不能透過(guò)，留在濾紙上。

3）待測(cè)蛋白（腫瘤標(biāo)志物）標(biāo)記：反應(yīng)腔5的腔底和微柱陣列7表面涂有偶聯(lián)了發(fā)色基團(tuán)的標(biāo)記抗體。由于反應(yīng)腔5和毛細(xì)管流道8之間的延時(shí)閥9的作用，血清進(jìn)入反應(yīng)腔5后，在反應(yīng)腔5里停留一段時(shí)間，將把標(biāo)記抗體從反應(yīng)腔5的腔底和微柱陣列7表面 “溶解’下來(lái)。血清中的待測(cè)蛋白（腫瘤標(biāo)志物）與標(biāo)記抗體起免疫反應(yīng)，從而被發(fā)色基團(tuán)標(biāo)記。

4）待測(cè)蛋白捕獲：延時(shí)閥9打開后，血清在毛細(xì)管力作用下，自動(dòng)沿毛細(xì)管流道8流動(dòng)，以合適的速度流過(guò)檢測(cè)條帶13和質(zhì)量控制條帶12區(qū)域。檢測(cè)條帶13的底部預(yù)先印有可與待測(cè)的腫瘤標(biāo)志物（蛋白）起特異性反應(yīng)的抗體探針，即捕獲抗體。捕獲抗體應(yīng)與上述標(biāo)記抗體無(wú)交叉反應(yīng)，并且牢固地附著在檢測(cè)反應(yīng)區(qū)的底部。血清流過(guò)時(shí)，血清中的待測(cè)腫瘤標(biāo)志物蛋白，將會(huì)與捕獲抗體起特異性反應(yīng)，形成抗原-抗體結(jié)合體，從而附著在檢測(cè)反應(yīng)區(qū)的底部。由于待測(cè)的腫瘤標(biāo)志物（蛋白）已偶聯(lián)發(fā)色基團(tuán)，所以在檢測(cè)反應(yīng)區(qū)的底部出現(xiàn)顯色條帶。血清中的其他成分將沿毛細(xì)管通道流入廢液腔15。質(zhì)量控制條帶12上印有固相化的質(zhì)控抗體，也可與待測(cè)的腫瘤標(biāo)志物（蛋白）起免疫反應(yīng)，也捕獲待測(cè)的腫瘤標(biāo)志物（蛋白）。如果芯片反應(yīng)有效，血清樣品流過(guò)后，質(zhì)量控制色帶12將顯色，否則，則說(shuō)明芯片失效。

5）檢測(cè)讀?。簩?duì)檢測(cè)條帶13、質(zhì)量控制條帶12、標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)色帶10和標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量控制色帶11拍照，然后利用圖像處理軟件對(duì)質(zhì)量控制條帶12與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量控制色帶11、檢測(cè)條帶13與標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)色帶10進(jìn)行單位面積的灰度值對(duì)比，判斷芯片檢測(cè)是否有效，并換算出各檢測(cè)條帶對(duì)應(yīng)的腫瘤標(biāo)志物的濃度。

綜上所述，本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了自助式檢測(cè)：無(wú)需進(jìn)醫(yī)院，無(wú)需專業(yè)設(shè)備的輔助，受檢者自行操作，自我檢查；采血量極低：僅需一滴指尖血，就可以同時(shí)檢測(cè)多種腫瘤標(biāo)志物指標(biāo)；高通量：同一毛細(xì)管流道，一次可以檢測(cè)多種腫瘤標(biāo)志物；腫瘤標(biāo)志物在可見(jiàn)光范圍讀取，無(wú)需激發(fā)等光學(xué)設(shè)備器材。