本發(fā)明屬于生命科學(xué)與臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更具體的，本發(fā)明涉及用于頭頸鱗狀細(xì)胞癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移速檢的LAMP引物組，以及頭頸鱗狀細(xì)胞癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的臨床、尤其是術(shù)中快速檢測方法。

背景技術(shù)：

頭頸鱗狀細(xì)胞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)在全球癌癥發(fā)病率中排第六位，全世界每年有近65萬新增病例，近年來惡性腫瘤診治手段日新月異，然而HNSCC的5年生存率并沒有明顯提高。HNSCC治療方案的選擇及預(yù)后判斷主要取決于TNM分期以及組織學(xué)分級，其中頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況對預(yù)后的影響較大。臨床上約47％的HNSCC患者就診時(shí)已經(jīng)伴有頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。因此頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的準(zhǔn)確檢測對于HNSCC選擇合理的治療方案以及個(gè)體預(yù)后至關(guān)重要。

目前國內(nèi)外頸淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移狀態(tài)主要依賴于局部觸診、影像學(xué)檢查、病理檢查等臨床診斷手段。盡管隨著超聲、CT、MRI、PET、超聲引導(dǎo)細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查、術(shù)中冰凍切片病理檢查等診斷技術(shù)的不斷發(fā)展，頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移在術(shù)前術(shù)中診斷方面已有了一定進(jìn)步，但迄今為止尚沒有一種方法的診斷正確率能夠完全滿足臨床需要，對于直徑小于2mm的微轉(zhuǎn)移灶更是無法準(zhǔn)確檢測。由于術(shù)前術(shù)中診斷手段較為局限，目前有10％～20％術(shù)前臨床診斷為頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性(clinical N+,cN+)的患者，術(shù)后病理檢查未發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而同時(shí)約有25％術(shù)前臨床診斷為頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性(clinical N0,cN0)的患者術(shù)后病理卻為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性。對于這1/4的cN0患者如果進(jìn)行隨訪觀察，患者將面臨治療不充分而帶來的巨大風(fēng)險(xiǎn)；而對于另3/4的cN0患者和前述部分cN+患者，額外的治療則完全沒有必要，過度治療帶給患者的只有治療風(fēng)險(xiǎn)和生活質(zhì)量下降。

現(xiàn)已有研究開始探索分子生物學(xué)檢測技術(shù)，即通過逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測上皮來源特異mRNA的表達(dá)來判斷淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移狀態(tài)。但常規(guī)的qRT-PCR分析一般需要3-4個(gè)小時(shí)的時(shí)間，不利于術(shù)中進(jìn)行，因此臨床特別需要一種能夠準(zhǔn)確、快速檢測頸淋巴結(jié)狀態(tài)的分子生物學(xué)方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述技術(shù)問題，填補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)空白，本發(fā)明在初步篩選出與HNSCC頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)的特異性分子標(biāo)志物的基礎(chǔ)上，建立了頭頸部鱗狀細(xì)胞癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移術(shù)中快速檢測方法，即應(yīng)用RT-LAMP檢測方法進(jìn)行檢測，在手術(shù)過程之中即可判斷淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移狀態(tài)，指導(dǎo)術(shù)中治療，確立有效、快速、低廉的檢測方法；不僅為腫瘤診斷的研究提供新的依據(jù)，而且能夠有效減少患者的痛苦，提高患者的預(yù)后，也可以大幅節(jié)省患者和醫(yī)院的開支，具有非常重要的臨床和社會意義。

本發(fā)明具體技術(shù)方案如下：

1、收集手術(shù)切除的新鮮標(biāo)本：組織標(biāo)本切取后，向臨床醫(yī)師確定腫瘤部位、范圍及肉眼可以判別的浸潤情況，并進(jìn)行描述和詳細(xì)的臨床記錄。

2、篩選HNSCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移特異性標(biāo)志物基因：通過文獻(xiàn)報(bào)道和檢索數(shù)據(jù)庫確定檢測HNSCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的可能mRNA標(biāo)志物。檢索來源包括：PubMed、OMIM、UniGene、GeneCards、CGAP。共預(yù)選出39個(gè)候選基因。使用qRT-PCR實(shí)驗(yàn)對上述候選基因進(jìn)行2輪篩選：

1)第一次基因篩選：選擇原發(fā)HNSCC患者19例腫瘤組織和非癌患者的15例良性淋巴結(jié)組織，非癌患者的診斷分別為：11例診斷結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、2例診斷頸動脈體瘤、1例診斷先天性甲狀舌管囊腫、1例診斷頭頸部皮下囊腫。應(yīng)用qRT-PCR法分析上述39個(gè)候選基因，選取明確差異表達(dá)的4個(gè)基因(CK7、CK19、EGFR、TACSTD1)用于后續(xù)研究；

2)第二次基因篩選：分別選擇原發(fā)HNSCC患者的36例腫瘤組織、19例病理診斷為陽性的淋巴結(jié)和19例病理診斷為陰性的淋巴結(jié)，提取初步篩選出的4個(gè)基因的mRNA，進(jìn)行qRT-PCR分析，確認(rèn)能夠區(qū)分HNSCC腫瘤組織、陽性淋巴結(jié)和陰性淋巴結(jié)的基因CK7、CK19并進(jìn)行分析，并進(jìn)一步得到最佳基因組合CK7+CK19。

3、LAMP檢測流程的建立

在確定了CK7、CK19以及CK7+CK19基因組合的基礎(chǔ)上，開始著手建立LAMP實(shí)驗(yàn)流程。整個(gè)流程建立包括實(shí)驗(yàn)試劑盒緩沖底液的制備、CK19及CK7引物設(shè)計(jì)及最佳反應(yīng)溫度測定三個(gè)方面。而其中的核心即引物設(shè)計(jì)，在對最佳引物的篩選實(shí)驗(yàn)中，同時(shí)得到了適當(dāng)?shù)木彌_底液及最佳反應(yīng)溫度。

本發(fā)明提供了一種CK7/CK19基因或蛋白在頭頸鱗狀細(xì)胞癌(HNSCC)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移快速檢測或診斷中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一組用于CK7基因RT-LAMP檢測的引物組，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8-12所示；本發(fā)明提供了三組用于CK19基因RT-LAMP檢測的引物組，其核苷酸序列如SEQ ID NO.25-29、35-40、41-46所示；以及所述引物組在HNSCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移快速檢測或診斷中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含擴(kuò)增CK7和/或CK19基因的特異性引物，優(yōu)選的，所述特異性引物為SEQ ID NO.8-12、25-29、35-40、41-46所示引物組；以及所述試劑盒在HNSCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移快速檢測或診斷中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種快速檢測頭頸鱗狀細(xì)胞癌(HNSCC)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的方法，其特征在于，使用RT-LAMP方法檢測淋巴結(jié)中CK7基因的表達(dá)水平。具體步驟如下：1)分離淋巴結(jié)組織，并提取總RNA；2)進(jìn)行RT-LAMP擴(kuò)增。所述LAMP擴(kuò)增優(yōu)選使用SEQ ID NO.8-12所示引物組；擴(kuò)增溫度為65℃，恒溫反應(yīng)時(shí)間為60min。

本發(fā)明提供了一種CK7基因/蛋白與CK19基因/蛋白在頭頸鱗狀細(xì)胞癌(HNSCC)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移快速檢測或診斷中的聯(lián)合應(yīng)用，即使用RT-LAMP方法檢測淋巴結(jié)中CK7基因和CK19基因的表達(dá)水平。所述RT-LAMP檢測優(yōu)選使用下述引物組：1)SEQ ID NO.8-12所示引物；2)SEQ ID NO.25-29所示引物；3)SEQ ID NO.35-40所示引物；或/和4)SEQ ID NO.41-46所示引物。

本發(fā)明篩選出用于快速檢測HNSCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的特異性標(biāo)志物基因及其基因組合，即CK7、CK19、CK7+CK19；建立了HNSCC患者淋巴結(jié)快速檢測技術(shù)體系，即應(yīng)用RT-LAMP法進(jìn)行淋巴結(jié)狀態(tài)檢測，并將整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程控制在四十分鐘左右，適應(yīng)于術(shù)中快速檢測需求。

通過對HNSCC患者淋巴結(jié)RT-LAMP檢測數(shù)據(jù)和石蠟病理結(jié)果的對比，充分驗(yàn)證該檢測方法的準(zhǔn)確性。最終證明了RT-LAMP技術(shù)的優(yōu)越性，即：耗費(fèi)時(shí)間短，實(shí)驗(yàn)溫度低、結(jié)果準(zhǔn)確性高且判讀方式簡便。以RT-LAMP技術(shù)為基礎(chǔ)建立的HNSCC淋巴結(jié)快速診斷體系，使此類患者術(shù)中快速判定其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)成為可能。

附圖說明

圖1：淋巴結(jié)取材示意圖。

圖2：a.腫瘤瘤體石蠟病理切片-箭頭所示為喉癌瘤體細(xì)胞；b.腫瘤瘤體石蠟病理切片-高倍鏡下可見明顯癌栓。

圖3：第一次篩選標(biāo)本mRNA電泳圖，M：DNA Marker：DM2000，從下往上依次為100,250,500,750,1000和2000bp，其中750bp為亮帶，此處展示的標(biāo)本為HNSCC 1-15，LN1-9。

圖4：TACSTD1擴(kuò)增曲線及溶解曲線。

圖5：CK19擴(kuò)增曲線及溶解曲線。

圖6：CK7擴(kuò)增曲線及溶解曲線。

圖7：EGFR擴(kuò)增曲線及溶解曲線。

圖8：a.第二次篩選標(biāo)本mRNA電泳圖樣本PN1-19；b.第二次篩選標(biāo)本mRNA電泳圖樣本BN1-19。

圖9：二次篩選TACSTD1擴(kuò)增曲線及溶解曲線。

圖10：二次篩選CK19擴(kuò)增曲線及溶解曲線。

圖11：二次篩選CK7擴(kuò)增曲線及溶解曲線。

圖12：二次篩選EGFR擴(kuò)增曲線及溶解曲線。

圖13：4種明顯差異性基因相關(guān)性分析：a.將目標(biāo)基因進(jìn)行分組統(tǒng)計(jì)，CK7和CK19基因組合能夠更加準(zhǔn)確的區(qū)分頭頸部鱗狀細(xì)胞癌患者頸部陽性和陰性淋巴結(jié)；b.在進(jìn)一步的等概率統(tǒng)計(jì)中，CK7和CK19組合區(qū)分頭頸部鱗狀細(xì)胞癌患者頸部淋巴結(jié)良惡性的優(yōu)勢相較于其他基因組合就更加明顯。

圖14：CK7及CK19酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果。BN表示陰性淋巴結(jié)，PN表示陽性淋巴結(jié)。

圖15：LAMP引物的設(shè)計(jì)位置與組成。

圖16：CK7最佳引物篩選。

圖17：CK19最佳引物篩選。

圖18：RT-LAMP實(shí)驗(yàn)流程示意圖。

圖19：BN組CK7RT-LAMP結(jié)果。

圖20：BN組CK19RT-LAMP結(jié)果。

圖21：PN組CK7RT-LAMP結(jié)果：

a.PN1-PN32號樣本CK-7RT-LAMP檢測結(jié)果；

b.PN33-PN65號樣本CK-7RT-LAMP檢測結(jié)果。

圖22：PN組CK19RT-LAMP結(jié)果：

a.PN1-PN32號樣本CK-19RT-LAMP檢測結(jié)果；

b.PN33-PN65號樣本CK-19RT-LAMP檢測結(jié)果。

圖23：a.BN34號標(biāo)本石蠟切片；b.BN35號標(biāo)本石蠟切片；c.BN36號標(biāo)本石蠟切片；d.BN37號標(biāo)本石蠟切片；e.BN38號標(biāo)本石蠟切片；均為40倍放大。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體的實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步介紹。

實(shí)施例1：標(biāo)本的收取及保存

收集手術(shù)切除的新鮮標(biāo)本，包括頭頸腫瘤組織、癌旁組織、癌周正常組織及頸部淋巴結(jié)組織。組織標(biāo)本切取后，首先需向臨床醫(yī)師確定腫瘤部位、范圍及肉眼可以判別的浸潤情況，并進(jìn)行描述和記錄。

1、腫瘤、癌旁及癌周正常組織的收取：

標(biāo)本取材遵循“癌周-癌旁-腫瘤組織”的原則。為保證標(biāo)本mRNA活性和確定該組織的病理學(xué)特征，需要將留取的組織標(biāo)本做如下處理：1)于腫瘤組織明顯部位(并不一定是中心部位)取材，需避開壞死部分；2)取稍大的立方體或長方體組織塊；3)將離體組織塊沿長軸切開，鏡像分割標(biāo)本，并記錄編號(A,B)；4)將組織塊A立即用中性福爾馬林固定，并于近期進(jìn)行病理切片；組織塊B必須在標(biāo)本離體30分鐘內(nèi)浸泡至RNA緩沖液中，以保證mRNA活性：每塊組織長寬高均≤0.5cm，緩沖液量需是新鮮組織5-10倍；常溫下放置一段時(shí)間(或置于4℃冰箱內(nèi)過夜)以利于緩沖液滲透，后放于低溫設(shè)備中保存。

2、淋巴結(jié)的取材及收?。?/p>

分理出整體淋巴結(jié)，盡量去除包膜和周圍脂肪等殘余組織，將其均勻分成4份(a’，b’，c’，d’)，立即行快速冰凍病理切片，每個(gè)切面都留取一張冰凍切片且標(biāo)號，及時(shí)閱片確定該淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，后將a’、c’部分組織用于分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，b’、d’部分組織用于石蠟切片，進(jìn)一步判斷淋巴結(jié)性質(zhì)及腫瘤轉(zhuǎn)移狀態(tài)，留存完整病理信息。

3、標(biāo)本編號及入庫

本發(fā)明研究涉及新鮮組織標(biāo)本、血標(biāo)本以及基于以上標(biāo)本的各類衍生信息，包括石蠟病理切片、冰凍病理切片、血漿、血細(xì)胞、RNA/DNA信息等，因此需將以上標(biāo)本分類、編號并入庫保存以利于取用。需要編號的標(biāo)本媒介包括：凍存管、凍存盒、蠟塊、切片、EP管。編號遵循以下原則：

·按照生物樣本采集規(guī)范，頭頸部癌標(biāo)記“H/3”；

·每個(gè)標(biāo)本媒介必須標(biāo)注留取日期及患者病歷號；

·留取部位標(biāo)示：T—腫瘤P—瘤旁N—瘤周L—淋巴結(jié)；

·另需在媒介上明確冰箱/蠟塊柜/切片柜、層架、位置等信息；

·紙質(zhì)版及電子版信息的留存；

·及時(shí)加入取用標(biāo)本的RNA/DNA信息。

對用于下一步分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)本進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制，是保證后續(xù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠性的關(guān)鍵原則。對留取的標(biāo)本(尤其是腫瘤瘤體標(biāo)本和淋巴結(jié)標(biāo)本)進(jìn)行常規(guī)病理切片，并經(jīng)由病理專家閱片，以確定標(biāo)本組織學(xué)類型及腫瘤浸潤情況并進(jìn)行登記。對于腫瘤瘤體組織，只選取其瘤體面積≥60％的組織塊進(jìn)行下一步分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)(見圖2、3)。

4、標(biāo)本庫樣本量及實(shí)驗(yàn)樣本量

本發(fā)明用于實(shí)驗(yàn)研究的標(biāo)本份數(shù)為328例。依照標(biāo)本質(zhì)控原則，選擇符合標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)本組織投入到分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，包括頭頸部癌瘤體組織109例、頭頸部癌陽性淋巴結(jié)66例、頭頸部癌陰性淋巴結(jié)107例，非癌患者良性淋巴結(jié)46例。

實(shí)施例2：HNSCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移特異性標(biāo)志物基因的篩選

1、候選基因的確定

通過文獻(xiàn)報(bào)道和檢索數(shù)據(jù)庫確定檢測HNSCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的可能mRNA標(biāo)志物。檢索來源包括：PubMed、OMIM、UniGene、GeneCards、CGAP。預(yù)選候選基因的原則是該基因在HNSCC中表達(dá)量較正常淋巴結(jié)組織表達(dá)異常，即高表達(dá)或低表達(dá)，或者該基因在HNSCC中上調(diào)或下調(diào)并且有獨(dú)特的組織特異性，或者該基因具有腫瘤特異性。依據(jù)以上原則，共預(yù)選出39個(gè)候選基因(見表1)。

表1.初級篩選研究的候選基因

2、qRT-PCR實(shí)驗(yàn)對候選基因進(jìn)行2次篩選

具體實(shí)驗(yàn)方法簡述如下：

1)第一次基因篩選：選擇原發(fā)HNSCC患者19例腫瘤組織和非癌患者的15例良性淋巴結(jié)組織，非癌患者的診斷分別為：11例診斷結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、2例診斷頸動脈體瘤、1例診斷先天性甲狀舌管囊腫、1例診斷頭頸部皮下囊腫。應(yīng)用qRT-PCR法分析上述39個(gè)候選基因，選取明確差異表達(dá)的4個(gè)基因用于后續(xù)研究；

2)第二次基因篩選：分別選擇原發(fā)HNSCC患者的36例腫瘤組織、19例病理診斷為陽性的淋巴結(jié)和19例病理診斷為陰性的淋巴結(jié)，提取初步篩選出的4個(gè)基因的mRNA，進(jìn)行qRT-PCR分析，確認(rèn)能夠區(qū)分HNSCC腫瘤組織、陽性淋巴結(jié)和陰性淋巴結(jié)的基因并進(jìn)行分析，進(jìn)而得到最佳基因組合。

詳細(xì)實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果如下：

1)第一次基因篩選：

各樣品RealTimePCR檢測：本次qRT-PCR共涉及34例標(biāo)本組織，檢測39個(gè)基因，根據(jù)目標(biāo)基因設(shè)計(jì)特異性引物如下(見表2)。

表2.39個(gè)候選基因的特異性引物

使用分子生物學(xué)常規(guī)方法提取樣本總RNA，得到的RNA保存在-80℃，防止降解。取5μl RNA用1％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，檢測RNA的完整性(見圖4)。用DNase-Ⅰ試劑盒(CWbio.Co.Ltd，Cat#CW2090)對RNA中殘留的DNA進(jìn)行消化處理，實(shí)驗(yàn)操作按說明書進(jìn)行。測定標(biāo)本mRNA提取純度、濃度及總量來驗(yàn)證標(biāo)本的質(zhì)量。從標(biāo)本電泳和mRNA提取情況中得到對標(biāo)本組織質(zhì)量控制情況的驗(yàn)證，所有組織標(biāo)本質(zhì)量高，可以用于后期分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。用HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒(CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0744)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

RealTimePCR使用Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀，采用2^-△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對定量分析。RealTimePCR反應(yīng)體系如下(見表3)，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃10min，(95℃15sec， 60℃60sec)×40個(gè)循環(huán)。

表3.RealTimePCR反應(yīng)體系

將各樣品cDNA 10倍稀釋后取2ul作模板，分別用目的基因引物和內(nèi)參基因引物進(jìn)行擴(kuò)增(表4)。同時(shí)在60-95℃進(jìn)行溶解曲線分析。

表4.樣品RealTimePCR檢測設(shè)計(jì)

本次qRT-PCR試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)了在原發(fā)HNSCC腫瘤組織和非癌的良性淋巴結(jié)組織中差異明顯的4個(gè)基因，即：TACSTD1；CK19；CK7；EGFR。各樣本實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線圖和樣本擴(kuò)增產(chǎn)物溶解曲線圖請見圖5-8。溶解曲線均為單峰，未見非特異性擴(kuò)增，PCR定量準(zhǔn)確。按照2^-△△ct相對定量計(jì)算公式，即：

計(jì)算出各樣品的目的基因相對定量結(jié)果，即其他各個(gè)樣品相對于對照樣品(以非癌良性淋巴結(jié)1號組織為對照樣本)，目的基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的差異，結(jié)果數(shù)據(jù)如下(見表5-8)：

表5.TACSTD1相對熒光定量數(shù)據(jù)-第一次篩選

表6.CK19相對熒光定量數(shù)據(jù)-第一次篩選

表7.CK7相對熒光定量數(shù)據(jù)-第一次篩選

表8.EGFR相對熒光定量數(shù)據(jù)-第一次篩選

經(jīng)由以上數(shù)據(jù)可以看出，TACSTD1、CK19、CK7、EGFR在HNSCC患者的腫瘤組織中表達(dá)量明顯高于非癌患者的良性淋巴結(jié)組織表達(dá)量，具有顯著的組織學(xué)差異性。因此，將這4個(gè)基因列為初步篩選出的目標(biāo)基因，進(jìn)入第二次基因篩選，進(jìn)一步分析目標(biāo)基因在腫瘤組織、頸部陽性淋巴結(jié)、陰性淋巴結(jié)中的表達(dá)差異性。

2)第二次基因篩選：

第二次基因篩選，采用“腫瘤組織：陽性淋巴結(jié)：陰性淋巴結(jié)”的分組方式，旨在分析該基因在HNSCC患者頸部轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的特異性表達(dá)情況。選擇來自36例原發(fā)HNSCC患者的36例腫瘤組織(其中第1-19例為第一次基因篩選的樣本，數(shù)據(jù)不重復(fù)展示，請參見表5-8HNSCC瘤體標(biāo)本ct值)、來自7例患者的19例病理診斷為陽性的淋巴結(jié)組織和來自10例患者的19例病理診斷為陰性的淋巴結(jié)組織，就初篩出的4個(gè)在頭頸部癌組織和非癌良性淋巴 結(jié)組織中表達(dá)差異性明顯的目標(biāo)基因進(jìn)行了第二次PCR篩選。

RealTimePCR檢測方法與第一次基因篩選相同，此處不再贅述。74例樣本的RNA質(zhì)量檢測詳見圖8。結(jié)果顯示組織標(biāo)本質(zhì)量高，可以用于后期分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。各樣本實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線圖和樣本擴(kuò)增產(chǎn)物溶解曲線圖請見圖9-12。溶解曲線均為單峰，未見非特異性擴(kuò)增，PCR定量準(zhǔn)確。計(jì)算出各樣品的目的基因相對定量結(jié)果，即其他各個(gè)樣品相對于對照樣品(以HNSCC陰性淋巴結(jié)2號組織為對照樣本)，目的基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的差異，結(jié)果數(shù)據(jù)如下(見表9-12)：

表9.TACSTD1相對熒光定量數(shù)據(jù)-第二次篩選

注：HNSCC表示頭頸部癌瘤體組織，PN表示頭頸部癌患者陽性淋巴結(jié)組織，BN表示頭頸部癌患者陰性淋巴結(jié)組織

表10.CK19相對熒光定量數(shù)據(jù)-第二次篩選

注：HNSCC表示頭頸部癌瘤體組織，PN表示頭頸部癌患者陽性淋巴結(jié)組織，BN表示頭頸部癌患者陰性淋巴結(jié)組織

表11.CK7相對熒光定量數(shù)據(jù)-第二次篩選

注：HNSCC表示頭頸部癌瘤體組織，PN表示頭頸部癌患者陽性淋巴結(jié)組織，BN表示頭頸部癌患者陰性淋巴結(jié)組織

表12.EGFR相對熒光定量數(shù)據(jù)-第二次篩選

注：HNSCC表示頭頸部癌瘤體組織，PN表示頭頸部癌患者陽性淋巴結(jié)組織，BN表示頭頸部癌患者陰性淋巴結(jié)組織

根據(jù)數(shù)據(jù)可以看出，目標(biāo)基因基本上符合在腫瘤組織及陽性淋巴結(jié)中高表達(dá)，在陰性淋巴結(jié)中低表達(dá)的組織學(xué)差異性。

但是仍然可以看到某個(gè)標(biāo)本在某個(gè)基因的相對熒光定量結(jié)果與上述結(jié)論相悖，即病理診斷陽性的淋巴結(jié)基因表達(dá)量低(例如PN19/TACSTD1/CK19/EGFR、PN2/CK7、PN3/CK7、PN13-19/CK7、PN4/EGFR)，甚至低于陰性淋巴結(jié)基因表達(dá)量；而病理診斷陰性的淋巴結(jié)基因表達(dá)量高，甚至高于陽性淋巴結(jié)基因表達(dá)量。產(chǎn)生這種情況的可能性有：a.由于病理切片的局限性及人為主觀診斷差異而造成的誤診或漏診，進(jìn)而造成病理結(jié)果和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致；b.由于qRT-PCR特異性強(qiáng)、敏感性高所致的某個(gè)標(biāo)本在某個(gè)基因上出現(xiàn)假陽性或假陰性可能；c.由于個(gè)體差異性和對疾病的整體綜合反應(yīng)而造成的某個(gè)患者在某個(gè)基因的過表達(dá)或者低表達(dá)。

因此，使用多目標(biāo)基因擴(kuò)增結(jié)果判斷患者頸部淋巴結(jié)狀態(tài)的準(zhǔn)確性顯然高于單一基因判斷。但同時(shí)，選擇檢測的目標(biāo)基因越多，診斷過程中所涉及的和患者所要承擔(dān)的醫(yī)療成本和時(shí)間成本也就越大，因此對目標(biāo)基因第二次篩選結(jié)果進(jìn)行了進(jìn)一步分析。

在此基礎(chǔ)上，將這4種目標(biāo)基因的淋巴結(jié)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性比較后發(fā)現(xiàn)，CK19和CK7組合在分析頸部淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移狀態(tài)上有著更好的組織學(xué)差異性(圖13a、13b)，即該基因組合可以更加準(zhǔn)確的區(qū)分頭頸部鱗狀細(xì)胞癌患者頸部淋巴結(jié)的性質(zhì)。

3)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果(Elisa實(shí)驗(yàn))

以來自24名HNSCC患者的9例陽性淋巴結(jié)及15例陰性淋巴結(jié)進(jìn)行Elisa實(shí)驗(yàn)，得到的結(jié)果如圖14。根據(jù)以上結(jié)果，同樣證實(shí)了CK7+CK19在HNSCC患者淋巴結(jié)檢測中的組織學(xué)差異性。

實(shí)施例3：LAMP檢測流程的建立

在確定了CK7、CK19以及CK7+CK19基因組合的基礎(chǔ)上，開始著手建立LAMP實(shí)驗(yàn)流程。整個(gè)流程建立包括實(shí)驗(yàn)試劑盒緩沖底液的制備、CK19及CK7引物設(shè)計(jì)及最佳反應(yīng)溫度測定三個(gè)方面。而其中的核心即引物設(shè)計(jì)，在對最佳引物的篩選實(shí)驗(yàn)中，同時(shí)得到了適當(dāng)?shù)木彌_底液及最佳反應(yīng)溫度。流程建立實(shí)驗(yàn)選取來自36名HNSCC患者的54例腫瘤組織及來自15名非癌患者的31例良性淋巴結(jié)組織，通過建立RT-LAMP反應(yīng)體系篩選最佳引物及測試反應(yīng)條件?；颊叩娜虢M標(biāo)準(zhǔn)同前。

1)引物設(shè)計(jì)

使用軟件Primer Explorer V4設(shè)計(jì)目的基因的LAMP引物，CK7基因全序列為SEQ ID NO.1，CK19基因全序列為SEQ ID NO.2。將待擴(kuò)增的DNA分為六個(gè)獨(dú)立的區(qū)域，根據(jù)這六個(gè)區(qū)域分別設(shè)計(jì)LAMP反應(yīng)所需的引物(內(nèi)引物FIP和BIP、外引物F3和B3、環(huán)引物L(fēng)B、LF；內(nèi)引物和外引物為LAMP發(fā)生的必須引物，環(huán)引物L(fēng)B和LF為加速引物，為LAMP發(fā) 生的非必須引物，由靶序列的Tm值和GC含量共同決定能否設(shè)計(jì)出環(huán)引物，它們的設(shè)計(jì)位置以及各個(gè)引物在靶序列上的位置詳見圖15。

據(jù)此原則，設(shè)計(jì)4套LAMP引物擴(kuò)增靶基因CK7，引物核苷酸序列分別為：SEQ ID NO.3-24；設(shè)計(jì)4套LAMP引物擴(kuò)增靶基因CK7，引物核苷酸序列分別為：SEQ ID NO.25-46。

2)RT-LAMP反應(yīng)體系

提取樣本總RNA、電泳、消化及反轉(zhuǎn)錄過程同前述實(shí)驗(yàn)過程，在此不做贅述。

25μl反應(yīng)混合物(緩沖底液)各組分及濃度見表13，同時(shí)，實(shí)驗(yàn)得出的反應(yīng)溫度為65℃，恒溫反應(yīng)時(shí)間為60min。

表13.RT-LAMP反應(yīng)各組分及濃度

3)最佳引物篩選結(jié)果

針對CK7的最佳引物篩選，由圖16可知，CK7-18發(fā)生LAMP的反應(yīng)時(shí)間最短(26分鐘以內(nèi))，擴(kuò)增曲線最高(濁度在0.71)，說明CK7-18的擴(kuò)增效率最高，為擴(kuò)增靶序列的最佳引物。

針對CK19的最佳引物篩選，由圖17可知，CK19-33發(fā)生LAMP的反應(yīng)時(shí)間最短(26分鐘以內(nèi))，擴(kuò)增曲線最高(濁度在0.51)，說明CK19-33的擴(kuò)增效率最高，為擴(kuò)增靶序列的最佳引物；同時(shí)，引物CK19-146、CK19-115發(fā)生LAMP的反應(yīng)時(shí)間也控制在36分鐘以內(nèi)，濁度在0.25-0.4，也能夠作為臨床檢測擴(kuò)增靶序列CK19的有效引物。

4)實(shí)驗(yàn)流程的建立

根據(jù)前述實(shí)驗(yàn)，LAMP的實(shí)驗(yàn)流程已經(jīng)基本建立，得到了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所需的基因探針，并且得到了最佳的引物設(shè)計(jì)及緩沖底，除此之外，建立的標(biāo)本庫也按照質(zhì)控原則收取了驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)的樣本，因此，將整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行了總結(jié)，并準(zhǔn)備下一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(圖18)。

在驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)中，共收取來自84名HNSCC患者的103例淋巴結(jié)，將其按圖1所示取材，a、c部分留作RT-LAMP實(shí)驗(yàn)，b、d部分進(jìn)行包埋，制作石蠟切片，并由專門的病理科副主任醫(yī)師獨(dú)立閱片，確定樣本的轉(zhuǎn)移狀態(tài)。因此，按照病理結(jié)果，將這103例淋巴結(jié)分為BN 組(38例)和PN組(65例)，最后，將他們的病理結(jié)果和RT-LAMP結(jié)果(擴(kuò)增曲線見圖19、20、21a、21b、22a、22b)對比。

表14.BN組淋巴結(jié)RT-LAMP反應(yīng)時(shí)間

注：單位(M)分鐘，數(shù)據(jù)保留小數(shù)點(diǎn)后1位

表15.PN組淋巴結(jié)RT-LAMP反應(yīng)時(shí)間

注：單位(M)分鐘，數(shù)據(jù)保留小數(shù)點(diǎn)后1位

數(shù)據(jù)結(jié)果分析：經(jīng)過RT-LAMP數(shù)據(jù)分析，不難發(fā)現(xiàn)BN組有5例標(biāo)本出現(xiàn)了CK7以及CK19的高表達(dá)，這與石蠟病理結(jié)果并不一致。因此，將標(biāo)號為BN34-38號蠟塊進(jìn)行了連續(xù)切片，并且由病理科副主任醫(yī)師重新閱片，最終發(fā)現(xiàn)了腫瘤細(xì)胞的微轉(zhuǎn)移病灶(圖23a-e)。充分證實(shí)了RT-LAMP檢測方法的準(zhǔn)確性及可靠性。

除此之外，由于建立反應(yīng)體系時(shí)，RT-LAMP根據(jù)HNSCC患者瘤體的擴(kuò)增數(shù)據(jù)顯示，其擴(kuò)增時(shí)間均發(fā)生在60min之內(nèi)，因此，在驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，超過60min仍沒有明顯擴(kuò)增的標(biāo)本， 即視為陰性淋巴結(jié)。

最后，根據(jù)RT-LAMP結(jié)果，HNSCC患者病理確診為陽性的淋巴結(jié)的擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間值數(shù)據(jù)總結(jié)如下(表16)：

表16.HNSCC患者陽性淋巴結(jié)RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)數(shù)據(jù)

注：單位(分鐘)，結(jié)果保留小數(shù)點(diǎn)后2位

由此，以RT-LAMP技術(shù)為基礎(chǔ)建立的HNSCC淋巴結(jié)快速診斷體系，使此類患者術(shù)中快速判定其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)成為可能。

SEQUENCE LISTING

<110> 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院

<120> 一組用于頭頸鱗狀細(xì)胞癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移速檢的LAMP引物組CK7-18

<160> 46

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2000

<212> DNA

<213> CK7基因全序列

<400> 1

aaaaggcgcg gagtgtcccc gaggtcagcg agtgcgcgct cctcctcgcc cgccgctagg 60

tccatcccgg cccagccacc atgtccatcc acttcagctc cccggtattc acctcgcgct 120

cagccgcctt ctcgggccgc ggcgcccagg tgcgcctgag ctccgctcgc cccggcggcc 180

ttggcagcag cagcctctac ggcctcggcg cctcacggcc gcgcgtggcc gtgcgctctg 240

cctatggggg cccggtgggc gccggcatcc gcgaggtcac cattaaccag agcctgctgg 300

ccccgctgcg gctggacgcc gacccctccc tccagcgggt gcgccaggag gagagcgagc 360

agatcaagac cctcaacaac aagtttgcct ccttcatcga caaggtgcgg tttctggagc 420

agcagaacaa gctgctggag accaagtgga cgctgctgca ggagcagaag tcggccaaga 480

gcagccgcct cccagacatc tttgaggccc agattgctgg ccttcggggt cagcttgagg 540

cactgcaggt ggatgggggc cgcctggagg cggagctgcg gagcatgcag gatgtggtgg 600

aggacttcaa gaataagtac gaagatgaaa ttaaccaccg cacagctgct gagaatgagt 660

ttgtggtgct gaagaaggat gtggatgctg cctacatgag caaggtggag ctggaggcca 720

aggtggatgc cctgaatgat gagatcaact tcctcaggac cctcaatgag acggagttga 780

cagagctgca gtcccagatc tccgacacat ctgtggtgct gtccatggac aacagtcgct 840

ccctggacct ggacggcatc atcgctgagg tcaaggcgca gtatgaggag atggccaaat 900

gcagccgggc tgaggctgaa gcctggtacc agaccaaggt gtgaggccac caggggcgta 960

tttcctcctg ccagggtcct tggtggcagc ttcccttact cctcaacttg tctcaagcct 1020

tcagggcctg ggtcccactg ttctggcagg caccagtggt ttaagtctgt ggtgctcagc 1080

cctggagaaa atcccaagat gggaggacag ggcagaggaa atagatatgg attaatcatt 1140

ataatagcta aaatatggca agtacttaca cagtactagg ctcatgtaat tattgactca 1200

tgtaatccac agaacagccc tattagatag gcatcattat tacccccatt ttgttttatt 1260

taatttaatt tattttattt ctattttttg agatggagtc ttgctctgtc acccaggctg 1320

aagtgcagtg gtgcgatctt ggctcactgc aacctttgcc tccctggttc atgtgatcct 1380

cgtgcctcag cctcctgagt agctgggact acaggtgtgc accaccatgc ctggctaatt 1440

ttttttgtat tttgagtaga gacgaggttt caccatgctg gccaggctgg tctcaaactc 1500

ctgacctcag gtgatccacc tgcctcggcc tcccaaagtg ctgggattat aggcgtgaga 1560

caccgcaccc agcctattac ccccatttaa agatgaggaa attgaggcac agagaggtta 1620

agtaatttgc ctaactgcat acagctagta gatggaagag cagggactaa atcctgaatg 1680

tgagggccct agacctggga ggcttaatca tcacatctac ttcatggtgg caggacagtt 1740

gatggtgcag gggctgaggg agcaggagtg ggtgctgggg tgaaccagtg ttcctgaaga 1800

agggatcccg aggcaaggat tgagaggtct gcccctgcag agatagagag tcattcatgg 1860

tgcctgggtg agaacacaag tatgccaaca agaagacctg ggttcaggcc ctcgttccat 1920

cactgattgg ctgtgtgatc cctgggtggt gctttctctt ctccaagact cactctcctc 1980

acctgtgaaa tgggtgttct 2000

<210> 2

<211> 1490

<212> DNA

<213> CK19基因全序列

<400> 2

agatatccgc ccctgacacc attcctccct tcccccctcc accggccgcg ggcataaaag 60

gcgccaggtg agggcctcgc cgctcctccc gcgaatcgca gcttctgaga ccagggttgc 120

tccgtccgtg ctccgcctcg ccatgacttc ctacagctat cgccagtcgt cggccacgtc 180

gtccttcgga ggcctgggcg gcggctccgt gcgttttggg ccgggggtcg cctttcgcgc 240

gcccagcatt cacgggggct ccggcggccg cggcgtatcc gtgtcctccg cccgctttgt 300

gtcctcgtcc tcctcggggg cctacggcgg cggctacggc ggcgtcctga ccgcgtccga 360

cgggctgctg gcgggcaacg agaagctaac catgcagaac ctcaacgacc gcctggcctc 420

ctacctggac aaggtgcgcg ccctggaggc ggccaacggc gagctagagg tgaagatccg 480

cgactggtac cagaagcagg ggcctgggcc ctcccgcgac tacagccact actacacgac 540

catccaggac ctgcgggaca agattcttgg tgccaccatt gagaactcca ggattgtcct 600

gcagatcgac aatgcccgtc tggctgcaga tgacttccga accaagtttg agacggaaca 660

ggctctgcgc atgagcgtgg aggccgacat caacggcctg cgcagggtgc tggatgagct 720

gaccctggcc aggaccgacc tggagatgca gatcgaaggc ctgaaggaag agctggccta 780

cctgaagaag aaccatgagg aggaaatcag tacgctgagg ggccaagtgg gaggccaggt 840

cagtgtggag gtggattccg ctccgggcac cgatctcgcc aagatcctga gtgacatgcg 900

aagccaatat gaggtcatgg ccgagcagaa ccggaaggat gctgaagcct ggttcaccag 960

ccggactgaa gaattgaacc gggaggtcgc tggccacacg gagcagctcc agatgagcag 1020

gtccgaggtt actgacctgc ggcgcaccct tcagggtctt gagattgagc tgcagtcaca 1080

gctgagcatg aaagctgcct tggaagacac actggcagaa acggaggcgc gctttggagc 1140

ccagctggcg catatccagg cgctgatcag cggtattgaa gcccagctgg gcgatgtgcg 1200

agctgatagt gagcggcaga atcaggagta ccagcggctc atggacatca agtcgcggct 1260

ggagcaggag attgccacct accgcagcct gctcgaggga caggaagatc actacaacaa 1320

tttgtctgcc tccaaggtcc tctgaggcag caggctctgg ggcttctgct gtcctttgga 1380

gggtgtcttc tgggtagagg gatgggaagg aagggaccct tacccccggc tcttctcctg 1440

acctgccaat aaaaatttat ggtccaaggg aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1490

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> CK7-9F3

<400> 3

cccagatctc cgacacatct 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> CK7-9B3

<400> 4

cctgaaggct tgagacaagt 20

<210> 5

<211> 43

<212> DNA

<213> CK7-9FIP

<400> 5

ccttgacctc agcgatgatg ccttggtgct gtccatggac aac 43

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> CK7-9BIP

<400> 6

gaagcctggt accagaccaa ggttgaagct gccaccaagg ac 42

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> CK7-9LB

<400> 7

aggccaccag gggcgtatt 19

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> CK7-18F3

<400> 8

gtcacccagg ctgaagtg 18

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> CK7-18B3

<400> 9

acctgaggtc aggagtttga 20

<210> 10

<211> 42

<212> DNA

<213> CK7-18FIP

<400> 10

actcaggagg ctgaggcacg ttgatcttgg ctcactgcaa cc 42

<210> 11

<211> 42

<212> DNA

<213> CK7-18BIP

<400> 11

gactacaggt gtgcaccacc attgcatggt gaaacctcgt ct 42

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> CK7-18L

<400> 12

aggatcacat gaaccaggga g 21

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> CK7-2F3

<400> 13

gtggatgccc tgaatgatga 20

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> CK7-2B3

<400> 14

accaggcttc agcctcag 18

<210> 15

<211> 44

<212> DNA

<213> CK7-2FIP

<400> 15

acagcaccac agatgtgtcg gattcttcct caggaccctc aatg 44

<210> 16

<211> 41

<212> DNA

<213> CK7-2BIP

<400> 16

ggacaacagt cgctccctgg ttccatctcc tcatactgcg c 41

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> CK7-2LF

<400> 17

gcagctctgt caactccgt 19

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> CK7-2LB

<400> 18

acctggacgg catcatcg 18

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> CK7-6F3

<400> 19

gtggatgccc tgaatgatga 20

<210> 20

<211> 18

<212> DNA

<213> CK7-6B3

<400> 20

accaggcttc agcctcag 18

<210> 21

<211> 44

<212> DNA

<213> CK7-6FIP

<400> 21

acagcaccac agatgtgtcg gattccctca atgagacgga gttg 44

<210> 22

<211> 41

<212> DNA

<213> CK7-6BIP

<400> 22

ggacaacagt cgctccctgg ttccatctcc tcatactgcg c 41

<210> 23

<211> 18

<212> DNA

<213> CK7-6LF

<400> 23

ctgggactgc agctctgt 18

<210> 24

<211> 18

<212> DNA

<213> CK7-6LB

<400> 24

acctggacgg catcatcg 18

<210> 25

<211> 16

<212> DNA

<213> CK19-33F3

<400> 25

caggacctgc gggaca 16

<210> 26

<211> 17

<212> DNA

<213> CK19-33B3

<400> 26

tgcatctcca ggtcggt 17

<210> 27

<211> 43

<212> DNA

<213> CK19-33FIP

<400> 27

ccagacgggc attgtcgatc tttattcttg gtgccaccat tga 43

<210> 28

<211> 40

<212> DNA

<213> CK19-33BIP

<400> 28

gagacggaac aggctctgcg ttgccagggt cagctcatcc 40

<210> 29

<211> 17

<212> DNA

<213> CK19-33LB

<400> 29

cgacatcaac ggcctgc 17

<210> 30

<211> 16

<212> DNA

<213> CK19-84F3

<400> 30

cgctgagggg ccaagt 16

<210> 31

<211> 16

<212> DNA

<213> CK19-84B3

<400> 31

gcgacctccc ggttca 16

<210> 32

<211> 43

<212> DNA

<213> CK19-84FIP

<400> 32

tggcttcgca tgtcactcag gattggtcag tgtggaggtg gat 43

<210> 33

<211> 41

<212> DNA

<213> CK19-84BIP

<400> 33

atatgaggtc atggccgagc agttcagtcc ggctggtgaa c 41

<210> 34

<211> 21

<212> DNA

<213> CK19-84LB

<400> 34

ccggaaggat gctgaagcct g 21

<210> 35

<211> 16

<212> DNA

<213> CK19-146F3

<400> 35

tcgctggcca cacgga 16

<210> 36

<211> 18

<212> DNA

<213> CK19-146B3

<400> 36

gctgggcttc aataccgc 18

<210> 37

<211> 43

<212> DNA

<213> CK19-146FIP

<400> 37

gctcagctgt gactgcagct cattctccag atgagcaggt ccg 43

<210> 38

<211> 40

<212> DNA

<213> CK19-146BIP

<400> 38

tgccttggaa gacacactgg cttcagcgcc tggatatgcg 40

<210> 39

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<213> CK19-146LF

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agaccctgaa gggtgcg 17

<210> 40

<211> 19

<212> DNA

<213> CK19-146LB

<400> 40

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<211> 19

<212> DNA

<213> CK19-115F3

<400> 41

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<212> DNA

<213> CK19-115B3

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<211> 43

<212> DNA

<213> CK19-115FIP

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<210> 44

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<210> 45

<211> 19

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<213> CK19-115LB

<400> 46

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