本發(fā)明屬于生物工程和檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種雞白痢沙門氏菌抗體乳膠凝集負(fù)篩選檢測試劑盒，同時涉及該檢測試劑盒中InvJ重組蛋白致敏乳膠試劑和SopA C端重組蛋白致敏乳膠試劑的制備方法，還涉及該試劑盒在檢測雞白痢沙門氏菌感染抗體中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

沙門氏菌具有多種血清型，可感染雞群的主要有雞白痢沙門氏菌、腸炎沙門氏菌等血清型。其中雞白痢(Pullorum Disease,PD)是由雞白痢沙門氏菌(SG)引起的一類傳染疾病，是目前危害養(yǎng)雞業(yè)的主要傳染病之一。雞白痢沙門氏菌可垂直傳播和水平傳播，對雛雞危害很大，感染雛雞表現(xiàn)為不吃飼料，怕冷，身體蜷縮，呼吸困難，精神沉郁或昏睡，排白色粘稠或淡黃、淡綠色稀便，肛門有時被硬結(jié)的糞塊封閉，可引起較高的死亡率。成年雞感染較少有臨床癥狀，少數(shù)感染嚴(yán)重的病雞表現(xiàn)精神萎靡，稀便，出現(xiàn)肝臟、脾臟腫大。產(chǎn)蛋雞可見卵巢萎縮，卵子變性，病雞產(chǎn)蛋停止。由于該病可水平和垂直傳播，可引起雛雞大面積死亡，難于根治，給養(yǎng)雞業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。

目前的防控策略為凈化，通過淘汰抗體陽性的種雞，在雞場中凈化雞白痢沙門氏菌，以達(dá)到防控的目的。因此高效的抗體檢測方法對雞白痢凈化具有關(guān)鍵的作用。目前主要采取全血或血清玻板凝集試驗，其抗原成分為滅活的全菌，我國已有用于檢測雞白痢的平板染色抗原產(chǎn)品，但滅活的全菌作為抗原在實際應(yīng)用中受制備種子菌批次、生長狀態(tài)和生產(chǎn)工藝等影響，可引起由于抗原成分不穩(wěn)定而引起的非特異性反應(yīng)，使得檢測存在假陽性和假陰性，導(dǎo)致雞白痢陽性雞只淘汰不準(zhǔn)確，給養(yǎng)殖者造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失，因此亟需一種可以更準(zhǔn)確高效鑒定雞白痢沙門氏菌感染的檢測方法。

常見感染雞群的沙門氏菌包括了雞白痢沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌等多個血清型，其中雞白痢沙門氏菌由于基因退化，導(dǎo)致其相比其它血清型沙門氏菌宿主單一。表面蛋白InvJ是沙門氏菌中高度保守的特異性蛋白之一。SopA為分泌蛋白，通過對多種血清型沙門氏菌的基因序列分析，我們發(fā)現(xiàn)sopA基因在沙門氏菌多種血清型中比較保守，但是特殊的是在所有雞白痢沙門氏菌中，SopA基因中間有一個堿基發(fā)生突變，產(chǎn)生了終止密碼子，導(dǎo)致雞白痢沙門氏菌不能表達(dá)SopA蛋白C端，因此SopA蛋白C端可作為準(zhǔn)確區(qū)分雞白痢沙門氏菌與其它血清型沙門氏菌感染的負(fù)篩選診斷靶標(biāo)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是在于提供了一種雞白痢抗體乳膠凝集負(fù)篩選檢測試劑盒，通過沙門氏菌表面抗原InvJ重組蛋白致敏乳膠試劑和分泌蛋白SopA C端重組蛋白致敏乳膠試劑的組合，用于雞白痢抗體負(fù)篩選，重復(fù)性好，敏感性高。

本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種雞白痢抗體乳膠凝集負(fù)篩選檢測試劑盒的制備方法，優(yōu)化了沙門氏菌表面蛋白InvJ重組蛋白致敏乳膠試劑和沙門氏菌分泌蛋白SopA C端重組蛋白致敏乳膠試劑的制備方法，所建立的制備方法偶聯(lián)效率高，產(chǎn)品凝集效果好。

本發(fā)明還有一個目的是在于提供了一種雞白痢抗體乳膠凝集負(fù)篩選檢測試劑盒在檢測雞白痢沙門氏菌感染抗體中的應(yīng)用，與現(xiàn)有的全血平板凝集檢測方法相比，特異性強，重復(fù)性好，敏感性高。

為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種雞白痢沙門氏菌抗體乳膠凝集負(fù)篩選檢測試劑盒，它包括沙門氏菌表面抗原InvJ重組蛋白致敏乳膠試劑和分泌蛋白SopA C端重組蛋白致敏乳膠試劑，所述的InvJ重組蛋白致敏乳膠試劑是由水溶性碳二亞胺將原核表達(dá)和純化后的沙門氏菌表面抗原InvJ重組蛋白共價偶聯(lián)到羧化乳膠顆粒的表面而得，所述的SopA C端重組蛋白致敏乳膠試劑是由水溶性碳二亞胺將原核表達(dá)和純化后沙門氏菌分泌蛋白SopA C端重組蛋白共價偶聯(lián)到羧化乳膠顆粒的表面而得。

一種雞白痢沙門氏菌抗體乳膠凝集負(fù)篩選檢測試劑盒的制備方法：

1、沙門氏菌表面抗原InvJ重組蛋白致敏乳膠試劑的制備方法，其步驟是：

A、將1mL 10wt％的乳膠原液分別用碳酸鹽緩沖液和磷酸鹽緩沖液離心洗滌后，用0.625mL 0.01M磷酸緩沖鹽溶液重懸羧化乳膠；

B、加入0.625mL 2wt％的水溶性碳二亞胺，37℃水平搖動3h，離心棄上清，用0.01M硼酸鹽緩沖液洗滌沉淀后將羧化乳膠重懸至1wt％；

C、在上述羧化乳膠溶液中加入等體積0.1125mg/mL的重組InvJ/His-tag融合蛋白溶液進行偶聯(lián)，37℃水平水平搖動6h；

D、偶聯(lián)結(jié)束后用0.05mL 0.1M甘氨酸(用硼酸鹽緩沖液配置)室溫緩慢終止30min；離心，沉淀用1mL1wt％的BSA溶液封閉后，懸浮于0.5mL儲存液(含0.01M磷酸鹽緩沖液、5％甘油、0.01％牛血清白蛋白、0.1％疊氮鈉)中保存，制得InvJ重組蛋白致敏乳膠試劑。

2、沙門氏菌分泌蛋白SopA C端重組蛋白致敏乳膠試劑的制備方法，其步驟是：

A、將1mL 10wt％的乳膠原液分別用碳酸鹽緩沖液和磷酸鹽緩沖液離心洗滌后，用0.625mL 0.01M磷酸緩沖鹽溶液重懸羧化乳膠；

B、加入0.625mL 2wt％的水溶性碳二亞胺，37℃水平搖動3h，離心棄上清，用0.01M硼酸鹽緩沖液洗滌沉淀后將羧化乳膠重懸1wt％；

C、在上述羧化乳膠溶液中加入等體積0.225mg/mL的重組SopA-C/His-tag融合蛋白溶液進行偶聯(lián)，37℃水平水平搖動6h；

D、偶聯(lián)結(jié)束后用0.05mL 0.1M甘氨酸(用硼酸鹽緩沖液配置)室溫緩慢終止30min；離心，沉淀用1mL1wt％的BSA溶液封閉后，懸浮于0.5mL儲存液(含0.01M磷酸鹽緩沖液、5％甘油、0.01％牛血清白蛋白、0.1％疊氮鈉)中保存，制得SopA C端重組蛋白致敏乳膠試劑。

一種雞白痢沙門氏菌抗體乳膠凝集負(fù)篩選檢測試劑盒在檢測雞白痢沙門氏菌感染抗體中的應(yīng)用，其方法是：

A、采樣與檢測：采集待檢雞群靜脈血，分離血清；吸取2份10μL待檢血清樣品滴于載玻片上，分別加入等體積的InvJ重組蛋白致敏乳膠試劑和SopA C端重組蛋白致敏乳膠試劑，攪拌均勻后搖動30秒，觀察檢測結(jié)果；陽性和陰性對照血清的處理方法與樣品相同；

B、分別對InvJ蛋白乳膠凝集試驗和SopA C端蛋白乳膠凝集試驗進行判斷：在陽性對照血清凝集程度為100％凝集(++++)，陰性對照血清無凝集現(xiàn)象時，對檢測樣品進行判斷，檢測樣品出現(xiàn)50％凝集(++)及以上凝集時判為陽性結(jié)果，否則判為陰性，參照下表對檢測結(jié)果進行判定：

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點及有益效果：

1、本發(fā)明制備了沙門氏菌表面蛋白InvJ重組蛋白致敏乳膠試劑，該致敏乳膠試劑可通過乳膠凝集試驗對所有血清型沙門氏菌感染抗體進行快速檢測，制備了沙門氏菌分泌蛋白SopA C端重組蛋白致敏乳膠試劑，該致敏乳膠試劑可通過乳膠凝集試驗對雞白痢沙門氏菌以外其它血清型沙門氏菌感染抗體進行快速檢測，將2者組合并組裝為雞白痢抗體乳膠凝集負(fù)篩選檢測試劑盒，可以用于雞白痢抗體負(fù)篩選，為首創(chuàng)。

2、現(xiàn)有雞白痢玻板凝集試驗利用全菌滅活制備抗原，但滅活的全菌作為抗原在實際應(yīng)用中受制備種子菌批次、生長狀態(tài)和生產(chǎn)工藝等影響，可引起由于抗原成分不穩(wěn)定而引起的非特異性反應(yīng)，使得檢測存在假陽性和假陰性檢測。本試劑盒運用蛋白組合作為抗原，相比現(xiàn)有技術(shù)具有抗原穩(wěn)定、特異性強的優(yōu)點，而且可同時檢測其它血清型沙門氏菌感染，擺脫了現(xiàn)有雞白痢凝集抗原生產(chǎn)菌種傳代可能導(dǎo)致的變異和不穩(wěn)定性。

3、此外本發(fā)明對沙門氏菌表面蛋白InvJ重組蛋白致敏乳膠試劑和沙門氏菌分泌蛋白SopA C端重組蛋白致敏乳膠試劑的制備方法進行了探索和優(yōu)化，敏感性高，可檢測1：256倍稀釋的血清。

附圖說明

圖1為InvJ基因PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中M為DNA Marker，1、2為InvJ基因的擴增產(chǎn)物。

圖2為重組載體pET-28a(+)-InvJ雙酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中M為DNA Marker，1、2為重組載體pET-28a(+)-InvJ經(jīng)BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切的產(chǎn)物。

圖3為SopA C端基因PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中M為DNA Marker，1、2為SopA C端基因的擴增產(chǎn)物。

圖4為重組載體pET-32a(+)-SopA雙酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中M為DNA Marker，1、2為重組載體pET-32a(+)-SopA經(jīng)BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切的產(chǎn)物。

圖5為表達(dá)的InvJ/His-tag重組蛋白的SDS-PAGE凝膠電泳圖，其中M為蛋白分子量Marker，1為含空質(zhì)粒pET-28a(+)的BL21(DE3)誘導(dǎo)后經(jīng)超聲破碎后收集的上清，2為含空質(zhì)粒pET-28a(+)的BL21(DE3)誘導(dǎo)后經(jīng)超聲破碎后收集的沉淀，3為含重組質(zhì)粒pET-28a(+)-InvJ的BL21(DE3)誘導(dǎo)后經(jīng)超聲破碎后收集的上清，4為含重組質(zhì)粒pET-28a(+)-InvJ的BL21(DE3)誘導(dǎo)后經(jīng)超聲破碎后收集的沉淀。

圖6為表達(dá)的SopA-C/His-tag重組蛋白的SDS-PAGE凝膠電泳圖，其中M為蛋白分子量Marker，1為含空質(zhì)粒pET-32a(+)的BL21(DE3)誘導(dǎo)后經(jīng)超聲破碎后收集的上清，2為含空質(zhì)粒pET-32a(+)的BL21(DE3)誘導(dǎo)后經(jīng)超聲破碎后收集的沉淀，3為含重組質(zhì)粒pET-32a(+)-SopA C端的BL21(DE3)誘導(dǎo)后經(jīng)超聲破碎后收集的上清，4為含重組質(zhì)粒pET-32a(+)-SopA C端的BL21(DE3)誘導(dǎo)后經(jīng)超聲破碎后收集的沉淀。

圖7為InvJ/His-tag重組蛋白乳膠凝集檢測的結(jié)果判斷示意圖。

圖8為SopA-C/His-tag重組蛋白乳膠凝集檢測的結(jié)果判斷示意圖。

圖9為雞白痢抗體乳膠凝集負(fù)篩選檢測試劑盒檢測標(biāo)準(zhǔn)陽性血清(雞白痢沙門氏菌陽性血清、腸炎沙門氏菌陽性血清和大腸桿菌病陽性血清)的結(jié)果圖。

具體實施方式

下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細(xì)的描述。

實施例1：

沙門氏菌表面蛋白InvJ與分泌蛋白SopA C端重組蛋白的制備方法

一、沙門氏菌表面蛋白InvJ重組蛋白的制備方法，其步驟是：

1、InvJ基因的克隆

腸炎沙門氏菌InvJ重組蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示(即登錄號為：KOX81849.1的InvJ第1位至第336位氨基酸序列)，其編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示(即登錄號為LIHI01000011.1的InvJ基因第1位至第1008位核苷酸序列)。

根據(jù)InvJ基因序列設(shè)計引物：上游引物InvJ F：5’-CGCGGATCCATGGGCGATGTGTCAGCTGT-3’，劃線部分為BamHⅠ位點；下游引物InvJ R：5’-CCCAAGCTTGGCGTCATCCTCCTCGCA-3’，劃線部分為Hind Ⅲ位點。

提取腸炎沙門氏菌(CVCC 3375，購自中國菌種保藏中心)的基因組DNA，以該基因組DNA為模板，采用上述引物PCR擴增InvJ基因。PCR反應(yīng)體系為：(primerSTAR 12.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，ddH₂O 8.5μL，模板2μL)。將PCR產(chǎn)物進行1％濃度瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果如圖1所示，獲得了一條約1026bp的特異性DNA條帶，與目標(biāo)DNA片段大小相符。將PCR產(chǎn)物用OMGEA DNA凝膠回收試劑盒進行切膠回收。

2、重組表達(dá)載體的構(gòu)建

將回收純化的InvJ基因片段和質(zhì)粒pET-28a(+)(購自優(yōu)寶生物)同時用BamH Ⅰ/Hind Ⅲ雙酶切，切膠回收后，將雙酶切的基因片段和質(zhì)粒用T₄連接酶進行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆。以InvJ F和InvJ R為引物，菌液PCR驗證成功后，提取質(zhì)粒，進行BamH Ⅰ/HindⅢ雙酶切鑒定，結(jié)果如圖2所示，質(zhì)粒雙酶切后得到兩條DNA片段，其中一條DNA片段與1026bp的目的DNA片段大小相符。將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒pET-28a(+)-InvJ送上海生工生物有限公司進行測序，測序結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒中含有目的基因InvJ，且讀碼框正確，說明重組表達(dá)載體pET-28a(+)-InvJ構(gòu)建成功。

3、重組蛋白的表達(dá)

將空載體pET-28a(+)和重組表達(dá)載體pET-28a(+)-InvJ轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主菌E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞(購自Takara公司)，篩選陽性克隆。將單菌落接種于含Kan(100μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)過夜，次日取菌液按體積比1:100轉(zhuǎn)接種于5mL含Kan(100μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀＝0.4時，加入IPTG(異丙基硫代半乳糖苷終濃度為1mM)誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)4小時后收集菌液，4℃、13000r/min離心5min，取上清，菌體沉淀用1mL的0.01M PBS緩沖液重懸，超聲波(冰浴)間歇破碎菌體，4℃、10000r/min離心10min，取上清備用；沉淀用500μL 0.01M PBS緩沖液溶解。

4、SDS-PAGE鑒定重組蛋白

取上述處理好的上清和溶解的沉淀，加入5×SDS上樣緩沖液，煮沸5min，冰浴2min，進行SDS-PAGE凝膠電泳(濃縮膠5％，分離膠10％)，電泳后經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色，乙醇-冰醋酸脫色液脫色。結(jié)果如圖5所示，空載體pET-28a(+)轉(zhuǎn)化菌株BL21用IPTG誘導(dǎo)時沒有特異性蛋白條帶出現(xiàn)；而pET-28a(+)-InvJ轉(zhuǎn)化菌株BL21用IPTG誘導(dǎo)后在約40kDa處出現(xiàn)一條特異性蛋白條帶，與重組InvJ/His-tag融合蛋白大小相符，而且結(jié)果顯示，重組InvJ/His-tag融合蛋白同時存在于經(jīng)超聲破碎后收集的上清和沉淀中。

5、重組InvJ/His-tag融合蛋白的純化

收集經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液，離心集菌。將收集的菌液經(jīng)超聲波處理，12000rpm離心10min，收集沉淀并用0.01M PBS洗滌菌體，然后用1×Binding Buffer重懸菌體，將菌液過0.45μm濾器，按照Merck Millipore公司His*Bind Purification Kit說明書填柱材料，用3倍體積雙蒸水洗滌后用3倍體積的結(jié)合緩沖液平衡，之后以一定的流速將含有目的蛋白的緩沖液上樣。沒有結(jié)合的蛋白用洗滌緩沖液除去，最后用洗脫緩沖液洗脫，獲得純化的重組InvJ/His-tag融合蛋白。

二、沙門氏菌SopA C端重組蛋白的制備

腸炎沙門氏菌SopA C端重組蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示(即登錄號為AHW01691.1的SopA第448位至第782位氨基酸序列)，其編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示(即登錄號為CP007507.1的SopA基因第1342位至第2432位核苷酸序列)。

1、SopA C端基因的克隆

根據(jù)SopA C端基因序列設(shè)計引物，上游引物SopA F：5’-CGCGGATCCCGCATACTGCCTGTGTTGCTGGA-3’，劃線部分為BamH Ⅰ位點；下游引物SopA R：5’-CCCAAGCTTCAAAAAATGCATGGACTAAAACGGG-3’，劃線部分為Hind Ⅲ位點。

提取腸炎沙門氏菌(CVCC 3375，購自中國菌種保藏中心)基因組DNA，以該基因組DNA為模板，采用上述引物PCR擴增SopA基因。PCR反應(yīng)體系為：(primerSTAR 12.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，ddH₂O 8.5μL，模板2μL)將PCR產(chǎn)物進行1％濃度瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果如圖3所示，獲得了一條約1109bp的特異性DNA條帶，與目標(biāo)DNA片段大小相符。將PCR產(chǎn)物用OMGEA DNA凝膠回收試劑盒進行切膠回收。

2、重組表達(dá)載體的構(gòu)建

將回收純化的SopA基因片段和質(zhì)粒pET-32a(+)(購自優(yōu)寶生物)同時用BamH Ⅰ/Hind Ⅲ雙酶切，切膠回收后，將雙酶切的基因片段和質(zhì)粒用T₄連接酶進行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆。以SopA F和SopA R為引物，菌液PCR驗證成功后，提取質(zhì)粒，進行BamH Ⅰ/Hind Ⅲ雙酶切鑒定，結(jié)果如圖4所示，質(zhì)粒雙酶切后得到兩條DNA片段，其中一條DNA片段與1091bp的目的DNA片段大小相符。將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒pET-32a(+)-SopA送上海生工生物有限公司進行測序，測序結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒中含有目的基因InvJ，且讀碼框正確，說明重組表達(dá)載體pET-32a(+)-SopA構(gòu)建成功。

3、重組蛋白的表達(dá)

將空載體pET-32a(+)和重組表達(dá)載體pET-32a(+)-SopA轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主菌E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆。將單菌落接種于含Amp(100μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)過夜，次日取菌液按體積比1:100轉(zhuǎn)接種于5mL含Amp(100μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀＝0.4時，加入IPTG(終濃度為1mM)誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)8小時后收集菌液，4℃、13000r/min離心5min，取上清，菌體沉淀用1mL的0.01M PBS緩沖液重懸，超聲波(冰浴)間歇破碎菌體，4℃、10000r/min離心10min，取上清備用；沉淀用500μL 0.01M PBS緩沖液溶解。

4、SDS-PAGE鑒定重組蛋白

取上述處理好的上清和溶解的沉淀，加入5×SDS上樣緩沖液，煮沸5min，冰浴2min，進行SDS-PAGE凝膠電泳(濃縮膠5％，分離膠10％)，電泳后經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色，乙醇-冰醋酸脫色液脫色。結(jié)果如圖6所示，空載體pET-32a(+)轉(zhuǎn)化菌株BL21用IPTG誘導(dǎo)時沒有特異性蛋白條帶出現(xiàn)；pET-32a(+)-SopA轉(zhuǎn)化BL21(DE3)未用IPTG誘導(dǎo)后也沒有特異性蛋白條帶出現(xiàn)，而pET-32a(+)-SopA轉(zhuǎn)化菌株BL21用IPTG誘導(dǎo)后在約55kDa處出現(xiàn)一條特異性蛋白條帶，與重組SopA/His-tag融合蛋白大小相符，此外，由于重組SopA/His-tag融合蛋白主要存在于經(jīng)超聲破碎后收集的沉淀中，說明重組SopA/His-tag融合蛋白在菌體中是以不溶的包涵體形式存在。

5、重組SopA(C)/His-tag融合蛋白的純化

收集誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液，離心集菌。將收集的菌液經(jīng)超聲波處理，12000rpm離心10min，收集包涵體。將包涵體用洗滌緩沖液(20mM Tris，1mM EDTA，1％Triton-100，pH8.5)洗滌后溶解于變性緩沖液(8M尿素)中，攪拌過夜，離心收集變性后的包涵體。將溶解后的包涵體溶液過0.45μm濾器，按照Merck Millipore公司His*Bind Purification Kit說明書填柱材料，用3倍體積雙蒸水洗滌后用3倍體積的結(jié)合緩沖液平衡，之后以一定的流速將含有目的蛋白的緩沖液上樣。沒有結(jié)合的蛋白用洗滌緩沖液除去，最后用洗脫緩沖液洗脫，獲得目的蛋白。將純化后的變性蛋白裝入透析袋中依次浸沒在6M尿素緩沖液、4M尿素緩沖液、2M尿素緩沖液、0.01M PBS緩沖液中透析12h中進行復(fù)性。重新折疊后的蛋白在Tris-HCl緩沖液中以12000rpm離心15min，去除不溶蛋白，獲得重組SopA(C)/His-tag融合蛋白。

實施例2：

沙門氏菌表面蛋白InvJ與分泌蛋白SopA C端重組蛋白致敏乳膠試劑的制備方法優(yōu)化

沙門氏菌表面蛋白InvJ與分泌蛋白SopA C端重組蛋白分別作為抗原制備致敏乳膠試劑，再通過乳膠凝集試驗負(fù)篩選檢測雞白痢抗體。

1、乳膠凝集試驗方法及結(jié)果判定

在潔凈的載玻片上滴約10μL待檢樣品溶液，再加約10μL致敏乳膠試劑，攪拌混勻，搖動玻片，3分鐘內(nèi)在黑色背景下觀察，同時設(shè)置陽性對照和陰性對照。++++為100％乳膠凝集，全部凝集，成絮狀團塊，液體清亮；+++為75％乳膠凝集成小的顆粒，液體稍有混濁；++為50％乳膠凝集成較細(xì)顆粒，液體較混濁；+為少許乳膠凝集成顆粒，液體混濁；－為不凝集，液滴呈原有的均勻乳狀；以出現(xiàn)++以上者判為陽性。

圖7、圖8分別顯示了InvJ乳膠凝集檢測和SopA C端乳膠凝集檢測的結(jié)果判斷示意圖

2、沙門氏菌表面蛋白InvJ重組蛋白致敏乳膠試劑的制備方法優(yōu)化

取1mL 10wt％乳膠原液于離心管中，用1mL 0.1M的碳酸鹽緩沖液(pH9.6)離心洗滌3次，再用1mL 0.01M PBS(pH 7.4)離心洗滌3次，用0.625mL 0.01M PBS(pH7.4)重懸，逐滴加入0.625mL 2wt％EDC(水溶性碳二亞胺)，37℃低速水平搖動3h后，離心棄上清，沉淀用1mL 0.01M BBS(pH8.0)離心洗滌3次后重懸至不同濃度，再加入不同濃度的重組InvJ/His-tag融合蛋白溶液，37℃低速水平搖動不同時間后，加入0.05mL 0.1M甘氨終止反應(yīng)，離心收集上清進行蛋白測定，沉淀用1mL不同濃度的BSA溶液封閉后，懸浮于0.5mL儲存液(含0.01M磷酸鹽緩沖液、5％甘油、0.01％牛血清白蛋白、0.1％疊氮鈉)中保存，制備完成重組InvJ/His-tag融合蛋白致敏乳膠試劑。

(1)羧化乳膠最佳偶聯(lián)濃度的選擇

將羧化乳膠用BBS重懸至不同濃度(3wt％、2wt％、1wt％、0.5wt％、0.1wt％)后與重組InvJ/His-tag融合蛋白偶聯(lián)，制備致敏乳膠試劑。再以該致敏乳膠試劑與雞白痢陽性血清進行乳膠凝集試驗，通過測定偶聯(lián)效率和凝集效果確定羧化乳膠的最佳偶聯(lián)濃度。結(jié)果顯示，當(dāng)羧化乳膠濃度為1％時，偶聯(lián)效率最高，凝集效果最好。

表1 羧化乳膠最佳偶聯(lián)濃度的選擇

備注：—乳膠不凝集；+25％乳膠凝集；++50％乳膠凝集；+++75％乳膠凝集；++++全部乳膠凝集

(2)沙門氏菌表面蛋白InvJ重組蛋白最佳偶聯(lián)濃度的選擇

將羧化乳膠與不同濃度(0.9、0.45、0.225、0.1125、0.05625、0.028mg/mL)的重組InvJ/His-tag融合蛋白偶聯(lián)，制備致敏乳膠試劑，再以該致敏乳膠試劑與雞白痢陽性血清進行乳膠凝集試驗，通過測定偶聯(lián)效率(偶聯(lián)效率(％)＝(蛋白的初始加入量－剩余上清液中的蛋白量)/蛋白初始加入量×100％)和凝集效果選擇重組蛋白最佳偶聯(lián)濃度。結(jié)果顯示，當(dāng)沙門氏菌表面蛋白InvJ重組蛋白濃度為0.1125mg/mL時，與羧化乳膠的偶聯(lián)效率較高，凝集效果最好。

表2 表面蛋白InvJ重組蛋白最佳偶聯(lián)濃度的選擇

(3)封閉液最佳濃度的選擇

將偶聯(lián)反應(yīng)終止后離心得到的沉淀用不同濃度(0wt％、0.01wt％、0.1wt％、1wt％)的BSA溶液封閉，制備致敏乳膠試劑，再以該致敏乳膠試劑與雞白痢陽性血清進行乳膠凝集試驗，通過觀察凝集效果選擇封閉液最佳濃度。結(jié)果顯示，當(dāng)BSA溶液的濃度為1wt％時，凝集效果最好。

表3 封閉液最佳濃度的選擇

備注：—乳膠不凝集；+25％乳膠凝集；++50％乳膠凝集；+++75％乳膠凝集；++++全部乳膠凝集

(4)最佳偶聯(lián)時間的選擇

將羧化乳膠用BBS重懸，加入重組InvJ/His-tag融合蛋白溶液，置水平搖床37℃低速水平搖動不同時間(2h、4h、6h、8h、10h)，制備致敏乳膠試劑，再以該致敏乳膠試劑與雞白痢陽性血清進行乳膠凝集試驗，通過測定偶聯(lián)效率和凝集效果選擇最佳偶聯(lián)時間。結(jié)果顯示，當(dāng)偶聯(lián)時間為6h時，偶聯(lián)效率較高，凝集效果最好。

表4 最佳偶聯(lián)時間的選擇

備注：—乳膠不凝集；+25％乳膠凝集；++50％乳膠凝集；+++75％乳膠凝集；++++全部乳膠凝集

3、沙門氏菌表面蛋白InvJ重組蛋白致敏乳膠試劑的質(zhì)量鑒定

(1)自凝性

將采用前述最佳條件制備的重組InvJ/His-tag融合蛋白致敏乳膠試劑，分別與PBS、BBS、生理鹽水進行乳膠凝集試驗，觀察致敏乳膠試劑是否發(fā)生自凝。結(jié)果顯示，重組InvJ/His-tag融合蛋白致敏乳膠試劑與PBS、BBS、生理鹽水反應(yīng)均呈陰性，即不發(fā)生自凝。

(2)特異性

將重組InvJ/His-tag融合蛋白致敏乳膠試劑分別與10種陽性血清(雞白痢沙門氏菌陽性血清、腸炎沙門氏菌陽性血清、禽傷寒沙門氏菌陽性血清、鼠傷寒沙門氏菌陽性血清、禽大腸桿菌病陽性血清、禽彎曲菌病陽性血清、禽巴氏桿菌病陽性血清、禽壞死性腸炎陽性血清、禽流感陽性血清、新城疫陽性血清)進行乳膠凝集試驗。結(jié)果顯示，重組InvJ/His-tag融合蛋白致敏乳膠試劑與雞白痢沙門氏菌陽性血清、腸炎沙門氏菌陽性血清、禽傷寒沙門氏菌陽性血清、鼠傷寒沙門氏菌陽性血清均產(chǎn)生明顯的凝集，而與禽大腸桿菌病陽性血清、禽彎曲菌病陽性血清、禽巴氏桿菌病陽性血清、禽壞死性腸炎陽性血清、禽流感陽性血清、新城疫陽性血清均不發(fā)生凝集，說明重組InvJ/His-tag融合蛋白致敏乳膠試劑具有良好的特異性。

(3)重復(fù)性

將同一批次的重組InvJ/His-tag融合蛋白致敏乳膠試劑保存于4℃，每月與雞白痢陽性血清進行乳膠凝集試驗，考察批內(nèi)重復(fù)性；將不同批次的重InvJ/His-tag融合蛋白致敏乳膠試劑，分別與雞白痢沙門氏菌感染陽性血清進行乳膠凝集試驗，考察批間重復(fù)性。結(jié)果顯示，同一批次制備的重組InvJ/His-tag融合蛋白致敏乳膠試劑在4個月內(nèi)均與雞白痢陽性血清保持很好的凝集；5批制備的重組InvJ/His-tag融合蛋白致敏乳膠試劑與與雞白痢陽性血清也均產(chǎn)生明顯的凝集；說明重組InvJ/His-tag融合蛋白致敏乳膠試劑具有較好的重復(fù)性。

(4)敏感性

將雞白痢陽性血清按1:2、1:4、1:8、1:16、l:64、1:128、1:256、1:512體積倍比稀釋，再與重組InvJ/His-tag融合蛋白致敏乳膠試劑進行乳膠凝集試驗，考察敏感性。結(jié)果顯示最低可檢測到稀釋倍數(shù)為1:256的雞白痢陽性血清，說明重組InvJ/His-tag融合蛋白致敏乳膠試劑具有較好的敏感性。

4、沙門氏菌分泌蛋白SopA C端重組蛋白致敏乳膠試劑的制備方法優(yōu)化

取1mL 10wt％乳膠原液于離心管中，用1mL 0.1M的碳酸鹽緩沖液(pH9.6)離心洗滌3次，再用1mL 0.01M PBS(pH 7.4)離心洗滌3次，用0.625mL 0.01M PBS(pH7.4)重懸，逐滴加入0.625mL 2wt％EDC(水溶性碳二亞胺)，37℃低速水平搖動3h后，離心棄上清，沉淀用1mL 0.01M BBS(pH8.0)離心洗滌3次后重懸至不同濃度，再加入不同濃度的重組InvJ/His-tag融合蛋白溶液，37℃低速水平搖動不同時間后，加入0.05mL 0.1M甘氨終止反應(yīng)，離心收集上清進行蛋白測定，沉淀用1mL不同濃度的BSA溶液封閉后，懸浮于0.5mL儲存液(含0.01M磷酸鹽緩沖液、5％甘油、0.01％牛血清白蛋白、0.1％疊氮鈉)中保存，制備完成重組SopA-C/His-tag融合蛋白致敏乳膠試劑。

(1)羧化乳膠最佳偶聯(lián)濃度的選擇

將羧化乳膠用BBS重懸至不同濃度(3wt％、2wt％、1wt％、0.5wt％、0.1wt％)后與重組SopA-C/His-tag融合蛋白偶聯(lián)，制備致敏乳膠試劑。再以該致敏乳膠試劑與雞白痢陽性血清進行乳膠凝集試驗，通過測定偶聯(lián)效率和凝集效果確定羧化乳膠的最佳偶聯(lián)濃度。結(jié)果顯示，當(dāng)羧化乳膠濃度為1％時，偶聯(lián)效率最高，凝集效果最好。

(2)沙門氏菌分泌蛋白SopA C端重組蛋白最佳偶聯(lián)濃度的選擇

將羧化乳膠與不同濃度(0.9、0.45、0.225、0.1125、0.05625、0.028mg/mL)的重組SopA-C/His-tag融合蛋白偶聯(lián)，制備致敏乳膠試劑，再以該致敏乳膠試劑與腸炎沙門氏菌陽性血清進行乳膠凝集試驗，通過測定偶聯(lián)效率和凝集效果選擇重組蛋白最佳偶聯(lián)濃度。結(jié)果顯示，當(dāng)?shù)鞍诐舛葹?.225mg/mL時，與羧化乳膠的偶聯(lián)效率較高，凝集效果最好。

表5 SopA C端重組蛋白最佳偶聯(lián)濃度的選擇

(3)封閉液最佳濃度的選擇

將偶聯(lián)反應(yīng)終止后離心得到的沉淀用不同濃度(0wt％、0.01wt％、0.1wt％、1wt％)的BSA溶液封閉，制備致敏乳膠試劑，再以該致敏乳膠試劑與腸炎沙門氏菌陽性血清進行乳膠凝集試驗，通過觀察凝集效果選擇封閉液最佳濃度。結(jié)果顯示，當(dāng)BSA溶液的濃度為1wt％時，凝集效果最好。

表6 封閉液最佳濃度的選擇

備注：—乳膠不凝集；+25％乳膠凝集；++50％乳膠凝集；+++75％乳膠凝集；++++全部乳膠凝集

(4)最佳偶聯(lián)時間的選擇

將羧化乳膠用BBS重懸，加入重組SopA-C/His-tag融合蛋白溶液，置水平搖床37℃低速水平搖動不同時間(2h、4h、6h、8h、10h)，制備致敏乳膠試劑，再以該致敏乳膠試劑與腸炎沙門氏菌陽性血清進行乳膠凝集試驗，通過測定偶聯(lián)效率和凝集效果選擇最佳偶聯(lián)時間。結(jié)果顯示，當(dāng)偶聯(lián)時間為6h時，偶聯(lián)效率較高，凝集效果最好。

表7 最佳偶聯(lián)時間的選擇

備注：—乳膠不凝集；+25％乳膠凝集；++50％乳膠凝集；+++75％乳膠凝集；++++全部乳膠凝集

5、沙門氏菌表面蛋白SopA C端重組蛋白致敏乳膠試劑的質(zhì)量鑒定

(1)自凝性

將采用前述最佳條件制備的重組SopA-C/His-tag融合蛋白致敏乳膠試劑，分別與PBS、BBS、生理鹽水進行乳膠凝集試驗，觀察致敏乳膠試劑是否發(fā)生自凝。結(jié)果顯示，重組SopA-C/His-tag融合蛋白致敏乳膠試劑與PBS、BBS、生理鹽水反應(yīng)均呈陰性，即不發(fā)生自凝。

(2)特異性

將重組SopA-C/His-tag融合蛋白致敏乳膠試劑分別與10種陽性血清(雞白痢沙門氏菌感染陽性血清、腸炎沙門氏菌感染陽性血清、禽傷寒沙門氏菌感染陽性血清、鼠傷寒沙門氏菌感染陽性血清、禽大腸桿菌病陽性血清、禽彎曲菌病陽性血清、禽巴氏桿菌病陽性血清、禽壞死性腸炎陽性血清、禽流感陽性血清、新城疫陽性血清)進行乳膠凝集試驗。結(jié)果顯示，重組SopA-C/His-tag融合蛋白致敏乳膠試劑與腸炎沙門氏菌陽性血清、禽傷寒沙門氏菌陽性血清、鼠傷寒沙門氏菌陽性血清均產(chǎn)生明顯的凝集，而與雞白痢沙門氏菌陽性血清、禽大腸桿菌病陽性血清、禽彎曲菌病陽性血清、禽巴氏桿菌病陽性血清、禽壞死性腸炎陽性血清、禽流感陽性血清、新城疫陽性血清均不發(fā)生凝集，說明重組SopA-C/His-tag融合蛋白致敏乳膠試劑具有良好的特異性，而且可以區(qū)分雞白痢沙門氏菌陽性血清與其它血清學(xué)型沙門氏菌陽性血清。

(3)重復(fù)性

將同一批次的重組SopA-C/His-tag融合蛋白致敏乳膠試劑保存于4℃，每月與腸炎沙門氏菌陽性血清進行乳膠凝集試驗，考察批內(nèi)重復(fù)性；將不同批次的重SopA-C/His-tag融合蛋白致敏乳膠試劑，分別與腸炎沙門氏菌陽性血清進行乳膠凝集試驗，考察批間重復(fù)性。結(jié)果顯示，同一批次制備的重組SopA-C/His-tag融合蛋白致敏乳膠試劑在4個月內(nèi)均與腸炎沙門氏菌陽性血清保持很好的凝集；5批制備的重組SopA-C/His-tag融合蛋白致敏乳膠試劑與與腸炎沙門氏菌陽性血清也均產(chǎn)生明顯的凝集；說明重組SopA-C/His-tag融合蛋白致敏乳膠試劑具有較好的重復(fù)性。

(4)敏感性

將腸炎沙門氏菌陽性血清按1:2、1:4、1:8、1:16、l:64、1:128、1:256、1:512體積倍比稀釋，再與重組SopA-C/His-tag融合蛋白致敏乳膠試劑進行乳膠凝集試驗，考察敏感性。結(jié)果顯示最低可檢測到稀釋倍數(shù)為1:256的腸炎沙門氏菌陽性血清，說明重組SopA-C/His-tagg融合蛋白致敏乳膠試劑具有較好的敏感性。

實施例3：

雞白痢抗體乳膠凝集負(fù)篩選檢測試劑盒的應(yīng)用

1、雞白痢抗體乳膠凝集負(fù)篩選檢測試劑盒的應(yīng)用方法

(1)采樣與檢測

采集待檢雞群靜脈血，分離血清；吸取2份10μL待檢血清樣品滴于載玻片上，分別加入等體積的InvJ重組蛋白致敏乳膠試劑和SopA C端重組蛋白致敏乳膠試劑，攪拌均勻后搖動30秒，觀察檢測結(jié)果。陽性和陰性對照血清的處理方法與樣品相同。

(2)結(jié)果判定

分別對InvJ蛋白乳膠凝集試驗和SopA C端蛋白乳膠凝集試驗進行判斷；在陽性對照血清凝集程度為100％凝集(++++)，陰性對照血清無凝集現(xiàn)象時，對檢測樣品進行判斷。檢測樣品出現(xiàn)50％凝集(++)及以上凝集時判為陽性結(jié)果，否則判為陰性。

分別獲得InvJ蛋白乳膠凝集試驗和SopA C端蛋白乳膠凝集試驗結(jié)果后，參考表8對檢測結(jié)果進行判定。

表8 雞白痢抗體乳膠凝集負(fù)篩選檢測試劑盒的結(jié)果判定

注：對于重新檢測仍然為InvJ蛋白乳膠凝集試驗陰性，SopA C端蛋白乳膠凝集試驗陽性的樣本，判斷為陰性。

2、雞白痢抗體乳膠凝集負(fù)篩選檢測試劑盒檢測標(biāo)準(zhǔn)陽性血清

用上述檢測方法分別檢測雞白痢沙門氏菌陽性血清、腸炎沙門氏菌陽性血清、大腸桿菌病陽性血清，檢測結(jié)果如圖9所示：雞白痢沙門氏菌陽性血清與InvJ的反應(yīng)為陽性，與SopA C端的反應(yīng)為陰性；腸炎沙門氏菌陽性血清與InvJ的反應(yīng)為陽性，與SopA C端的反應(yīng)也為陽性；大腸桿菌病陽性血清與InvJ和SopA C端的反應(yīng)均為陰性。檢測結(jié)果與預(yù)期一致。

3、雞白痢抗體乳膠凝集負(fù)篩選檢測試劑盒在臨床檢測中的應(yīng)用

(1)臨床樣品

2016年6月從湖北某家禽養(yǎng)殖場采集種雞血樣50份，血液自然凝固后，收集析出的血清。

(2)樣品檢測

每個樣品吸取2份10μL待檢血清樣品分別滴于載玻片上，分別加入等體積的InvJ重組蛋白致敏乳膠試劑和SopA C端蛋白致敏乳膠試劑，攪拌均勻后搖動30秒，觀察檢測結(jié)果。同時設(shè)陰陽性血清對照。

(3)檢測結(jié)果

經(jīng)檢測，4份血清的檢測結(jié)果為雞白痢抗體陽性，經(jīng)過細(xì)菌分離鑒定顯示這4只雞確實存在雞白痢沙門氏菌感染，需要立即進行淘汰處理。

實施例4：

雞白痢抗體乳膠凝集負(fù)篩選試驗與全血平板凝集試驗的效果比對

用雞白痢抗體乳膠凝集負(fù)篩選試驗與以滅活全菌作為抗原的全血平板凝集試驗同時檢測10份雞白痢沙門氏菌陽性血清，10份腸炎沙門氏菌陽性血清和10份陰性血清。雞白痢抗體負(fù)篩選乳膠凝集試劑盒檢測10份雞白痢陽性血清，與InvJ的反應(yīng)均為陽性，與SopA C端的反應(yīng)均為陰性，顯示10份血清均為雞白痢抗體陽性；檢測10份腸炎沙門氏菌陽性血清，與InvJ和SopA C端的反應(yīng)均為陽性，顯示10份血清均為沙門氏菌抗體陽性；檢測10份陰性血清均為陰性，檢測結(jié)果與血清的免疫背景完全相符；全血平板凝集試驗法檢測10份雞白痢陽性血清全為陽性，檢測10份腸炎沙門氏菌陽性血清，出現(xiàn)2份血清呈現(xiàn)雞白痢抗體陽性，陰性血清均為陰性。這說明該雞白痢抗體乳膠凝集負(fù)篩選檢測方法與現(xiàn)有以雞白痢沙門氏菌全菌制備抗原的全血平板凝集試驗相比，可更好的避免不同血清型沙門氏菌之間的交叉反應(yīng)，具有更高的特異性。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所

<120> 雞白痢抗體乳膠凝集負(fù)篩選檢測試劑盒及制備方法和應(yīng)用

<130> 雞白痢抗體乳膠凝集負(fù)篩選檢測試劑盒及制備方法和應(yīng)用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 336

<212> PRT

<213> 腸炎沙門氏菌

<400> 1

Met Gly Asp Val Ser Ala Val Ser Ser Ser Gly Asn Ile Leu Leu Pro

1 5 10 15

Gln Gln Asp Glu Val Gly Gly Leu Ser Glu Ala Leu Lys Lys Ala Val

20 25 30

Glu Lys His Lys Thr Glu Tyr Ser Gly Asp Lys Lys Asp Arg Asp Tyr

35 40 45

Gly Asp Ala Phe Val Met His Lys Glu Thr Ala Leu Pro Val Leu Leu

50 55 60

Ala Ala Trp Arg His Gly Ala Pro Ala Lys Ser Glu His His Asn Gly

65 70 75 80

Asn Val Ser Gly Leu His His Asn Gly Lys Gly Glu Leu Arg Ile Ala

85 90 95

Glu Lys Leu Leu Lys Val Thr Ala Glu Lys Ser Val Gly Leu Ile Ser

100 105 110

Ala Glu Ala Lys Val Asp Lys Ser Ala Ala Leu Leu Ser Ser Lys Asn

115 120 125

Arg Pro Leu Glu Ser Val Ser Gly Lys Lys Leu Ser Ala Asp Leu Lys

130 135 140

Ala Val Glu Ser Val Ser Glu Val Ala Asp Asn Ala Thr Gly Ile Ser

145 150 155 160

Asp Asp Asn Ile Lys Ala Leu Pro Gly Asp Asn Lys Ala Ile Ala Gly

165 170 175

Glu Gly Val Arg Lys Glu Gly Ala Pro Leu Ala Arg Asp Val Ala Pro

180 185 190

Ala Arg Met Ala Ala Ala Asn Thr Gly Lys Pro Asp Asp Lys Asp His

195 200 205

Lys Lys Val Lys Asp Val Ser Gln Leu Pro Leu Gln Pro Thr Thr Ile

210 215 220

Ala Asp Leu Ser Gln Leu Thr Gly Gly Asp Glu Lys Met Pro Leu Ala

225 230 235 240

Ala Gln Ser Lys Pro Met Met Thr Ile Phe Pro Thr Ala Asp Gly Val

245 250 255

Lys Gly Glu Asp Ser Ser Leu Thr Tyr Arg Phe Gln Arg Trp Gly Asn

260 265 270

Asp Tyr Ser Val Asn Ile Gln Ala Arg Gln Ala Gly Glu Phe Ser Leu

275 280 285

Ile Pro Ser Asn Thr Gln Val Glu His Arg Leu His Asp Gln Trp Gln

290 295 300

Asn Gly Asn Pro Gln Arg Trp His Leu Thr Arg Asp Asp Gln Gln Asn

305 310 315 320

Pro Gln Gln Gln Gln His Arg Gln Gln Ser Gly Glu Glu Asp Asp Ala

325 330 335

<210> 2

<211> 335

<212> PRT

<213> 腸炎沙門氏菌

<400> 2

Arg Ile Leu Pro Val Leu Leu Asp Ser Phe Asp Arg Asn Ser Ala Ala

1 5 10 15

Met Thr Thr His Ser Gly Leu Phe Asn Gln Val Ile Leu His Cys Met

20 25 30

Thr Gly Val Asp Cys Thr Asp Gly Thr Arg Gln Lys Ala Ala Ala Leu

35 40 45

Tyr Glu Gln Tyr Leu Ala His Pro Ala Val Ser Pro His Ile His Asn

50 55 60

Gly Leu Phe Gly Asn Tyr Asp Gly Ser Pro Asp Trp Thr Thr Arg Ala

65 70 75 80

Ala Asp Asn Phe Leu Leu Leu Ser Ser Gln Asp Ser Asp Thr Ala Met

85 90 95

Met Leu Ser Thr Asp Thr Leu Leu Thr Met Leu Asn Pro Thr Pro Asp

100 105 110

Thr Ala Trp Asp Asn Phe Tyr Leu Leu Arg Ala Gly Glu Asn Val Ser

115 120 125

Thr Ala Gln Ile Ser Pro Val Glu Leu Phe Arg His Asp Phe Pro Val

130 135 140

Phe Leu Ala Ala Phe Asn Gln Gln Ala Thr Gln Arg Arg Phe Gly Glu

145 150 155 160

Leu Ile Asp Ile Ile Leu Ser Thr Glu Glu His Gly Glu Leu Asn Gln

165 170 175

Gln Phe Ile Ala Ala Thr Asn Gln Lys His Ser Thr Val Lys Leu Ile

180 185 190

Asp Asp Ala Ser Val Ser Arg Leu Ala Thr Ile Phe Ala Pro Leu Leu

195 200 205

Pro Glu Gly Lys Leu Ser Pro Ala His Tyr Gln His Ile Leu Ser Ala

210 215 220

Tyr His Leu Thr Asp Ala Thr Pro Gln Lys Gln Ala Glu Thr Leu Phe

225 230 235 240

Cys Leu Ser Thr Ala Phe Ala Arg Tyr Ser Ser Ser Ala Ile Phe Gly

245 250 255

Thr Glu His Asp Ser Pro Pro Ala Leu Arg Gly Tyr Ala Glu Ala Leu

260 265 270

Met Gln Lys Ala Trp Glu Leu Ser Pro Ala Ile Phe Pro Ser Ser Glu

275 280 285

Gln Phe Thr Asp Trp Ser Asp Arg Phe His Gly Leu His Gly Ala Phe

290 295 300

Thr Cys Thr Ser Val Val Ala Asp Ser Met Gln Arg His Ala Arg Lys

305 310 315 320

Tyr Phe Pro Ser Val Leu Ser Ser Ile Leu Pro Leu Ala Trp Ala

325 330 335

<210> 3

<211> 1026

<212> DNA

<213> 腸炎沙門氏菌

<400> 3

cgcggatcca tgggcgatgt gtcagctgtc agttcatccg ggaacatttt actgccgcag 60

caggatgagg ttggcggttt atcagaagca ttaaaaaaag cggtggaaaa acataagaca 120

gaatattccg gtgataaaaa agatcgcgac tatggcgatg ctttcgtaat gcataaagaa 180

acggctttac cggtattact ggcggcatgg cgacatggcg cgccagcgaa atcagaacat 240

cacaatggca acgtttctgg tctgcatcat aacggaaaag gcgaactcag gattgctgaa 300

aaactgttga aagtcactgc tgaaaaatct gtcggtttga tttctgcgga ggccaaagta 360

gataaatccg cagcgttgct atcgtctaaa aataggccgt tagaaagcgt aagcggtaaa 420

aaattatctg ctgatttaaa agccgtggag tccgttagtg aagtagccga taacgccacg 480

ggaatctctg acgataatat caaggcattg cctggggata ataaagccat cgcgggcgaa 540

ggcgttcgta aagagggcgc gccgctggcg cgggatgtcg cacctgcccg aatggccgca 600

gccaataccg gtaagcctga cgataaagat cataaaaagg ttaaagatgt ttctcagctt 660

ccgctgcaac caaccactat cgccgatctt agccaattaa ccggcggcga tgaaaaaatg 720

cctttagcgg cgcaatcaaa gccgatgatg actatttttc cgactgccga tggcgtgaaa 780

ggagaggata gctcgctgac ttaccgtttt cagcgctggg gaaatgacta ttccgtcaat 840

attcaggcgc ggcaagcagg ggagttttcg ttaataccgt caaatacgca ggttgaacat 900

cgtttgcatg atcaatggca aaacggtaat ccccagcgct ggcacctgac gcgagacgat 960

caacaaaatc cgcagcagca acagcacaga cagcaatctg gcgaggagga tgacgccaag 1020

cttccc 1026

<210> 4

<211> 1109

<212> DNA

<213> 腸炎沙門氏菌

<400> 4

cgcggatccc gcatactgcc tgtgttgctg gattcgtttg acaggaacag cgccgccatg 60

accactcaca gcggactctt taatcaggtg attttacact gtatgacagg cgtggactgc 120

actgatggca cccgccagaa agctgcagcg ctttatgaac agtatcttgc tcacccggcg 180

gtgtctcccc acatccataa tgggctcttc ggcaattatg acggcagccc ggactggaca 240

acccgcgctg cagataattt cctgctgctt tcctcccaag attcagacac ggcgatgatg 300

ctctccactg acacgctgtt aacaatgcta aaccctactc ctgacactgc atgggacaac 360

ttttacctgc tgcgagccgg agagaacgtt tccaccgcgc aaatctctcc ggtagagtta 420

ttccgtcatg actttccggt gtttctcgcc gcatttaatc agcaggccac gcagcgacgc 480

tttggggagc tgattgatat catcctcagc actgaagagc acggggagct gaaccagcag 540

tttattgccg ccacgaacca gaaacattcc accgtgaagt tgattgatga tgcctcagtg 600

tcgcgtctgg ccaccatttt tgcccccttg cttcctgaag gcaaactcag cccggcacac 660

taccagcaca tcctcagtgc ttatcacctg acggacgcca ccccacagaa gcaggcggaa 720

accctgttct gtctcagtac cgcattcgca cgctattcct ccagcgccat tttcggcact 780

gagcatgact ctccgccggc cctgagaggc tatgcggagg cgctgatgca gaaagcctgg 840

gagctgtctc cggcgatctt cccgtccagc gaacagttta ccgactggtc cgaccgtttt 900

cacggcctcc atggcgcctt tacctgtacc agcgttgtgg cggatagtat gcaacgtcat 960

gccagaaaat atttcccgag tgttctgtca tccatcctgc cactggcctg ggcctagtcc 1020

agcctcaacc cgcatgaaat taagggacac agcgttgtgt ccctctgtac atagacccgt 1080

tttagtccat gcattttttg aagcttccc 1109