本發(fā)明屬于生物化學檢測領域，涉及一種基于量子點微球和抗生素的金黃色葡萄球菌快速層析試紙條。
背景技術：
金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是人類的一種重要病原菌，隸屬于葡萄球菌屬(Staphylococcus)，是革蘭氏陽性菌的代表，有“嗜肉菌”的別稱，可引起局部化膿感染，也可引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等，甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染。金黃色葡萄球菌在自然界中無處不在，空氣、水、灰塵及人和動物的排泄物中都可找到。因此，食品受到污染的機會很多。美國疾病控制中心報告，由金黃色葡萄球菌引起的感染占第二位，僅次于大腸桿菌。金黃色葡萄球菌腸毒素是個世界性衛(wèi)生難題，在美國由金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒，占整個細菌性食物中毒的33％，加拿大則更多，占到45％。中國金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事件也時有發(fā)生，比如2001年4月12日，無錫市錫山區(qū)所轄小學、幼兒園因課間加餐飲用袋裝牛奶飲料導致食物中毒事件。
傳統(tǒng)金黃色葡萄球菌等病原微生物的檢測方法為瓊脂培養(yǎng)法，其主要是依據病原微生物的形態(tài)特征和生理性狀，進行分離、培養(yǎng)及一系列生化反應，整個過程通常需要兩到三天，且需要專業(yè)的操作人員，程序繁瑣。這對貨架壽命較短的食品在產品衛(wèi)生狀況方面的評估作用不大，難以滿足食品生產廠家特別是出口廠家的檢測期較短的需求。近年來，不斷發(fā)展的免疫熒光技術、酶聯(lián)免疫技術、放射免疫技術等免疫學方法已逐步應用于金黃色葡萄球菌等病原微生物的檢測，但仍存在操作繁瑣，敏感性偏低等問題。且相比傳統(tǒng)方法所需儀器設備要求高，在很大程度上限制了這些方法的應用和推廣，大大降低了其實用價值。快速檢測試紙條因成本低、操作簡單、檢測時間短等明顯優(yōu)勢，近年來備受關注。它是金黃色葡萄球菌等病原微生物快速檢測技術的重要研究方向，對有效預防和控制病原微生物類食品安全事件的暴發(fā)，減輕病原微生物對人類造成的危害將發(fā)揮重要的作用。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供了一種基于量子點微球和抗生素的金黃色葡萄球菌快速層析試紙條及其構建方法，以解決現(xiàn)有技術靈敏度低，操作復雜，設備要求高等問題。
本發(fā)明通過以下的技術方案來實現(xiàn)：
一種基于量子點微球和抗生素的金黃色葡萄球菌快速層析試紙條，其構建方法如下：
1)抗生素-BSA偶聯(lián)物的制備；
2)量子點微球的制備；
3)免疫熒光微球的制備；
4)試紙條的設計和組裝；
5)樣品檢測。
進一步的，步驟1)所述抗生素可以為萬古霉素、環(huán)丙沙星中的一種。
優(yōu)選的，本發(fā)明所述基于量子點微球和抗生素的金黃色葡萄球菌快速層析試紙條，其構建方法如下：
1)抗生素-BSA偶聯(lián)物的制備：采用經典EDC/NHS化學反應方法，將抗生素與BSA偶聯(lián)，偶聯(lián)蛋白用AKTAprimeTM protein purification system純化，用于制備檢測線；
2)量子點微球的制備：以聚(苯乙烯/丙烯酰胺)納米球為載體，通過在有機溶劑中溶脹和超聲處理將CdSe/ZnS量子點包埋在納米球上；
3)免疫熒光微球的制備：將制備好的量子點微球調節(jié)pH值后，與金黃色葡萄球菌的抗體通過EDC/NHS反應偶聯(lián)；
4)試紙條的設計和組裝：
試紙條包括三個部分：樣品墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，硝酸纖維素膜上預先包被抗生素-BSA偶聯(lián)物和羊抗鼠二抗，分別形成檢測線(T線)和質控線(C線)；
5)樣品檢測：
金黃色葡萄球菌樣品與免疫熒光微球混合、孵育一段時間后，取一定體積溶液滴加到試紙條上，反應一段時間后，借助熒光讀卡儀完成樣品的檢測。
進一步的，步驟3)所述熒光微球為量子點微球，其上面的標記物為金黃色葡萄球菌單抗。
進一步的，步驟4)所述試紙條上T線固定的是抗生素-BSA偶聯(lián)物。
優(yōu)選的，具體包括如下的步驟：
1)抗生素-BSA偶聯(lián)物制備：將50mg抗生素和200mg BSA加入500μL PBS(10mM，pH 7.0)中溶解后繼續(xù)加入200mg EDC和NHS的混合物，室溫反應2h；加入200mg甘氨酸，孵育30min，進行封閉處理；接著用20KD透析袋在PBS中透析3天，最后用PEG 20000濃縮，制得抗生素-BSA偶聯(lián)物；
2)量子點微球的制備：將2mL肼處理過的聚(苯乙烯/丙烯酰胺)溶液和3mg CdSe/ZnS量子點加入體積比為5：95的氯仿/丁醇溶劑中混勻、溶脹，超聲處理60min后，用丁醇和PBS(10mM，pH 7.0)離心洗滌5次(2790g，5min)，最后重懸在2mL PBS中，制得羧基化的量子點微球；
3)免疫熒光微球制備：將500μL步驟2)制得的羧基化量子點微球加入500μL溶有50mM EDC和50mM NHS的PBS溶液中活化處理30min后，用PBS離心洗滌2次等體積重懸；接著，繼續(xù)加入1mg金黃色葡萄球菌單抗，室溫輕微振蕩反應4h后，用含1％BSA的PBS離心洗滌兩次，重懸在500μL PBS中，最后4度保存；
4)試紙條的設計與組裝：T線用抗生素-BSA偶聯(lián)物劃線，濃度為0.5mg/mL，C線用羊抗鼠二抗劃線，濃度為0.3mg/mL，劃線速度均為1μL/cm，37度烘干2小時后干燥保存；
5)樣品檢測：將50μL金黃色葡萄球菌樣品、50μL免疫量子點熒光微球加入400μL PBS(10mM，pH 7.0)中，室溫混合反應30min后，取60μL滴加到試紙條上，5min后用便攜式量子點熒光檢測儀讀數。
優(yōu)選的，步驟1)與BSA偶聯(lián)時，抗生素與BSA的質量比為1:4，具體的質量分別為50和200mg。
優(yōu)選的，步驟2)所述合成量子點微球的納米載體為聚(苯乙烯/丙烯酰胺)納米球，合成的量子點微球粒徑為80nm。
優(yōu)選的，步驟3)制備免疫量子點熒光微球的金黃色葡萄球菌單抗質量為1mg。
優(yōu)選的，步驟4)所述試紙條上，T線抗生素-BSA偶聯(lián)物濃度為0.5mg/mL，C線羊抗鼠二抗劃線濃度為0.3mg/mL，劃線速度均為1μL/cm。
優(yōu)選的，所述用于檢測的樣品體積為60μL。
進一步的，本發(fā)明所述方法不局限于金黃色葡萄球菌的檢測，可根據待檢測微生物的不同，調整抗生素與抗體種類。
其中，量子點微球表面修飾有抗體，其和抗生素均能與金黃色葡萄球菌結合，形成夾心結構實現(xiàn)檢測。本發(fā)明中由于采用抗生素捕獲金黃色葡萄球菌，因此檢測只需一個單抗，這在一定程度大大降低了檢測成本(常規(guī)抗生素價格遠低于抗體)。此外，由于采用量子點微球，一個球體含有很多個量子點，不僅抗體的標記效率有所提高、成本有所降低，而且靈敏度比常規(guī)單個量子點的熒光強很多倍。
本發(fā)明旨在利用量子點微球穩(wěn)定性好、熒光信號強、抗體標記效率高等優(yōu)勢，以及低成本小分子抗生素與金黃色葡萄球菌的結合作用，構建一種可以現(xiàn)場、簡單、快速、高靈敏檢測金黃色葡萄球菌的夾心快速層析試紙條，其檢測限可低至100CFU mL-1；該夾心法利用細菌表面兩個完全不同的結合位點，可大大提高檢測的特異性，同時，小分子抗生素的使用只需采用一種抗體，檢測成本可以大幅度降低；量子點微球的使用，不僅因為聚合物包裹材料穩(wěn)定性提高，而且一個微球由很多個量子點組成，可以實現(xiàn)熒光信號的指數級放大，大幅度提高檢測靈敏度；通過將樣品與抗體溶液室溫孵育30min即可借助便攜式量子點熒光檢測儀進行檢測，整個檢測時間短，約為40min。本發(fā)明中提供的檢測方法具有操作簡單、成本低、靈敏度高、通用等特點；同時試紙條的構建過程和使用過程不需要依賴大型儀器以及專業(yè)的操作人員，可廣泛用于資源匱乏的農村以及發(fā)展中國家的現(xiàn)場定量檢測。
具體實施方式
下面通過具體的實施例對本發(fā)明的技術方案進行詳細的說明，但是本發(fā)明的范圍不受這些實施例的限制。
實施例1
一種基于量子點微球和抗生素的金黃色葡萄球菌快速層析試紙條的構建方法，包括如下的步驟：
1)萬古霉素-BSA偶聯(lián)物制備：將50mg萬古霉素和200mg BSA加入500μL PBS(10mM，pH 7.0)中溶解后繼續(xù)加入200mg EDC和NHS的混合物，室溫反應2h；加入200mg甘氨酸，孵育30min，進行封閉處理；接著用20KD透析袋在PBS中透析3天，最后用PEG 20000濃縮，制得萬古霉素-BSA偶聯(lián)物；
2)量子點微球的制備：將2mL肼處理過的聚(苯乙烯/丙烯酰胺)溶液和3mg CdSe/ZnS量子點加入體積比為5：95的氯仿/丁醇溶劑中混勻、溶脹，超聲處理60min后，用丁醇和PBS(10mM，pH 7.0)離心洗滌5次(2790g，5min)，最后重懸在2mL PBS中，制得羧基化的量子點微球；
3)免疫熒光微球制備：將500μL步驟(2)制得的羧基化量子點微球加入500μL溶有50mM EDC和50mM NHS的PBS溶液中活化處理30min后，用PBS離心洗滌2次等體積重懸；接著，繼續(xù)加入1mg金黃色葡萄球菌單抗，室溫輕微振蕩反應4h后，用含1％BSA的PBS離心洗滌兩次，重懸在500μL PBS中，最后4度保存；
4)試紙條的設計與組裝：T線用萬古霉素-BSA偶聯(lián)物劃線，濃度為0.5mg/mL，C線用羊抗鼠二抗劃線，濃度為0.3mg/mL，劃線速度均為1μL/cm，37度烘干2小時后干燥保存；
5)樣品檢測：將50μL金黃色葡萄球菌標準品樣品、50μL免疫量子點熒光微球加入400μL PBS(10mM，pH 7.0)中，室溫混合反應30min后，取60μL滴加到試紙條上，5min后用便攜式量子點熒光檢測儀讀數。
實施例2
一種基于量子點微球和抗生素的金黃色葡萄球菌快速層析試紙條的構建方法，包括如下的步驟：
1)環(huán)丙沙星-BSA偶聯(lián)物制備：將50mg環(huán)丙沙星和200mg BSA加入500μL PBS(10mM，pH 7.0)中溶解后繼續(xù)加入200mg EDC和NHS的混合物，室溫反應2h；加入200mg甘氨酸，孵育30min，進行封閉處理；接著用20KD透析袋在PBS中透析3天，最后用PEG 20000濃縮，制得環(huán)丙沙星-BSA偶聯(lián)物；
2)量子點微球的制備：將2mL肼處理過的聚(苯乙烯/丙烯酰胺)溶液和3mg CdSe/ZnS量子點加入體積比為5：95的氯仿/丁醇溶劑中混勻、溶脹，超聲處理60min后，用丁醇和PBS(10mM，pH 7.0)離心洗滌5次(2790g，5min)，最后重懸在2mL PBS中，制得羧基化的量子點微球；
3)免疫熒光微球制備：將500μL步驟(2)制得的羧基化量子點微球加入500μL溶有50mM EDC和50mM NHS的PBS溶液中活化處理30min后，用PBS離心洗滌2次等體積重懸；接著，繼續(xù)加入1mg金黃色葡萄球菌單抗，室溫輕微振蕩反應4h后，用含1％BSA的PBS離心洗滌兩次，重懸在500μL PBS中，最后4度保存；
4)試紙條的設計與組裝：T線用環(huán)丙沙星-BSA偶聯(lián)物劃線，濃度為0.5mg/mL，C線用羊抗鼠二抗劃線，濃度為0.3mg/mL，劃線速度均為1μL/cm，37度烘干2小時后干燥保存；
5)樣品檢測：將50μL金黃色葡萄球菌標準品樣品、50μL免疫量子點熒光微球加入400μL PBS(10mM，pH 7.0)中，室溫混合反應30min后，取60μL滴加到試紙條上，5min后用便攜式量子點熒光檢測儀讀數。
需要指出的是，以上的實施例只是對本發(fā)明的解釋，并非是對發(fā)明的限定，在不違背本發(fā)明的精神的情況下，本發(fā)明可以作任何形式的修改，例如抗生素和抗體種類的變化、熒光微球納米材料種類以及其表面抗體修飾方法的變化都應在本發(fā)明技術方案保護范圍之內。