本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種基于單核苷酸多態(tài)性標記的桑樹遺傳分型方法。

背景技術：

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)，是指發(fā)生在染色體基因組水平上單個核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性。單核苷酸多態(tài)性是許多物種基因組中最常見的變異形式,在基因組中的分布頻率很高。據(jù)估計，在人類基因組中大約含有320萬個SNP位點，平均每1000個核苷酸就有一個以上的SNP；水稻第4號染色體每隔250bp左右就有一個SNP。組成DNA的堿基雖然有4種，但SNP一般只有兩種堿基，因此SNP通常被稱為二等位基因。由于SNP的二態(tài)性，非此即彼，在基因組中篩選SNPs往往只需要+/-的分析，而不用分析片段的長度，這就有利于發(fā)展自動化技術篩選或檢測SNPs。從分子水平上對單個核苷酸的差異進行檢測，單個核苷酸多態(tài)性標記可幫助區(qū)分個體間遺傳物質(zhì)的差異。在漫長的進化過程中，生物體形成了自身特有的DNA堿基序列，比較不同物種間或同一物種不同地方品種間的SNP差異，可以了解物種間的親緣關系和進化的生物信息學，從而對不同物種或同一物種不同地方的品種進行精細鑒定和分類。桑葉、桑椹、桑皮、桑根都是傳統(tǒng)的中藥材，在現(xiàn)有國家藥品標準中，含有這4味中藥的復方多達200種以上。桑葉具有降血糖、降血壓、降血膽固醇、抗腫瘤、抗過敏、抗氧化、抗毛細管滲透、利尿等功能。桑枝不僅是《中華人民共和國藥典》記載的祛風濕的常用藥，而且還具有抗炎、降糖、降血脂、提高機體免疫等功能。桑白皮首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其味甘、性寒,能瀉肺平喘及行水消腫，主治肺熱、水腫、糖尿病及骨折等癥，桑白皮的提取液能明顯降低血壓，還有鎮(zhèn)靜作用?，F(xiàn)代藥理學研究表明，桑椹具有調(diào)節(jié)免疫、降血糖、降脂、抗衰老、護肝、抗病毒等作用。目前，桑類中藥原植物均采用桑Morus alba L.,但是，由于桑樹品種較為復雜，古今關于桑類中藥原植物的記述也不一致，而桑樹植物的分類學處理亦很頻繁；同時，由于桑樹植物易于自然雜交，人工雜交的品種亦層出不窮，亦可能導致桑類中藥原植物的復雜性。鑒于此，對桑類中藥的原植物的區(qū)分就尤為必要。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種基于單核苷酸多態(tài)性標記的桑樹遺傳分型方法，能夠在現(xiàn)有桑樹品種復雜、桑樹分類處理頻繁及古今桑類中藥原植物記述不一致等情況下，通過獲得基因組的大量的核苷酸多態(tài)性標記，發(fā)現(xiàn)不同地方的桑樹品種之間存在的遺傳變異，為考證桑類中藥原植物提供有力技術支持。

本發(fā)明的技術方案：

本發(fā)明所述基于單核苷酸多態(tài)性標記的桑樹遺傳分型方法，由以下步驟構成：

(1)種群調(diào)查及取樣；

(2)DNA提取；

(3)測序；

(4)篩選目標基因TR2222；

(5)根據(jù)目標基因TR2222設計引物，正向引物如序列表中SEQ ID NO:1所示；反向引物如序列表中SEQ ID NO:2所示；

(6)PCR擴增；

(7)測序；

(8)序列拼接、比對，鑒定記錄單核苷酸多態(tài)性位點。

進一步地，所述目標基因TR2222是通過高通量轉(zhuǎn)錄組測序后篩選得到。

進一步地，所述PCR擴增的條件參數(shù)：94℃預變性5min、94℃30s、55℃30s、72℃1min，35個循環(huán)，72℃延伸10min。

進一步地，所述目標基因TR2222在桑樹種群中有8個單核苷酸多態(tài)性位點，目標基因TR2222的基因片段如序列表中SEQ ID NO:3所示，其中8個單核苷酸多態(tài)性位點分別位于13、115、201、297、384、386、486、551。

進一步地，高通量轉(zhuǎn)錄組測序的方法：提取樣本總RNA，用Oligo(dT)的磁珠富集分離mRNA，通過反轉(zhuǎn)錄反應合成雙鏈cDNA，構建轉(zhuǎn)錄組測序文庫，插入片段長度約為500bp，在Illumina HiSeq2500測序儀上進行高通量測序，使用Trinity軟件對測序片段進行拼接，從而得到基因序列。

本發(fā)明的有益效果：

自古以來，桑樹品種繁多，發(fā)展至今，我國桑樹種質(zhì)資源多達三千余份。長期以來，國內(nèi)外的學者為了更好的解決桑類的分類問題，已經(jīng)提出了諸如數(shù)值分類、染色體分類、同工酶分類、DNA分子標記分類等分類方法，但這些方法都存在著一些缺點和不足。本發(fā)明一次實驗中，即可得到8個單核苷酸多態(tài)性SNP位點，提供了豐富的多態(tài)性信息。同時本發(fā)明的實驗條件簡單，成功率高，可重復性好。在實施過程中，實驗成功率在98％以上，實驗結果的可重復性更可達到100％。本發(fā)明采用的8個SNP位點，單倍體基因型理論上可以達到2的8次方，即256，能夠提供非常豐富的多態(tài)性信息，使結果更加準確。SNP標記遺傳穩(wěn)定，可用于不同來源的樣本，適宜高通量自動化分析。本發(fā)明以廣東和江蘇兩個地方的桑樹品種為研究對象，在整個基因組內(nèi)批量尋找單核苷酸多態(tài)性位點，全面評估桑樹植物品種的多樣性，為考證桑類中藥原植物提供有力技術支持。本發(fā)明在桑樹植物資源開發(fā)和利用等方面起著重要的作用，同時對桑樹遺傳資源的保護也具有重要意義。

具體實施方式：

下面結合具體樣本對本發(fā)明做進一步的詳細說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。

1.種群調(diào)查與取樣

選擇廣東和江蘇兩個地方作為采樣點，選取生長良好、無蟲害的桑葉，采取后用保鮮袋裝好，立刻放入事先裝有冰袋的保溫盒中。帶回實驗室后立即提取基因組DNA。每個采樣點隨機取樣10株，避免重復采集同一樣品，記錄好樣品名字及采集地點。

2.DNA提取

使用BioFlux公司的Biospin植物基因組DNA提取試劑盒進行DNA提取，具體步驟基本按照試劑盒的說明書進行，稍作修改：

(1)稱取0.05-0.1g新鮮葉片，放入已用液氮預冷的研缽中，用力快速研磨成粉末，在研磨過程中不要讓樣品解凍；

(2)將研磨好的粉末小心轉(zhuǎn)移到預先加有450μl LP Buffer的1.5ml的離心管中，渦旋混勻；

(3)65℃水浴30-60min，每隔10分鐘將樣品混勻一次，然后取出冷至室溫；

(4)加入150μl DA Buffer，混勻，然后冰上放置5min；

(5)13000rpm離心10min，轉(zhuǎn)移上清至Shredder spin column中，13000rpm離心1min；

(6)將濾液轉(zhuǎn)移到一個新的1.5ml的離心管中；

(7)加入1.5倍濾液體積的P Binding Buffer，溫和顛倒混勻，管中出現(xiàn)絮狀沉淀，13000rpm離心10min；

(8)轉(zhuǎn)移上清至Spin column，7500rpm離心1min，并棄濾液；

(9)向Spin column中加入50μl的G Binding Buffer，12000rpm離心30秒，去除濾液；

(10)向Spin column中加入600μl的Wash Buffer，12000rpm離心30秒，去除濾液；

(11)重復步驟(10)一次；

(12)再次將Spin column于12000rpm離心1min，并將Spin column轉(zhuǎn)移至一個新的離心管；

(13)向Spin column加入100-200μl 65℃預熱的去離子水，室溫靜置2-3分鐘；(14)12000rpm離心1min，并棄Spin column，DNA存在于1.5ml的離心管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.高通量轉(zhuǎn)錄組測序

高通量測序不需要了解物種基因組信息，可以對任意物種進行轉(zhuǎn)錄組分析，并能測定每個轉(zhuǎn)錄本的片段序列，能夠精確到單核苷酸的分辨率；能夠同時鑒定和定量稀有轉(zhuǎn)錄本和正常轉(zhuǎn)錄本，以及檢測基因家族中相似基因和可變剪切造成的不同轉(zhuǎn)錄本的表達，高通量測序的步驟是：提取樣品的總RNA，用Oligo(dT)的磁珠富集分離mRNA，通過逆轉(zhuǎn)錄反應合成雙鏈cDNA，構建轉(zhuǎn)錄組文庫，插入片段的長度約為500bp，在Illumina HiSeq 2500測序儀上進行高通量測序，使用Trinity軟件對測序片段進行拼接，從而得到基因序列。

4.篩選目標基因

對得到的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行篩選，去除多拷貝及重復基因，找到易于擴增的片段TR2222，TR2222基因片段如序列表中SEQ ID NO:3所示；

5.根據(jù)目標基因設計引物，引物序列為：

正向引物如SEQ ID NO:1所示：tcaccatccc cttattct

反向引物如SEQ ID NO:2所示：ggttctacga cctctaca

6.PCR擴增

設計50μl PCR擴增體系，具體組成為：36.5μl ddH₂O、5μl 10×Buffer(Mg²⁺)、4μl dNTP Mixture(2.5mM each)、0.5μl TaKaRa Taq(5U/μl)、2μl Template DNA(20-40ng/μl)、1μl正向引物(10μM)、1μl反向引物(10μM)。

PCR擴增的條件參數(shù)：94℃預變性5min、94℃30s、55℃30s、72℃1min，35個循環(huán)，72℃延伸10min。

7.測序

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖電泳檢測，確定為目的條帶大小合適且條帶單一。使用生工生物工程(上海)股份有限公司的膠回收試劑盒回收電泳片段，回收產(chǎn)物濃度達到測序要求后，TR2222片段使用引物進行雙向測序。

8.序列拼接、比對和分析

所得的序列使用Sequencher軟件進行拼接并根據(jù)峰圖進行手工校正，然后采用Mega軟件進行比對排列，經(jīng)比對，兩段切齊后長度為578bp。TR2222片段測序質(zhì)量很高，峰形清晰，無雜峰?？梢酝ㄟ^測序峰形清晰鑒定單核苷酸多態(tài)性位點。

9.對廣東和江蘇的桑樹種群進行鑒定記錄單核苷酸多態(tài)性位點。

表1廣東和江蘇的桑樹種群單核苷酸多態(tài)性位點

注：Y、M、K是國際純粹與應用化學聯(lián)合會(International Union of Pure and Applied Chemistry,IUPAC)制定的命名規(guī)則，Y代表T或C，M代表A或C，K代表G或T

鑒定結果發(fā)現(xiàn)，廣東和江蘇的桑樹種群內(nèi)具有較高的多態(tài)性。在578bp的片段上，共存在8個隔離位點(見表1)。廣東的桑樹種群群體的3個個體中，1個個體含有2個單核苷酸多態(tài)性位點，2個個體含有1個單核苷酸多態(tài)性位點。江蘇的桑樹種群群體的3個個體中，1個個體含有3個單核苷酸多態(tài)性位點，2個個體含有1個單核苷酸多態(tài)性位點。

<110>南京大學

<120>一種基于單核苷酸多態(tài)性標記的桑樹遺傳分型方法

<160>3

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<223>人工合成引物I

<400>1

tcaccatccc cttattct 18

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<223>人工合成引物II

<400>2

ggttctacga cctctaca 18

<210>3

<211>578

<212>DNA

<213>Morus alba L.

<223>目標基因TR2222基因片段

<400>3

actccgtact cattcctcag caagtcacaa tttttgttca ccaacgctat gtccctcttt 60

gtctctaggc agaacctttt tcccttgcca tgataaccat ccaccaagtg caagtgaacc 120

tctagattat gcgcacaccc cggatcctta gtgggcttga gaaatgggct gtggctgtgg 180

tccagcctaa gttccacccc aacgtgggca taactccaag gaaacgacat cgtttcttca 240

atgtactttt gaaactgacg cttctcattg gctattatcc ccggcaccgt tgggaccaca 300

tcgtgaacgt taaccactct caacacctta attcccagct cgtcacagcg ccctttgaac 360

ttcagatttc cgacacgtgg acctgcaaag gaataaacgg tgatcgggac tttcttcccc 420

gatgcgacga cgtttagtcc cacctcagcc atgtcgtacg cgcttagaat cgctaaagcc 480

gaacccaggc tgtgaccggt gacggtgatg ctaatttcct ctccctcgta gtaatcgagg 540

aggcgcttga tctccgccag cacctgctca cgcgccga 578