本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于多重DPO-PCR同時(shí)檢測(cè)旋毛蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)和血吸蟲(chóng)的引物組合及方法。

背景技術(shù)：

旋毛蟲(chóng)(Trichinella spiralis)是一種危害嚴(yán)重的食源性人獸共患寄生性線蟲(chóng)，能夠感染包括人類在內(nèi)的150多種哺乳動(dòng)物，呈世界性分布。旋毛蟲(chóng)病感染來(lái)源于攝食了生的或未熟的含旋毛蟲(chóng)包囊的豬肉或其他動(dòng)物肉，且人感染旋毛蟲(chóng)病可引起死亡，是一種嚴(yán)重危害公共衛(wèi)生安全的人畜共患寄生蟲(chóng)病，所以在肉品衛(wèi)生檢驗(yàn)中為必檢項(xiàng)目。

弓形蟲(chóng)是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲(chóng)，能感染幾乎所有溫血?jiǎng)游锏挠泻思?xì)胞，是引起世界范圍廣泛流行的人獸共患寄生蟲(chóng)病。食入未煮熟的肉等被污染的食物易引起弓形蟲(chóng)病。

血吸蟲(chóng)是人畜互通寄生蟲(chóng)。其儲(chǔ)存宿主種類較多，主要有牛、豬、犬、羊、馬、貓及鼠類等30多種動(dòng)物。

多重PCR是指在一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)加入多對(duì)引物同時(shí)對(duì)多個(gè)靶基因進(jìn)行擴(kuò)增，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的高通量檢測(cè)，目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因物種的檢測(cè)。由于在PCR反應(yīng)體系內(nèi)加入了多對(duì)引物，體系復(fù)雜，穩(wěn)定性不高，限制了其使用。雙啟動(dòng)寡核苷酸(DPO，Dual priming oligonucleotide)引物的設(shè)計(jì)方法簡(jiǎn)化了建立常規(guī)PCR方法的操作步驟，該DPO引物技術(shù)的主要原理為其引物包含兩個(gè)各自獨(dú)立的特異性引物區(qū)域，5′端序列由18-25個(gè)堿基組成并與靶基因序列配對(duì)，3′端序列由6-12個(gè)堿基用來(lái)引導(dǎo)PCR反應(yīng)的特異性延伸，這兩段獨(dú)立的特異性區(qū)域利用寡聚次黃嘌呤(Inosine,I)進(jìn)行連接，由于次黃嘌呤比一般堿基的退火溫度低，在退火時(shí)寡聚次黃嘌呤形成類似泡狀的結(jié)構(gòu)，從而使5′和3′區(qū)域形兩個(gè)獨(dú)立功能的雙特異性引物結(jié)構(gòu)，研究表明5′和3′引物區(qū)域中任何有3個(gè)及以上堿基的錯(cuò)配，PCR反應(yīng)將不能進(jìn)行，而且由于其特殊的結(jié)構(gòu)，引物自身以及引物之間很少形成二級(jí)結(jié)構(gòu)且對(duì)退火溫度不敏感，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不需要對(duì)引物進(jìn)行篩選以及對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)主要在于它對(duì)退火溫度等影響普通多重PCR的關(guān)鍵因素不敏感，適用范圍廣，而且該技術(shù)特異性強(qiáng)，擴(kuò)增效率高，為多重PCR技術(shù)的應(yīng)用提供了新的前景。

采用DPO引物建立多重DPO-PCR方法對(duì)致病性微生物實(shí)施精準(zhǔn)檢測(cè)，對(duì)保障公共衛(wèi)生安全具有現(xiàn)實(shí)意義。本發(fā)明根據(jù)旋毛蟲(chóng)ATP6靶基因、弓形蟲(chóng)P22靶基因和血吸蟲(chóng)28S rRNA的保守區(qū)設(shè)計(jì)合成了三對(duì)DPO引物，通過(guò)反應(yīng)體系與反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了同時(shí)檢測(cè)旋毛蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)和血吸蟲(chóng)的DPO-PCR精準(zhǔn)檢測(cè)方法。本發(fā)明可用于臨床病例的快速診斷和流行病學(xué)調(diào)查，具有一定的實(shí)用性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種靈敏、準(zhǔn)確和快速的基于多重DPO-PCR技術(shù)的可同時(shí)旋毛蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)和血吸蟲(chóng)的方法，本發(fā)明還提供了用于該方法的特異性好、靈敏度高、檢測(cè)效率高和適用范圍廣的三組引物對(duì)。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):

根據(jù)旋毛蟲(chóng)ATP6靶基因、弓形蟲(chóng)P22靶基因和血吸蟲(chóng)28S rRNA的保守區(qū)設(shè)計(jì)合成了三對(duì)DPO引物組合，所述引物組合如下：

Trichina-F：5’-TCTCCCTACTCAGATACAACTGAATIIIIIACAGCCAA-3’；

Trichina-R：5’-GGATTTATGTGTTTTTGTGTGTGTTIIIIITTCTGGTC-3’；

Toxo-F：5’-CGGCGCAACGAAGACTGTTGIIIIICCCTCCAGT-3’；

Toxo-R：5’-ACCTGCTTCGGCAACGCACTTIIIIIAGAGAACC-3’；

Schistosome-F：5’-TGAGATACCACAAAAGGTGTTGGIIIIICCAGACAGC-3’；

Schistosome-R：5’-GGGCTGCGATCTACAACTTTGIIIIITGATGCAG-3’；

其中，I為次黃嘌呤。

Trichina-F和Trichina-R為檢測(cè)旋毛蟲(chóng)的引物，產(chǎn)物大小為419bp；Toxo-F和Toxo-R為弓形蟲(chóng)的引物，產(chǎn)物大小為271bp；Schistosome-F和Schistosome-R為檢測(cè)血吸蟲(chóng)的引物，產(chǎn)物大小為494bp。

本發(fā)明還提供含有所述引物組合的用于多重DPO-PCR檢測(cè)旋毛蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)和血吸蟲(chóng)的試劑盒。

優(yōu)選地，所述試劑盒還包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反應(yīng)緩沖液等中的至少一種。更優(yōu)選地，所述試劑盒還包括陽(yáng)性對(duì)照。

本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)旋毛蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)和血吸蟲(chóng)的多重DPO-PCR方法，利用所述的引物組合進(jìn)行多重DPO-PCR檢測(cè)旋毛蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)和血吸蟲(chóng)這三種動(dòng)物源性人獸共患寄生蟲(chóng)病。具體的，所述方法包括以下步驟：1)提取待測(cè)患病動(dòng)物肌肉組織或臟器樣品中的DNA；2)以步驟1)中提取的DNA為模板，進(jìn)行多重DPO-PCR擴(kuò)增反應(yīng)；和3)分析擴(kuò)增產(chǎn)物。所述多重DPO-PCR反應(yīng)體系以50μL計(jì)為：10×PCR Buffer(Mg²⁺free)5μL，Taq DNA聚合酶(5U)0.5μL，Mg²⁺(25mM)7.5μL，dNTP(2.5mM)5.5μL，每對(duì)DPO引物(10μM)各1μL，DNA模板各1μL，ddH₂O補(bǔ)至50μL。所述多重DPO-PCR反應(yīng)條件為：95℃5分鐘；94℃45s，48℃～68℃45s，72℃45s，共35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10分鐘。

前述方法中，步驟3)中采用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，旋毛蟲(chóng)的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為419bp，弓形蟲(chóng)的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為271bp，血吸蟲(chóng)的擴(kuò)增大小為494bp。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明根據(jù)旋毛蟲(chóng)ATP6靶基因、弓形蟲(chóng)P22靶基因和血吸蟲(chóng)28S rRNA的保守區(qū)分別設(shè)計(jì)特異性DPO-PCR引物，并基于這些引物建立了檢測(cè)旋毛蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)和血吸蟲(chóng)的多重DPO-PCR方法，可實(shí)現(xiàn)對(duì)患病動(dòng)物肌肉組織或臟器樣品的定性檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的檢測(cè)方法特異性好、通量高、快速，提高了檢測(cè)效率，為旋毛蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)和血吸蟲(chóng)的檢測(cè)提供了更有效的方法。

附圖說(shuō)明：

圖1是旋毛蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)和血吸蟲(chóng)單重DPO-PCR檢測(cè)結(jié)果示意圖，其中，旋毛蟲(chóng)和弓形蟲(chóng)PCR檢測(cè)示意圖的M為DNA Marker 100 ladder，血吸蟲(chóng)的PCR檢測(cè)示意圖的M為DNA Marker DL2000，1-2為不同寄生蟲(chóng)DPO-PCR檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果。

圖2是旋毛蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)和血吸蟲(chóng)DPO-PCR檢測(cè)方法退火溫度不敏感性結(jié)果示意圖，其中，M為DNA Marker DL2000，1為48.3℃，2為49.5℃，3為51.4℃，4為53.7℃，5為56.4℃，6為59.1℃，7為61.7℃，8為64.1℃，9為66.1℃，10為67.4℃，11為68℃；左側(cè)的1-11為常規(guī)引物擴(kuò)增獲得結(jié)果，右側(cè)的1-11為DPO引物擴(kuò)增的結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面以具體實(shí)施方式對(duì)發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明

本發(fā)明參照特定的實(shí)施例進(jìn)行了描述，但是，很顯然仍可以做出各種修改和變換而不違背本發(fā)明的精神和范圍。因此，本發(fā)明的說(shuō)明書(shū)和附圖應(yīng)該認(rèn)為是說(shuō)明性的而非限制性的。

實(shí)施例1.檢測(cè)旋毛蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)和血吸蟲(chóng)的多重DPO-PCR方法

一、多重DPO-PCR引物組合的設(shè)計(jì)

根據(jù)旋毛蟲(chóng)ATP6靶基因、弓形蟲(chóng)P22靶基因和血吸蟲(chóng)28S rRNA的保守區(qū)，分別設(shè)計(jì)了如下檢測(cè)旋毛蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)和血吸蟲(chóng)的保守區(qū)的多重DPO-PCR引物組合(引物序列中的I為次黃嘌呤)：

Trichina-F：5’-TCTCCCTACTCAGATACAACTGAATIIIIIACAGCCAA-3’(SEQ ID NO:1)

Trichina-R：5’-GGATTTATGTGTTTTTGTGTGTGTTIIIIITTCTGGTC-3’(SEQ ID NO:2)

Toxo-F：5’-CGGCGCAACGAAGACTGTTGIIIIICCCTCCAGT-3’(SEQ ID NO:3)

Toxo-R：5’-ACCTGCTTCGGCAACGCACTTIIIIIAGAGAACC-3’(SEQ ID NO:4)

Schistosome-F：5’-TGAGATACCACAAAAGGTGTTGGIIIIICCAGACAGC-3’(SEQ ID NO:5)

Schistosome-R：5’-GGGCTGCGATCTACAACTTTGIIIIITGATGCAG-3’(SEQ ID NO:6)

Trichina-F和Trichina-R為檢測(cè)旋毛蟲(chóng)的引物，產(chǎn)物大小為419bp；Toxo-F和Toxo-R為弓形蟲(chóng)的引物，產(chǎn)物大小為271bp；Schistosome-F和Schistosome-R為檢測(cè)血吸蟲(chóng)的引物，產(chǎn)物大小為494bp。

二、檢測(cè)旋毛蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)和血吸蟲(chóng)的多重DPO-PCR方法

1、DNA的提取

采用DNA提取試劑盒(德國(guó)QIAGEN公司)提取旋毛蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)和血吸蟲(chóng)的基因組DNA，參照試劑盒說(shuō)明操作。

2、多重DPO-PCR擴(kuò)增

采用Trichina-F、Trichina-R、Toxo-F、Toxo-R、Schistosome-F和Schistosome-R共6條多重DPO-PCR引物，分別以如下4組的基因組DNA為模板進(jìn)行多重DPO-PCR擴(kuò)增，分別得到多重DPO-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物：

組1以旋毛蟲(chóng)的基因組DNA為模板；

組2以弓形蟲(chóng)的基因組DNA為模板；

組3以血吸蟲(chóng)的基因組DNA為模板；

組4以旋毛蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)和血吸蟲(chóng)的基因組DNA為模板。

多重DPO-PCR反應(yīng)體系為：10×PCR Buffer(Mg²⁺free)5μL，Taq DNA聚合酶(5U)0.5μL，Mg²⁺(25mM)7.5μL，dNTP(2.5mM)5.5μL，每對(duì)DPO引物(10μM)各1μL，DNA模板各1μL，ddH₂O補(bǔ)至50μL。

多重DPO-PCR反應(yīng)條件為：95℃5min；94℃45s，48℃～68℃45s，72℃45s，共35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min。

3、多重DPO-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)

多重DPO-PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5μL的多重DPO-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。

結(jié)果如圖1和圖2所示，組1(旋毛蟲(chóng))的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物含有1條帶，大小為419bp；組2(弓形蟲(chóng))的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物只含有1個(gè)條帶，大小為271bp；組3(血吸蟲(chóng))的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物含有1個(gè)條帶，大小為494bp；組4(旋毛蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)和血吸蟲(chóng))的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物含有3條大小為419bp、271bp和494bp。說(shuō)明本發(fā)明的多重DPO-PCR引物的可以快速有效地檢測(cè)旋毛蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)和血吸蟲(chóng)。

實(shí)施例2.多重DPO-PCR引物組合的靈敏度檢測(cè)

1、DNA的提取

參照試劑盒說(shuō)明操作提取旋毛蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)和血吸蟲(chóng)的基因DNA。將得到的基因組DNA混合并進(jìn)行10倍稀釋，分別制備得到濃度為18ng/μL、1.8ng/μL、0.18ng/μL、0.018ng/μL和0.0018ng/μL的旋毛蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)和血吸蟲(chóng)的基因組DNA。

2、多重DPO-PCR擴(kuò)增

采用實(shí)施例1的步驟二中的檢測(cè)旋毛蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)和血吸蟲(chóng)的方法，分別以如下5組的基因組DNA為模板進(jìn)行多重DPO-PCR擴(kuò)增，分別得到多重DPO-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物：

組1：以18ng/μL的旋毛蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)和血吸蟲(chóng)的基因組DNA(1μL)為模板；

組2：以1.8ng/μL的旋毛蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)和血吸蟲(chóng)的基因組DNA(1μL)為模板；

組3：以0.18ng/μL的旋毛蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)和血吸蟲(chóng)的基因組DNA(1μL)為模板；

組4：以0.018ng/μL的旋毛蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)和血吸蟲(chóng)的基因組DNA(1μL)為模板；

組5：以0.0018ng/μL的旋毛蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)和血吸蟲(chóng)的基因組DNA(1μL)為模板。

3、多重DPO-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)

多重DPO-PCR反應(yīng)結(jié)束后，分別取5μL的多重DPO-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果。

結(jié)果表明，本發(fā)明多重DPO-PCR引物組合具有較高的靈敏度，可檢測(cè)出樣品中僅含有0.0018ng/μL的微量DNA。

實(shí)施例3.多重DPO-PCR引物組合的退火溫度敏感性檢測(cè)

1、DNA的提取

參照試劑盒說(shuō)明提取旋毛蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)和血吸蟲(chóng)的基因組DNA。

2、多重DPO-PCR擴(kuò)增

以步驟1獲得的旋毛蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)和血吸蟲(chóng)基因組DNA為模板，采用常規(guī)引物(如表1所示)或者實(shí)施例1的步驟二中的同時(shí)檢測(cè)旋毛蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)和血吸蟲(chóng)的方法，用不同的退火溫度(48.3℃、49.5℃、51.4℃、53.7℃、56.4℃、59.1℃、61.7℃、64.1℃、66.1℃、67.4℃、68℃)分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其余反應(yīng)條件不變，分別得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

表1.擴(kuò)增血吸蟲(chóng)28S rRNA、旋毛蟲(chóng)ATP6基因和弓形蟲(chóng)P22基因常規(guī)引物序列

3、多重DPO-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)

多重DPO-PCR反應(yīng)結(jié)束后，分別取5μL的多重DPO-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果。

結(jié)果如圖2所示：電泳檢測(cè)結(jié)果顯示用不同的退火溫度(48.3℃、49.5℃、51.4℃、53.7℃、56.4℃、59.1℃、61.7℃、64.1℃、66.1℃、67.4℃、68℃)進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均含有大小為419bp、271bp和494bp的片段，無(wú)非特異性擴(kuò)增條帶，說(shuō)明本發(fā)明的多重DPO-PCR引物對(duì)退火溫度不敏感。

序列表

<110> 申請(qǐng)人名稱：海南出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心

<120> 一種檢測(cè)旋毛蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)和血吸蟲(chóng)的多重DPO-PCR引物組合及方法

<130> reference number：11348

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 旋毛蟲(chóng)ATP6靶基因DPO引物上游引物

<400> 1

tctccctact cagatacaac tgaatiiiii acagccaa 38

<210> 2

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 旋毛蟲(chóng)ATP6靶基因DPO引物下游引物

<400> 2

ggatttatgt gtttttgtgt gtgttiiiii ttctggtc 38

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 弓形蟲(chóng)P22靶基因DPO引物上游引物

<400> 3

cggcgcaacg aagactgttg iiiiiccctc cagt 34

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 弓形蟲(chóng)P22靶基因DPO引物下游引物

<400> 4

acctgcttcg gcaacgcact tiiiiiagag aacc 34

<210> 5

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 血吸蟲(chóng)28S rRNA DPO引物上游引物

<400> 5

tgagatacca caaaaggtgt tggiiiiicc agacagc 37

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 血吸蟲(chóng)28S rRNA DPO引物下游引物

<400> 6

gggctgcgat ctacaacttt giiiiitgat gcag 34

<210> 7

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 旋毛蟲(chóng)ATP6靶基因常規(guī)引物上游引物

<400> 7

tctccctact cagatacaac tgaattatta acagccaa 38

<210> 8

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 旋毛蟲(chóng)ATP6靶基因常規(guī)引物下游引物

<400> 8

ggatttatgt gtttttgtgt gtgttattca ttctggtc 38

<210> 9

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 弓形蟲(chóng)P22靶基因常規(guī)引物上游引物

<400> 9

cggcgcaacg aagactgttg atgcaccctc cagt 34

<210> 10

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 弓形蟲(chóng)P22靶基因常規(guī)引物下游引物

<400> 10

acctgcttcg gcaacgcact tgtaacagag aacc 34

<210> 11

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 血吸蟲(chóng)28S rRNA常規(guī)引物上游引物

<400> 11

tgagatacca caaaaggtgt tggttggtcc agacagc 37

<210> 12

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 血吸蟲(chóng)28S rRNA常規(guī)引物下游引物

<400> 12

gggctgcgat ctacaacttt gtactttgat gcag 34