本發(fā)明涉及SNP分子標(biāo)記領(lǐng)域，具體而言，涉及一種用于結(jié)核分枝桿菌分型SNP位點(diǎn)的試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

結(jié)核病(tuberculosis,TB)是伴隨人類歷史最長的疾病之一，也是全球由單一致病菌導(dǎo)致死亡人數(shù)最多的疾病，已經(jīng)成為全球重大公共衛(wèi)生問題，結(jié)核病的防治工作任重而道遠(yuǎn)。

結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)，俗稱結(jié)核桿菌，是引起結(jié)核病的病原菌。全球范圍內(nèi)流行的結(jié)核分枝桿菌主要被分為6大譜系和少數(shù)亞譜系。不同譜系的結(jié)核分枝桿菌在毒力、致病力、疫苗效力變化和抗藥性等方面有較大差異，因此，有必要對結(jié)核分枝桿菌的譜系進(jìn)行細(xì)分。

目前，結(jié)核分枝桿菌的分型方法主要有：長序列多態(tài)性(LSP)分型、Spoligotyping分型和單核苷酸多態(tài)性(SNP)分型。LSP分型是基于結(jié)核分枝桿菌基因組中差異區(qū)(RD)的缺失而建立的結(jié)核分枝桿菌譜系鑒定方法，該方法操作簡單，只需普通PCR即可完成，結(jié)果易判讀，但該方法只能將結(jié)核分枝桿菌分成6個大譜系和15個亞譜系，分辨能力不高。Spoligotyping分型是通過檢測結(jié)核分枝桿菌染色體上DR序列之間的不同間隔序列從而實(shí)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌的分型，該分型方法也存在分辨率低的缺陷。

SNP分型技術(shù)是基于基因組水平上由單個核苷酸變異可引起基因組DNA序列多態(tài)性，SNP從全基因組序列中來，其優(yōu)點(diǎn)是具有更高的分辨率，克服了其他分型方法的同源異質(zhì)性的缺點(diǎn)，并且SNP更符合結(jié)核分枝桿菌的進(jìn)化規(guī)律。目前，國外研究者已篩選SNP位點(diǎn)作為分型靶標(biāo)，如Francesc Coll等研究發(fā)現(xiàn)62個SNP位點(diǎn)可以將結(jié)核分枝桿菌一共劃分為55個亞譜系，Homolka C等用71個SNP位點(diǎn)將結(jié)核分枝桿菌劃分為10個亞譜系，但國內(nèi)并未發(fā)現(xiàn)一套成熟的SNP分類靶標(biāo)應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌中預(yù)防和控制的實(shí)踐中。因此基于結(jié)核分枝桿菌全基因組序列數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)并篩選出一批具有代表性的SNP位點(diǎn)有助于將結(jié)核分枝桿菌分成更多的亞譜系，提高其分辨能力。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一目的在于提供一種檢測結(jié)核分枝桿菌SNP位點(diǎn)的試劑盒，該試劑盒包括用于檢測結(jié)核分枝桿菌的SNP集合的試劑或組件。上述試劑盒能夠?qū)Y(jié)核分枝桿菌的SNP集合進(jìn)行檢測，從而將結(jié)核分枝桿菌細(xì)分為不同亞型，提高對結(jié)核分枝桿菌譜系的分辨能力。

本發(fā)明的第二目的在于提供一種上述試劑盒在結(jié)核分枝桿菌的分型或進(jìn)化分析中的應(yīng)用。上述應(yīng)用能夠提高結(jié)核分枝桿菌分型或進(jìn)化分析的準(zhǔn)確性。

本發(fā)明的第三目的在于提供一種上述試劑盒在制備用于結(jié)核病感染病原體亞型判斷的診斷產(chǎn)品中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第四目的在于提供一種對結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行分型或進(jìn)化分析的方法，所述方法使用上述試劑盒對結(jié)核分枝桿菌的SNP集合進(jìn)行檢測。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供一種檢測結(jié)核分枝桿菌SNP位點(diǎn)的試劑盒，所述試劑盒中包括用于檢測SNP集合的試劑和/或組件，所述SNP集合包括以下一個或多個SNP位點(diǎn)，所述SNP位點(diǎn)的物理位置是基于結(jié)核分枝桿菌H37Rv的全基因組序列比對確定的，所述結(jié)核分枝桿菌H37Rv的全基因組序列的Accesion Number為NC_000962.3：

SNP位點(diǎn)1：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第107791位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)2：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第108136位，其核苷酸為C/A；

SNP位點(diǎn)3：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第108181位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)4：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第109040位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)5：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第110395位，其核苷酸為G/C；

SNP位點(diǎn)6：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第111848位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)7：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第112333位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)8：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第112490位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)9：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第112734位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)10：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第113139位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)11：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第114695位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)12：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第116225位，其核苷酸為C/G；

SNP位點(diǎn)13：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第154049位，其核苷酸為A/G；

SNP位點(diǎn)14：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第200152位，其核苷酸為T/C；

SNP位點(diǎn)15：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第200377位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)16：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第200695位，其核苷酸為T/G；

SNP位點(diǎn)17：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第201894位，其核苷酸為A/G；

SNP位點(diǎn)18：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第204424位，其核苷酸為T/C；

SNP位點(diǎn)19：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第204502位，其核苷酸為C/G；

SNP位點(diǎn)20：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第207077位，其核苷酸為G/C；

SNP位點(diǎn)21：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第207590位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)22：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第208297位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)23：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第258921位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)24：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第259689位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)25：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第301341位，其核苷酸為C/A；

SNP位點(diǎn)26：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第392506位，其核苷酸為A/G；

SNP位點(diǎn)27：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第451896位，其核苷酸為T/C；

SNP位點(diǎn)28：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第452064位，其核苷酸為T/G；

SNP位點(diǎn)29：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第500533位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)30：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第501001位，其核苷酸為T/C；

SNP位點(diǎn)31：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第516658位，其核苷酸為C/G；

SNP位點(diǎn)32：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第580011位，其核苷酸為A/G；

SNP位點(diǎn)33：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第643386位，其核苷酸為A/C；

SNP位點(diǎn)34：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第643751位，其核苷酸為T/G；

SNP位點(diǎn)35：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第644442位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)36：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第644475位，其核苷酸為T/C；

SNP位點(diǎn)37：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第646051位，其核苷酸為C/G；

SNP位點(diǎn)38：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第646166位，其核苷酸為C/A；

SNP位點(diǎn)39：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第646246位，其核苷酸為T/C；

SNP位點(diǎn)40：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第732555位，其核苷酸為A/G；

SNP位點(diǎn)41：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第738045位，其核苷酸為A/C；

SNP位點(diǎn)42：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第752017位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)43：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第752049位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)44：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第770391位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)45：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第962104位，其核苷酸為A/G；

SNP位點(diǎn)46：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第962136位，其核苷酸為G/T；

SNP位點(diǎn)47：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第1061309位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)48：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第1129169位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)49：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第1143318位，其核苷酸為C/A；

SNP位點(diǎn)50：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第1149132位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)51：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第1149551位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)52：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第1150494位，其核苷酸為C/G；

SNP位點(diǎn)53：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第1219669位，其核苷酸為G/C；

SNP位點(diǎn)54：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第1219828位，其核苷酸為G/T；

SNP位點(diǎn)55：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第1225203位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)56：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第1228121位，其核苷酸為A/G；

SNP位點(diǎn)57：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第1235550位，其核苷酸為G/T；

SNP位點(diǎn)58：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第1271192位，其核苷酸為C/G；

SNP位點(diǎn)59：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第1310360位，其核苷酸為G/T；

SNP位點(diǎn)60：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第1324571位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)61：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第1324730位，其核苷酸為C/A；

SNP位點(diǎn)62：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第1324997位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)63：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第1325171位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)64：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第1326802位，其核苷酸為T/G；

SNP位點(diǎn)65：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第1347179位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)66：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第1377574位，其核苷酸為A/G；

SNP位點(diǎn)67：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第1378731位，其核苷酸為T/C；

SNP位點(diǎn)68：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第1386928位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)69：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第1386970位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)70：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第1421046位，其核苷酸為C/G；

SNP位點(diǎn)71：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第1421115位，其核苷酸為A/G；

SNP位點(diǎn)72：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第1421314位，其核苷酸為T/G；

SNP位點(diǎn)73：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第1460672位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)74：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第1486653位，其核苷酸為G/C；

SNP位點(diǎn)75：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第1494800位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)76：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第1495332位，其核苷酸為A/G；

SNP位點(diǎn)77：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第1501474位，其核苷酸為G/C；

SNP位點(diǎn)78：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第1502126位，其核苷酸為C/A；

SNP位點(diǎn)79：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第1502348位，其核苷酸為T/G；

SNP位點(diǎn)80：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第1505476位，其核苷酸為C/G；

SNP位點(diǎn)81：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第1505812位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)82：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第1510163位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)83：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第1581733位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)84：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第1586540位，其核苷酸為C/A；

SNP位點(diǎn)85：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第1587020位，其核苷酸為A/G；

SNP位點(diǎn)86：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第1588462位，其核苷酸為A/G；

SNP位點(diǎn)87：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第1597411位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)88：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第1656977位，其核苷酸為G/T；

SNP位點(diǎn)89：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第1658036位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)90：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第1706040位，其核苷酸為A/G；

SNP位點(diǎn)91：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第1719328位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)92：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第1719685位，其核苷酸為T/C；

SNP位點(diǎn)93：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第1719829位，其核苷酸為A/G；

SNP位點(diǎn)94：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第1776441位，其核苷酸為G/C；

SNP位點(diǎn)95：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第1790486位，其核苷酸為C/G；

SNP位點(diǎn)96：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第1791511位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)97：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第1793509位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)98：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第1849198位，其核苷酸為T/C；

SNP位點(diǎn)99：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第1850089位，其核苷酸為T/C；

SNP位點(diǎn)100：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第1851055位，其核苷酸為A/C；

SNP位點(diǎn)101：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第1867845位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)102：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第1919743位，其核苷酸為T/G；

SNP位點(diǎn)103：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第1919952位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)104：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2066477位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)105：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2066478位，其核苷酸為T/C；

SNP位點(diǎn)106：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2067686位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)107：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2095241位，其核苷酸為C/A；

SNP位點(diǎn)108：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2095536位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)109：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2183228位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)110：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2192357位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)111：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2192591位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)112：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2202589位，其核苷酸為G/T；

SNP位點(diǎn)113：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2202946位，其核苷酸為A/C；

SNP位點(diǎn)114：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2283874位，其核苷酸為A/C；

SNP位點(diǎn)115：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2294813位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)116：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2295025位，其核苷酸為T/G；

SNP位點(diǎn)117：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2295037位，其核苷酸為T/G；

SNP位點(diǎn)118：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2295046位，其核苷酸為T/A；

SNP位點(diǎn)119：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2295050位，其核苷酸為A/G；

SNP位點(diǎn)120：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2296751位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)121：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2298201位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)122：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2300672位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)123：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2300950位，其核苷酸為T/C；

SNP位點(diǎn)124：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2303765位，其核苷酸為T/C；

SNP位點(diǎn)125：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2304076位，其核苷酸為C/A；

SNP位點(diǎn)126：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2329272位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)127：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2329474位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)128：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2371795位，其核苷酸為G/T；

SNP位點(diǎn)129：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2371796位，其核苷酸為A/G；

SNP位點(diǎn)130：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2462421位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)131：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2496838位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)132：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2505093位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)133：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2512762位，其核苷酸為C/A；

SNP位點(diǎn)134：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2514875位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)135：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2527686位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)136：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2547004位，其核苷酸為G/T；

SNP位點(diǎn)137：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2547251位，其核苷酸為T/C；

SNP位點(diǎn)138：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2549266位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)139：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2549313位，其核苷酸為A/C；

SNP位點(diǎn)140：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2549735位，其核苷酸為T/G；

SNP位點(diǎn)141：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2610132位，其核苷酸為A/G；

SNP位點(diǎn)142：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2610354位，其核苷酸為G/C；

SNP位點(diǎn)143：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2654653位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)144：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2654706位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)145：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2672399位，其核苷酸為T/C；

SNP位點(diǎn)146：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2672617位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)147：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2672916位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)148：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2673609位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)149：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2673711位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)150：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2673858位，其核苷酸為C/A；

SNP位點(diǎn)151：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2681585位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)152：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2682603位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)153：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2775550位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)154：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2789351位，其核苷酸為A/C；

SNP位點(diǎn)155：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2789808位，其核苷酸為G/T；

SNP位點(diǎn)156：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2789851位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)157：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2790588位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)158：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2810392位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)159：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2810826位，其核苷酸為T/C；

SNP位點(diǎn)160：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2817168位，其核苷酸為C/A；

SNP位點(diǎn)161：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2818256位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)162：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2859840位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)163：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2860223位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)164：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2860313位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)165：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2872966位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)166：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2884007位，其核苷酸為A/G；

SNP位點(diǎn)167：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2996922位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)168：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第2997335位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)169：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第3012844位，其核苷酸為C/A；

SNP位點(diǎn)170：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第3016914位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)171：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第3016953位，其核苷酸為G/C；

SNP位點(diǎn)172：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第3017144位，其核苷酸為G/T；

SNP位點(diǎn)173：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第3017286位，其核苷酸為A/G；

SNP位點(diǎn)174：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第3050372位，其核苷酸為C/A；

SNP位點(diǎn)175：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第3051081位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)176：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第3118829位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)177：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第3118986位，其核苷酸為C/G；

SNP位點(diǎn)178：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第3151823位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)179：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第3152267位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)180：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第3152431位，其核苷酸為T/C；

SNP位點(diǎn)181：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第3169022位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)182：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第3194244位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)183：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第3219800位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)184：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第3285955位，其核苷酸為C/G；

SNP位點(diǎn)185：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第3286799位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)186：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第3332286位，其核苷酸為G/C；

SNP位點(diǎn)187：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第3332665位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)188：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第3336871位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)189：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第3401962位，其核苷酸為G/C；

SNP位點(diǎn)190：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第3402521位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)191：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第3423423位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)192：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第3423655位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)193：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第3424459位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)194：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第3424865位，其核苷酸為C/A；

SNP位點(diǎn)195：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第3453393位，其核苷酸為A/G；

SNP位點(diǎn)196：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第3471148位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)197：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第3536291位，其核苷酸為T/C；

SNP位點(diǎn)198：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第3536836位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)199：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第3537013位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)200：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第3606624位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)201：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第3612568位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)202：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第3626906位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)203：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第3651143位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)204：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第3664476位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)205：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第3722442位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)206：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第3786035位，其核苷酸為C/A；

SNP位點(diǎn)207：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第3786186位，其核苷酸為C/G；

SNP位點(diǎn)208：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第3817476位，其核苷酸為C/A；

SNP位點(diǎn)209：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第3817994位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)210：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第3913600位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)211：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第3921273位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)212：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第3959715位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)213：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第3973331位，其核苷酸為C/G；

SNP位點(diǎn)214：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第3979502位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)215：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第3980169位，其核苷酸為C/G；

SNP位點(diǎn)216：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第3980398位，其核苷酸為G/C；

SNP位點(diǎn)217：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第3981350位，其核苷酸為T/G；

SNP位點(diǎn)218：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第3981601位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)219：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第3984549位，其核苷酸為A/G；

SNP位點(diǎn)220：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第3985105位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)221：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第3996273位，其核苷酸為G/T；

SNP位點(diǎn)222：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第3996826位，其核苷酸為G/C；

SNP位點(diǎn)223：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4016684位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)224：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4030438位，其核苷酸為A/G；

SNP位點(diǎn)225：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4054217位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)226：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4054902位，其核苷酸為G/T；

SNP位點(diǎn)227：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4056097位，其核苷酸為A/G；

SNP位點(diǎn)228：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4056172位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)229：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4070666位，其核苷酸為G/T；

SNP位點(diǎn)230：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4090261位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)231：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4090846位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)232：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4092848位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)233：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4095906位，其核苷酸為C/G；

SNP位點(diǎn)234：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4125161位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)235：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4139309位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)236：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4168881位，其核苷酸為A/G；

SNP位點(diǎn)237：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4168949位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)238：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4201713位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)239：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4243424位，其核苷酸為G/T；

SNP位點(diǎn)240：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4243509位，其核苷酸為G/T；

SNP位點(diǎn)241：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4243638位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)242：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4244433位，其核苷酸為T/G；

SNP位點(diǎn)243：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4244598位，其核苷酸為G/C；

SNP位點(diǎn)244：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4244813位，其核苷酸為T/C；

SNP位點(diǎn)245：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4245203位，其核苷酸為A/G；

SNP位點(diǎn)246：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4245233位，其核苷酸為C/A；

SNP位點(diǎn)247：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4245325位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)248：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4246500位，其核苷酸為C/A；

SNP位點(diǎn)249：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4267450位，其核苷酸為T/C；

SNP位點(diǎn)250：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4267825位，其核苷酸為T/C；

SNP位點(diǎn)251：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4268036位，其核苷酸為T/C；

SNP位點(diǎn)252：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4268751位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)253：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4273752位，其核苷酸為T/G；

SNP位點(diǎn)254：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4274020位，其核苷酸為A/C；

SNP位點(diǎn)255：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4327554位，其核苷酸為G/C；

SNP位點(diǎn)256：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4340528位，其核苷酸為C/A；

SNP位點(diǎn)257：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4340731位，其核苷酸為A/G；

SNP位點(diǎn)258：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4343857位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)259：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4344236位，其核苷酸為T/C；

SNP位點(diǎn)260：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4345214位，其核苷酸為A/C；

SNP位點(diǎn)261：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4345215位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)262：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4345598位，其核苷酸為G/T；

SNP位點(diǎn)263：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4347515位，其核苷酸為C/A；

SNP位點(diǎn)264：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4347938位，其核苷酸為A/C；

SNP位點(diǎn)265：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4348596位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)266：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4349307位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)267：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4354191位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)268：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4355319位，其核苷酸為A/C；

SNP位點(diǎn)269：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4355324位，其核苷酸為A/C；

SNP位點(diǎn)270：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4355393位，其核苷酸為T/G；

SNP位點(diǎn)271：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4355616位，其核苷酸為T/C；

SNP位點(diǎn)272：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4362057位，其核苷酸為T/C；

SNP位點(diǎn)273：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4362473位，其核苷酸為A/G；

SNP位點(diǎn)274：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4362562位，其核苷酸為C/G；

SNP位點(diǎn)275：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4362656位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)276：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4362746位，其核苷酸為T/G；

SNP位點(diǎn)277：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4363247位，其核苷酸為T/C；

SNP位點(diǎn)278：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4363345位，其核苷酸為G/T；

SNP位點(diǎn)279：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4396673位，其核苷酸為C/A；

SNP位點(diǎn)280：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4397307位，其核苷酸為G/T；

SNP位點(diǎn)281：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4398213位，其核苷酸為T/C；

SNP位點(diǎn)282：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4398910位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)283：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4399563位，其核苷酸為C/T；

SNP位點(diǎn)284：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4399600位，其核苷酸為G/A；

SNP位點(diǎn)285：位于結(jié)核分枝桿菌染色體上第4400036位，其核苷酸為G/C。

本發(fā)明上述試劑盒能夠?qū)Πㄟx自SNP位點(diǎn)1～285的SNP集合進(jìn)行檢測。本發(fā)明所述SNP位點(diǎn)1～285是在2372個結(jié)核分枝桿菌的全基因組數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行比對獲得，并在構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌的進(jìn)化樹后通過設(shè)置Fst系數(shù)篩選出最能代表結(jié)核分枝桿菌進(jìn)化樹上每一分枝的SNP位點(diǎn)以及進(jìn)一步篩選出關(guān)鍵基因的同義突變而獲得的SNP集合。因此，上述SNP位點(diǎn)極好地表征了結(jié)核分枝桿菌的譜系信息以及關(guān)鍵基因的突變信息。本發(fā)明所述試劑盒能夠?qū)Y(jié)核分枝桿菌的上述SNP位點(diǎn)進(jìn)行檢測，提供上述信息，對結(jié)核分枝桿菌的分型或進(jìn)化分析具有重要意義。

在一些實(shí)施方式中，上述SNP集合包括50～285個上述SNP位點(diǎn)，或100～285個上述SNP位點(diǎn)，或200～285個上述SNP位點(diǎn)，或250～285個上述SNP位點(diǎn)。

本發(fā)明上述實(shí)施方式對SNP集合中所包括的SNP位點(diǎn)的個數(shù)進(jìn)行優(yōu)選，經(jīng)過優(yōu)選的SNP集合能夠更好地對結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行分型和進(jìn)化分析。

在一些實(shí)施方式中，上述SNP集合包括285個上述SNP位點(diǎn)。

本發(fā)明用于篩選SNP位點(diǎn)的數(shù)據(jù)樣本來自2372個結(jié)核分枝桿菌的全基因組序列，涵蓋了現(xiàn)階段已發(fā)現(xiàn)并測序的大部分結(jié)核分枝桿菌菌株，樣本量遠(yuǎn)大于現(xiàn)有技術(shù)在篩選表征結(jié)核分枝桿菌譜系的SNP位點(diǎn)時所選取的樣本，因此，本發(fā)明所述包括SNP位點(diǎn)1～285的SNP集合能夠更全面地反映結(jié)核分枝桿菌在分型或進(jìn)化上的整體情況。其次，本發(fā)明上述SNP集合通過構(gòu)建進(jìn)化樹能夠?qū)⒔Y(jié)核分枝桿菌細(xì)分為7個大譜系和67個亞譜系以及M.bovis譜系及其亞譜系M.bovis1，較之現(xiàn)有SNP位點(diǎn)將結(jié)核分枝桿菌劃分為10個或55個亞譜系而言，進(jìn)一步提高了分辨能力，其分辨能力與優(yōu)化前的106583個SNP位點(diǎn)集合的分辨能力基本相當(dāng)，本發(fā)明上述SNP集合既保證了分辨率額，又減少了需要檢測的SNP位點(diǎn)數(shù)量，在二者之間取得平衡。并且，采用本發(fā)明上述285個SNP位點(diǎn)對單個結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行分型，準(zhǔn)確率高，能夠?qū)蝹€結(jié)核分枝桿菌細(xì)分到具體的亞譜系。

在一些實(shí)施方式中，上述用于檢測SNP集合的試劑和/或組件包括PCR引物、分子探針、生物傳感器和芯片中的一種或多種。

本發(fā)明還涉及一種上述試劑盒在結(jié)核分枝桿菌的分型或進(jìn)化分析中的應(yīng)用。

本發(fā)明還涉及一種上述試劑盒在制備用于結(jié)核病感染病原體亞型判斷的診斷產(chǎn)品中的應(yīng)用。

本發(fā)明還涉及一種對結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行分型或進(jìn)化分析的方法，所述方法使用上述試劑盒對結(jié)核分枝桿菌的SNP位點(diǎn)進(jìn)行檢測。

在一些實(shí)施方式中，檢測所述SNP位點(diǎn)的方法包括以下一種或幾種：基于凝膠電泳的SNP檢測法、DNA測序法、DNA芯片法、變性高效液相色譜法或質(zhì)譜檢測法。

在一些實(shí)施方式中，所述基于凝膠電泳的SNP檢測法包括單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測法、變性梯度凝膠電泳檢測法、酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列檢測法和等位基因特異性PCR檢測法中的一種或幾種。

在一些實(shí)施方式中，所述質(zhì)譜檢測法包括基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF)檢測法。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

1)、本發(fā)明試劑盒、應(yīng)用和方法中所涉及的SNP位點(diǎn)1～285是從2372個結(jié)核分枝桿菌的基因組序列中得到、并經(jīng)過遺傳分化系數(shù)(Fst)和結(jié)核分枝桿菌的236個關(guān)鍵基因篩選之后獲得的SNP位點(diǎn)，是表征結(jié)核分枝桿菌各譜系或亞譜系且與結(jié)核分枝桿菌的功能密切相關(guān)的關(guān)鍵SNP位點(diǎn)，因此，檢測上述SNP位點(diǎn)對結(jié)核分枝桿菌的分型和進(jìn)化分析具有重要意義。

2)、本發(fā)明試劑盒、應(yīng)用和方法中所涉及的SNP位點(diǎn)1～285能夠?qū)?372個結(jié)核分枝桿菌細(xì)分為7個大譜系和67個亞譜系，M.bovis譜系及其亞譜系M.bovis1，分辨率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于現(xiàn)有SNP位點(diǎn)對結(jié)核分枝桿菌的分型(62個SNP位點(diǎn)將結(jié)核分枝桿菌劃分為55個亞譜系，或71個SNP位點(diǎn)將結(jié)核分枝桿菌劃分為10個亞譜系)；上述SNP位點(diǎn)1～285的分辨能力與本發(fā)明實(shí)施例中未經(jīng)優(yōu)化的106583個SNP位點(diǎn)(將結(jié)核分枝桿菌細(xì)分為7個大譜系和69個亞譜系，以及M.bovis譜系及其亞譜系M.bovis1)基本相當(dāng)，但所需要用到的SNP位點(diǎn)數(shù)量卻大大下降，在分辨率和所需檢測的SNP位點(diǎn)數(shù)量上取得平衡。

3)、本發(fā)明試劑盒、應(yīng)用和方法中所涉及的SNP位點(diǎn)1～285在對單個結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行分型時，其分型準(zhǔn)確率高，能夠?qū)⒔Y(jié)核分枝桿菌準(zhǔn)確地細(xì)分到具體的亞譜系。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實(shí)施方式，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為用優(yōu)化前的SNP集合構(gòu)建的進(jìn)化樹。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1、

按以下步驟在結(jié)核分枝桿菌的全基因組范圍篩選SNP位點(diǎn)：

1、菌株數(shù)據(jù)下載

從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載全球代表性2726株結(jié)核分枝桿菌全基因組數(shù)據(jù)。

2、對菌株測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評估

采用FastQC(version 0.10.1)軟件對菌株測序fastq文件GC含量進(jìn)行質(zhì)檢評估：(1)去除GC含量小于60％或大于70％測序數(shù)據(jù)；(2)去除SNP miss call大于15％的菌株測序數(shù)據(jù)。最終2372株結(jié)核分枝桿菌測序數(shù)據(jù)納入本研究。

3、統(tǒng)計回帖率

采用BWA(version 0.7.12)軟件將菌株的測序文件回帖到結(jié)核分枝桿菌參考基因組H37rv(NC_000962.3)上，對菌株回帖率進(jìn)行統(tǒng)計。

4、SNP Calling

將菌株的測序文件回帖到結(jié)核桿菌參考基因組H37Rv上進(jìn)行序列比對，將比對后的序列采用samtools v 1.3和picard-tools v 1.112工具對生成的Sam文件進(jìn)行Bam轉(zhuǎn)換、排序以及去重處理。采用變異鑒定軟件Varscan v2.4.0根據(jù)經(jīng)過處理得到的Bam文件進(jìn)行SNP鑒定，將基因組比對質(zhì)量小于30或者堿基質(zhì)量小于27的SNP位點(diǎn)舍去。

為提高SNP位點(diǎn)可信度，降低假陽性，對SNP位點(diǎn)按照下列標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步進(jìn)行過濾：(1)選取最小等位基因突變頻率大于于75％且有大于20條reads支持該位點(diǎn)的SNP位點(diǎn)；(2)去除分布在結(jié)核分枝桿菌PE/PPE家族SNP位點(diǎn)。

最終，從2372個測序菌株中得到106583個SNP位點(diǎn)。

實(shí)施例2、

按照以下步驟構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌的進(jìn)化樹：

1、樣本過濾

將GC含量小于60％或大于70％的菌株舍棄，回帖率小于85％的菌株舍棄，將SNP miss call大于15％的菌株舍去。過濾后得到樣本集合。

2、利用SNP位點(diǎn)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹：根據(jù)實(shí)施例1獲得的106583個SNP位點(diǎn)，以M.canettii(NC_019950.1)菌株為外群菌株，用RAxML(version 8.2.8)軟件采用極大似然法對過濾后的菌株樣本進(jìn)行進(jìn)化樹的構(gòu)建，選用Bootstrap value大于95％的分枝對進(jìn)化樹進(jìn)行譜系分群，最終得到7個譜系包含69個亞型以及M.bovis譜系包含1個亞型，共計78個分枝(系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖1)。具體而言，利用上述SNP位點(diǎn)將結(jié)核分枝桿菌細(xì)分為以下譜系：

譜系1及其亞譜系1.1，1.2，1.1.1，1.1.2，1.1.2.1，1.2.1，1.2.2，1.2.3，1.2.3.1，1.2.3.2(共10個亞譜系)；

譜系2及其亞譜系2.1，2.2，2.2.1，2.2.2(共4個亞譜系)；

譜系3及其亞譜系3.1，3.2(共2個亞譜系)；

譜系4及其亞譜系4.1，4.1.1，4.1.1.1，4.1.1.2，4.1.2，4.1.2.1，4.1.2.1.1，4.1.2.1.2，4.1.2.1.3，4.1.2.1.4，4.1.2.2，4.2，4.2.1，4.2.1.1，4.2.1.2，4.2.1.3，4.2.2，4.2.2.1，4.3，4.3.1，4.3.1.1，4.3.2，4.3.2.1，4.4，4.4.1，4.5，4.6，4.6.1，4.6.1.1，4.6.2，4.7，4.7.1，4.7.2，4.7.2.1，4.7.2.2，4.8，4.8.1，4.8.2，4.9，4.10，4.10.1，4.10.1.1，4.10.1.2，4.10.2，4.10.2.1，4.10.2.2，4.11，4.11.1，4.12，4.12.1，4.12.2，4.12.3，4.13(共53個亞譜系)；

譜系5；

譜系6；

譜系7；

M.bovis譜系及其亞譜系M.bovis1。

根據(jù)文獻(xiàn)中報道的19個RDs以及spoligotyping對下載的結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行注釋和粗略分型。將前述SNP分型結(jié)果與LSP和spoligotyping粗略分型的結(jié)果進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)二者的重合性好，從側(cè)面印證上述SNP位點(diǎn)的分型效果。

實(shí)施例3、

優(yōu)化SNP集合并評估其分型效果

1、獲得各分枝相關(guān)SNP集合

根據(jù)每個分枝，將分枝內(nèi)菌株和剩余菌株分別作為一個群體，采用Genepop(version4.5.1)軟件計算每個SNP位點(diǎn)的遺傳分化系數(shù)(Fst)，選用Fst大于0.99的SNP位點(diǎn)作為譜系相關(guān)SNP位點(diǎn)。

2、關(guān)鍵基因同義突變SNP集合獲得

選取文獻(xiàn)報道的結(jié)核分枝桿菌236個關(guān)鍵基因上的同義突變SNP位點(diǎn)作為最終集合，將分枝相關(guān)SNP位點(diǎn)用snpEff(version 4.3c)軟件進(jìn)行注釋，然后選取關(guān)鍵基因上的同義突變SNP位點(diǎn)，作為最終集合。經(jīng)過篩選得到位于關(guān)鍵基因上的285個譜系相關(guān)的同義SNP位點(diǎn)。該285個譜系相關(guān)的SNP位點(diǎn)的相關(guān)信息如下所示，其中SNP位點(diǎn)的物理位置是基于結(jié)核分枝桿菌H37Rv的全基因組序列比對確定的，所述結(jié)核分枝桿菌H37Rv的全基因組序列的Accession Number為NC_000962.3：

3、SNP集合優(yōu)化前后分型比對

將經(jīng)過優(yōu)化后的285個SNP位點(diǎn)構(gòu)建進(jìn)化樹，與SNP集合優(yōu)化前(即106583個SNP位點(diǎn))的分型效果進(jìn)行比對。優(yōu)化前，利用106583個SNP位點(diǎn)能夠?qū)⒔Y(jié)核分枝桿菌分為7大譜系和69個亞譜系，M.bovis譜系及亞譜系M.bovis1，而優(yōu)化之后，285個SNP位點(diǎn)能夠?qū)⒔Y(jié)核分枝桿菌分為7個大譜系和67個亞譜系(與優(yōu)化前的SNP集合相比，優(yōu)化后的SNP集合不能細(xì)分的亞譜系是2.2.2和3.1)，M.bovis譜系及其亞譜系M.bovis1。由此可見，優(yōu)化后的SNP集合中的SNP位點(diǎn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于優(yōu)化前的SNP集合，但其仍具有極高的分型能力，與優(yōu)化前SNP集合基本相當(dāng)。

4、SNP集合分型效果評估

從NCBI數(shù)據(jù)庫下載22株已知分型類型的結(jié)核分枝桿菌的完整參考基因組，根據(jù)最終得到的285個SNP集合對這些菌株進(jìn)行分型(參見表1)，285個SNP集合對完整參考基因組的分型結(jié)果與參考文獻(xiàn)一致。

表1已知參考菌株基因組注釋

最后應(yīng)說明的是：以上各實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述各實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分或者全部技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的范圍。