本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及SUSD2在制備高級(jí)別漿液性卵巢癌診斷和/或預(yù)后判斷的試劑盒中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

卵巢癌是婦科常見(jiàn)惡性腫瘤，病死率位居?jì)D科惡性腫瘤之首，是婦產(chǎn)科臨床面臨的最大挑戰(zhàn)。雖然腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)和鉑類(lèi)紫杉類(lèi)聯(lián)合化療使患者5年生存率有所改善，但半個(gè)世紀(jì)以來(lái)卵巢癌臨床診治并無(wú)實(shí)質(zhì)性進(jìn)展。這主要由于缺乏臨床實(shí)用的早期診斷手段和療效持久的治療方案，其根本原因在于對(duì)卵巢癌的早期診斷、發(fā)生發(fā)展、預(yù)后等的分子機(jī)制認(rèn)識(shí)不清。

高級(jí)別漿液性卵巢癌(HGSOC)是卵巢癌患者死亡的主要原因，所占比例較大，且死亡率居高不下。HGSOC預(yù)后很差，長(zhǎng)期存活率低于20％。復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是術(shù)后治療失敗的主要原因。目前臨床實(shí)踐中，臨床病理分期是最重要、最可靠的預(yù)后指標(biāo)，但是仍然需要更精確的標(biāo)志物進(jìn)一步將術(shù)后病人劃分為高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)而采取更有效的治療方法。

腫瘤的發(fā)生是多因素、多基因異常所致的復(fù)雜過(guò)程，在病灶發(fā)生形態(tài)學(xué)變化之前，可能已經(jīng)存在著許多分子生物學(xué)的改變。用分子水平異常作為卵巢癌的腫瘤標(biāo)志物能更恰當(dāng)?shù)胤从衬[瘤生物學(xué)行為的異質(zhì)性，進(jìn)而為卵巢癌的早期診斷和預(yù)后判斷提供更有價(jià)值的指導(dǎo)。

目前發(fā)現(xiàn)的卵巢癌重要改變的分子標(biāo)志物主要集中在核酸與蛋白方面，前者包括細(xì)胞遺傳學(xué)改變、基因的擴(kuò)增、缺失、突變、斷裂與融合、mRNA及miRNA等，后者表現(xiàn)為蛋白表達(dá)水平、大小、亞細(xì)胞定位及蛋白翻譯后修飾等改變。由于蛋白質(zhì)是基因表達(dá)的最終產(chǎn)物，也是基因功能的執(zhí)行者，蛋白質(zhì)間的相互作用、相互協(xié)調(diào)是細(xì)胞進(jìn)行一切代謝活動(dòng)的基礎(chǔ)，因此關(guān)注卵巢癌發(fā)生發(fā)展中蛋白水平的改變，尋找對(duì)卵巢癌進(jìn)行早期診斷和預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物顯得尤為重要。

SUSD2是單通道1型膜蛋白，常表達(dá)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，血管周?chē)交〖?xì)胞，以及許多腫瘤細(xì)胞系。之前的研究表明，在許多腫瘤中(例如，肝癌，肺癌等)，SUSD2表達(dá)低，過(guò)表達(dá)SUSD2可抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和增殖。但在乳腺癌中，SUSD2相比于乳腺良性腫瘤表達(dá)增加，并且過(guò)表達(dá)后可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡。由此可見(jiàn)，在不同的腫瘤組織中，SUSD2的表達(dá)與腫瘤發(fā)生及進(jìn)展的相關(guān)性是存在較大差異的。因此，研究SUSD2在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中表達(dá)量的變化，對(duì)于卵巢癌的早期診斷和預(yù)后判斷具有十分重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的在于研究SUSD2在高級(jí)別漿液性卵巢癌中的表達(dá)情況，并分析其與高級(jí)別漿液性卵巢癌臨床病理參數(shù)和生物學(xué)行為的關(guān)系，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)SUSD2在高級(jí)別漿液性卵巢癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移過(guò)程中所起的作用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明首先比較了SUSD2在輸卵管傘和高級(jí)別漿液性卵巢癌中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)SUSD2在輸卵管傘中低表達(dá)，在高級(jí)別漿液性卵巢癌中高表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本發(fā)明還比較了高級(jí)別漿液性卵巢癌患者的無(wú)進(jìn)展生存期、總生存期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腹膜轉(zhuǎn)移情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SUSD2高表達(dá)患者的預(yù)后越差。

綜合上述研究結(jié)果，本發(fā)明的第一方面，提供SUSD2作為高級(jí)別漿液性卵巢癌診斷和/或預(yù)后判斷的標(biāo)志物的應(yīng)用。

通過(guò)測(cè)定上述標(biāo)志物的表達(dá)量，可以進(jìn)行高級(jí)別漿液性卵巢癌診斷和/或預(yù)后判斷，包括：高級(jí)別漿液性卵巢癌或卵巢癌組織轉(zhuǎn)移的鑒別診斷和/或易感性分析，高級(jí)別漿液性卵巢癌治療藥物、治療方法、治療療效及預(yù)后的評(píng)估，相關(guān)人群高級(jí)別漿液性卵巢癌或卵巢癌組織轉(zhuǎn)移患病風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估等。

測(cè)定上述標(biāo)志物的表達(dá)量需要使用檢測(cè)試劑、試劑盒或檢測(cè)芯片等，因此，本發(fā)明進(jìn)一步研究了上述標(biāo)志物的檢測(cè)試劑、試劑盒和檢測(cè)芯片，以用于高級(jí)別漿液性卵巢癌診斷和/或預(yù)后。

檢測(cè)蛋白表達(dá)的方法有多種，包括但不限于酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)，例如競(jìng)爭(zhēng)性ELISA、雙抗夾心ELISA、免疫印跡、ELISA和免疫印跡的組合等。根據(jù)上述檢測(cè)方法，能夠檢測(cè)SUSD2的試劑都可以制成卵巢癌診斷和預(yù)后判斷的試劑盒。本發(fā)明的第二方面，提供一種SUSD2的檢測(cè)方法，步驟如下：

將輸卵管傘和高級(jí)別漿液性卵巢癌的蠟塊制作成組織芯片(TMA)，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色、顯微鏡和成像設(shè)備掃描為電子圖片，閱片并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

具體檢測(cè)方法如下：

將TMA組織切片經(jīng)脫蠟至水、抗原修復(fù)、滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和山羊血清封閉后，分別與一抗SUSD2在保濕盒內(nèi)4℃孵育過(guò)夜，隨后經(jīng)PBS洗后分別與二抗(生物素標(biāo)記的羊抗鼠/兔IgG)、辣根過(guò)氧化酶酶標(biāo)簽孵育，DAB顯色，蘇木素復(fù)染；最后經(jīng)酒精脫水和二甲苯透明后用中性樹(shù)膠封片，利用顯微鏡和成像設(shè)備掃描為數(shù)碼照片，并對(duì)每張免疫組化染色切片進(jìn)行評(píng)分。

對(duì)每張TMA的評(píng)分包括兩部分，染色強(qiáng)度和染色面積，染色強(qiáng)度從低到高依次未為陰性(-)，弱陽(yáng)性(+)，陽(yáng)性(++)，強(qiáng)陽(yáng)性(+++)，染色面積用百分率表示，即0％-100％。染色面積0％-10％記為0，11％-20％記為1，21％-50％記為2，51％-100％記為3，最終每個(gè)點(diǎn)的免疫組化得分為染色強(qiáng)度*染色面積。

SUSD2的免疫組化評(píng)分以6為cut-off值，小于6為陰性或弱陽(yáng)性，大于等于6為陽(yáng)性或強(qiáng)陽(yáng)性。

預(yù)后判斷或風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)的判斷方法為，SUSD2蛋白表達(dá)陽(yáng)性，則卵巢癌患者生存期短；SUSD2蛋白表達(dá)陰性，則卵巢癌患者生存期長(zhǎng)。

本發(fā)明的第三方面，提供檢測(cè)SUSD2的試劑在制備高級(jí)別漿液性卵巢癌診斷和/或預(yù)后判斷的試劑盒中的應(yīng)用。

優(yōu)選的，所述檢測(cè)SUSD2的試劑為SUSD2抗體。

進(jìn)一步的，所述試劑中還包含：山羊血清、0.01M檸檬酸鹽抗原修復(fù)液、3％H₂O₂、DAB顯色試劑和PBS溶液。

本發(fā)明的第四方面，提供抑制SUSD2蛋白表達(dá)的試劑在制備改善高級(jí)別漿液性卵巢癌預(yù)后的藥物中的用途。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明首次研究發(fā)現(xiàn)SUSD2在輸卵管傘中表達(dá)是下調(diào)的，但在高級(jí)別漿液性卵巢癌中的表達(dá)是上調(diào)的，且SUSD2的表達(dá)與卵巢癌患者的預(yù)后緊密相關(guān)。本發(fā)明以SUSD2作為標(biāo)志物，通過(guò)免疫組織化學(xué)的方法診斷高級(jí)別漿液性卵巢癌，并判斷高級(jí)別漿液性卵巢癌的預(yù)后。SUSD2高級(jí)別漿液性卵巢癌中高表達(dá)，而在正常輸卵管傘中低表達(dá)。SUSD2在高級(jí)別漿液性卵巢癌中的表達(dá)水平和病人的存活率有關(guān)，SUSD2表達(dá)高的患者預(yù)后不好，存活率低。根據(jù)SUSD2的表達(dá)情況與高級(jí)別漿液性卵巢癌預(yù)后之間的關(guān)系，可以對(duì)卵巢癌進(jìn)行診斷和預(yù)后的判斷，以及開(kāi)發(fā)能夠改善高級(jí)別漿液性卵巢癌的藥物，具有十分廣泛的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1：SUSD2表達(dá)情況與卵巢高級(jí)別漿乳癌生存曲線(xiàn)(無(wú)進(jìn)展生存期)；

圖2：SUSD2表達(dá)情況與卵巢高級(jí)別漿乳癌生存曲線(xiàn)(總生存期)；

圖3：在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性惡性腫瘤檢測(cè)結(jié)果；

圖4：在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性腫瘤檢測(cè)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，應(yīng)該說(shuō)明的是，下述實(shí)施例說(shuō)明僅是為了解釋本發(fā)明，并不對(duì)其內(nèi)容進(jìn)行限定。本發(fā)明實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，均為常規(guī)的試驗(yàn)方法。

實(shí)施例1：

1.試驗(yàn)方法：

我們收集了2007-2013年55例輸卵管傘和306例高級(jí)別漿液性卵巢癌患者的手術(shù)標(biāo)本存檔蠟塊。利用半自動(dòng)組織芯片打孔機(jī)制作成3個(gè)TMA組織芯片，保證免疫組織化學(xué)大樣本、高通量、標(biāo)準(zhǔn)化。每個(gè)蠟塊均包含輸卵管傘和高級(jí)別漿液性卵巢癌。

組織芯片(TMA)技術(shù)是將數(shù)十至數(shù)百個(gè)甚至更多的組織樣本整齊的排列在一張載玻片上而制成的縮微陣列組織片。通過(guò)免疫組化、原位雜交顯色等，在組織切片上實(shí)現(xiàn)了高通量獲取基于形態(tài)學(xué)的基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的表達(dá)信息。組織芯片技術(shù)已經(jīng)在腫瘤研究中廣泛應(yīng)用，用于研究腫瘤不同發(fā)展階段的基因及蛋白質(zhì)變化情況、預(yù)后的評(píng)價(jià)及分子標(biāo)志物的評(píng)價(jià)、信號(hào)通路研究等。組織芯片具有大樣本、高通量、標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，是實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)分子網(wǎng)絡(luò)與臨床信息的集成的關(guān)鍵技術(shù)。本實(shí)施例采用的是TMA組織芯片，每張芯片上面有將近200個(gè)點(diǎn)，可以同時(shí)進(jìn)行免疫組化檢測(cè)其表達(dá)情況。

標(biāo)本經(jīng)連續(xù)切片、二甲苯脫蠟、梯度酒精水化后，用超敏型二步法檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)，具體方法如下：

(1)TMA切片經(jīng)過(guò)65℃烤片，二甲脫蠟、梯度酒精水化；其中，脫蠟、水化的具體步驟為：

①組織切片置于二甲苯I中浸泡10分鐘，②組織切片置于二甲苯II浸泡10分鐘，③組織切片置于無(wú)水乙醇中I浸泡10分鐘，④組織切片置于無(wú)水乙醇II浸泡10分鐘，⑤組織切片置于95％乙醇中浸泡10分鐘，⑥組織切片置于80％乙醇中浸泡10分鐘，⑦組織切片置于75％乙醇中浸泡10分鐘，⑧組織切片置于蒸餾水中浸泡5分鐘。

(2)切片經(jīng)0.01M檸檬酸鹽抗原修復(fù)液(Citrate Buffer(pH 6.0))抗原修復(fù)、3％H₂O₂滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶、封閉。具體步驟為：

將0.01M檸檬酸鹽抗原修復(fù)液通過(guò)微波爐加熱5分鐘，放入組織切片高火加熱15秒，冷卻30，反復(fù)加熱-冷卻15個(gè)循環(huán)，在室溫下冷卻；

用1*PBS洗處理過(guò)的組織切片3次，每次五分鐘。

將3％雙氧水溶液滴加在載玻片上，37度靜置15分鐘，甩去多余液體。

用1*PBS洗3次，各五分鐘。

滴加封閉液(正常山羊血清，5％BSA溶液)，在37度孵育30分鐘，甩去多余液體。

(3)滴加SUSD2一抗(1∶100)50μL，室溫靜置2小時(shí)。

(4)1*PBS緩沖液洗3次，每次5分鐘。

(5)滴加二抗(生物素標(biāo)記的羊抗鼠/兔IgG)(1∶100)50μL，室溫靜置20分鐘。

(6)1*PBS緩沖液洗3次，每次5分鐘。

(7)滴加辣根過(guò)氧化物酶50μL，室溫靜置15分鐘。

(8)1*PBS緩沖液洗4次，每次5分鐘。

(9)DAB顯色，在顯微鏡下掌握染色程度，在達(dá)到滿(mǎn)意效果后放入清水中終止染色，后用自來(lái)水沖洗10分鐘。

(10)蘇木精復(fù)染5分鐘，自來(lái)水沖洗10分鐘。

(11)5％鹽酸酒精脫色5秒，氨水反藍(lán)15秒，自來(lái)水沖洗10分鐘。

(12)脫水、透明，具體步驟如下：①組織切片置于80％乙醇中浸泡3分鐘，②95％乙醇中浸泡3分鐘，③無(wú)水乙醇中II浸泡5分鐘，④無(wú)水乙醇I浸泡5分鐘，⑤二甲苯II中浸泡10分鐘，⑥二甲苯I浸泡10分鐘。

(13)樹(shù)脂封片、鏡檢。

所有的免疫染色切片經(jīng)2位病理醫(yī)師采用盲法獨(dú)立評(píng)分。腫瘤細(xì)胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒被認(rèn)為是陽(yáng)性信號(hào)。染色強(qiáng)度分4級(jí)：0，陰性；1，弱陽(yáng)性；2，陽(yáng)性；3，強(qiáng)陽(yáng)性；陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分4個(gè)等級(jí)：0，0～10％；1，11～20％；2：21～50％；3，51-100％。每個(gè)標(biāo)本的總分?jǐn)?shù)是由腫瘤細(xì)胞染色強(qiáng)度和腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性百分?jǐn)?shù)兩部分的乘積得出的，范圍是0～9。為了方便統(tǒng)計(jì)，我們把免疫組織化學(xué)染色分為低表達(dá)(即標(biāo)本的組化染色總分?jǐn)?shù)小于3)和高表達(dá)(即標(biāo)本的組化染色總分?jǐn)?shù)大于或等于3)2個(gè)組。

2.試驗(yàn)結(jié)果：

(1)SUSD2在輸卵管傘和高級(jí)別漿液性卵巢癌中的表達(dá)情況：

結(jié)果見(jiàn)表1。

表1：SUSD2在輸卵管傘和高級(jí)別漿液性卵巢癌中的表達(dá)情況

對(duì)照組VS腫瘤組(χ²＝22.725，p＜0.001)。

結(jié)果表明卵巢高級(jí)別漿乳癌，SUSD2表達(dá)量明顯增強(qiáng)。

(2)SUSD2在高級(jí)別漿液性卵巢癌中的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系

結(jié)果見(jiàn)表2。

表2：SUSD2在高級(jí)別漿液性卵巢癌中的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系

無(wú)進(jìn)展生存期，大于兩年VS小于等于兩年(χ²＝15.045，p＜0.001)；總生存期，大于兩年VS小于兩年(χ²＝33.457，p＜0.001))；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移組VS未轉(zhuǎn)移組(χ²＝4.546，p＜0.05)；腹膜轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移組VS為轉(zhuǎn)移組(χ²＝10.973，p＜0.005)。

結(jié)果表明，在高級(jí)別漿液性卵巢癌中，SUSD2高表達(dá)組預(yù)后差。

(3)SUSD2表達(dá)情況與高級(jí)別漿液性卵巢癌生存曲線(xiàn)分析

結(jié)果分別見(jiàn)圖1和圖2。由圖可以看出：SUSD2在高級(jí)別漿液性卵巢癌中的表達(dá)情況與卵巢癌患者的無(wú)進(jìn)展生存期和總生存期相關(guān)；高表達(dá)組中(中位無(wú)進(jìn)展生存期15個(gè)月，中位總生存期27.55個(gè)月)；低表達(dá)組(中位無(wú)進(jìn)展生存期28.08個(gè)月，中位總生存期61個(gè)月)。

綜上，SUSD2可以用來(lái)作為高級(jí)別漿液性卵巢癌的診斷和預(yù)后評(píng)價(jià)指標(biāo)，尤其能評(píng)價(jià)患者術(shù)后的存活情況，為臨床醫(yī)師的治療提供建議和參考。

實(shí)施例2：

采用本發(fā)明實(shí)施例1的方法對(duì)蠟塊標(biāo)本組織進(jìn)行檢測(cè)，鏡檢結(jié)果分別如圖3和圖4所示。其中，圖3所示的組織切塊中SUSD2的表達(dá)程度較高，細(xì)胞膜上有明顯棕黃色顆粒，為SUSD2檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果，后經(jīng)病理檢測(cè)結(jié)果為高級(jí)別漿液性卵巢癌。

圖4所示的組織切片中SUSD2的表達(dá)程度較低，無(wú)明顯棕黃色顆粒，為SUSD2檢測(cè)陰性結(jié)果，后經(jīng)病理檢測(cè)結(jié)果為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。