本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于鑒定或輔助鑒定倉儲粉盜的引物對、試劑盒，以及鑒定或輔助鑒定倉儲粉盜的方法。

背景技術(shù)：

粉盜(flour beetles)，隸屬于鞘翅目(Coleptera)，擬步甲科(Tenebrionidae)，粉盜屬(Palorus)，是世界上儲糧保護中的常見的害蟲。該屬昆蟲在世界廣為分布。目前，世界上已知的粉盜屬儲糧害蟲有7種，我國共計有3種，分別為小粉盜，姬粉盜，亞扁粉盜。

粉盜，是擬步甲科昆蟲中經(jīng)濟意義較為重要的一個種類，是一種繼發(fā)性的儲糧害蟲。其主要危害面粉，小麥，玉米，稻谷，及其加工制品。同時，這些害蟲還會產(chǎn)生一些排泄廢物，危害糧食品質(zhì)。并且，這些害蟲還會傳播一些病菌，危害人類健康。所以，快速鑒定昆蟲對昆蟲的綜合防治至關(guān)重要。傳統(tǒng)的昆蟲防治方法主要依靠昆蟲成蟲的外部形態(tài)特征。同時，昆蟲鑒定需要非常專業(yè)的技術(shù)人員。而實際鑒定中，昆蟲的蟲態(tài)可能為非成蟲狀態(tài)，或者為昆蟲殘體，且鑒定人員可能并沒有相應(yīng)的昆蟲分類知識。這些都對昆蟲的正確鑒定產(chǎn)生很大的困擾。

近幾年發(fā)展起來的分子生物學(xué)方法，可以有效的解決上述困擾。但是目前市場上尚沒有用于鑒定或輔助鑒定粉盜的生物產(chǎn)品出現(xiàn)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是利用分子生物學(xué)技術(shù)，提供用于鑒定倉儲粉盜的引物對，基于引物對提供檢測試劑盒，并提供鑒定或輔助鑒定倉儲粉盜的方法。

具體的，本發(fā)明分別采用如下技術(shù)方案。

本發(fā)明采用的第一個技術(shù)方案是：用于鑒定倉儲粉盜的引物對，為下列引物對中的任一種：

由SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示的序列組成的引物對；

由SEQ ID No：3和SEQ ID No：4所示的序列組成的引物對；

由SEQ ID No：5和SEQ ID No：6所示的序列組成的引物對。

其中，SEQ ID No：1所示的序列由20個核苷酸組成；SEQ ID No：2所示的序列由20個核苷酸組成；SEQ ID No：3所示的序列由20個核苷酸組成；SEQ ID No：4所示的序列由22個核苷酸組成；SEQ ID No：5所示的序列由20個核苷酸組成；SEQ ID No：6所示的序列由20個核苷酸組成。

其中，由SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示的序列組成的引物對特異于小粉盜；由SEQ ID No：3和SEQ ID No：4所示的序列組成的引物對特異于姬粉盜；由SEQ ID No：5和SEQ ID No：6所示的序列組成的引物對特異于亞扁粉盜。

本發(fā)明采用的第二個技術(shù)方案是：一種鑒定倉儲粉盜的試劑盒，包含下列引物對中的至少一種：

由SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示的序列組成的引物對；

由SEQ ID No：3和SEQ ID No：4所示的序列組成的引物對；

由SEQ ID No：5和SEQ ID No：6所示的序列組成的引物對。

優(yōu)選的，所述的鑒定倉儲粉盜的試劑盒，組成每個引物對的兩條單鏈DNA的摩爾數(shù)相等。

具體的，鑒定倉儲粉盜的試劑盒包括：分別單獨包裝的SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示的序列的單鏈DNA或分別單獨包裝的SEQ ID No：3和SEQ ID No：4所示的序列的單鏈DNA或分別單獨包裝的SEQ ID No：5和SEQ ID No：6所示的序列的單鏈DNA；還包括下述物質(zhì)中的至少一種：PCR反應(yīng)緩沖液、DNA聚合酶、4種dNTP。所述試劑盒的制備方法，具體包括如下步驟：將組成試劑盒的引物對的各單鏈DNA分別單獨包裝后，與下述物質(zhì)中的至少一種包裝在同一試劑盒內(nèi)：PCR反應(yīng)緩沖液、DNA聚合酶、4種dNTP。

本發(fā)明采用的第三個技術(shù)方案是：一種鑒定倉儲粉盜的方法，包括用所述的引物對或含有所述引物對的試劑盒進行PCR擴增步驟。

具體的，鑒定倉儲粉盜的方法，包括步驟：

S1：以待測倉儲粉盜的基因組DNA為模板，用所述的引物對或含有所述引物對的試劑盒中的任一對引物對進行PCR擴增；

S2：檢測PCR擴增產(chǎn)物，根據(jù)PCR擴增產(chǎn)物的大小確定待測倉儲粉盜類型。

其中，所述待測倉儲粉盜為下列中的至少一種：小粉盜、姬粉盜、亞扁粉盜。

鑒定倉儲粉盜的方法，其步驟S2中，根據(jù)PCR擴增產(chǎn)物的大小確定待測倉儲粉盜類型的方法為：

若PCR擴增產(chǎn)物中含有272bp的片段，則待測倉儲粉盜為或候選為小粉盜；反之，則待測倉儲粉盜不為或候選不為小粉盜；

若PCR擴增產(chǎn)物中含有285bp的片段，則待測倉儲粉盜為或候選為姬粉盜；反之，則待測倉儲粉盜不為或候選不為姬粉盜；

若PCR擴增產(chǎn)物中含有427bp的片段，則待測倉儲粉盜為或候選為亞扁粉盜；反之，則待測倉儲粉盜不為或候選不為亞扁粉盜。

其中，所述PCR擴增的退火溫度為58℃。

組成每個引物對的兩條單鏈DNA在PCR反應(yīng)體系中的摩爾比均為1:1；每個引物對的兩條單鏈DNA在PCR反應(yīng)體系中的摩爾濃度均為0.2μM。

在上述方法中，所述的272bp片段的DNA核苷酸序列如SEQ ID No：7所示；285bp片段的DNA核苷酸序列如SEQ ID No：8所示；427bp片段的核苷酸序列如SEQ ID No：9所示。

小粉盜、姬粉盜和亞扁粉盜，為世界上常見的3種倉儲粉盜，在它們的細胞色素C氧化酶亞基I的基因序列的基礎(chǔ)上，設(shè)計并篩選出3種常見倉儲粉盜種類識別特異引物對，形成基于特異引物方法的鑒定試劑盒，實現(xiàn)了世界常見倉儲粉盜的快速準確鑒定。

利用本發(fā)明所提供的鑒定倉儲粉盜的引物對和包含所述引物對的試劑盒及方法，鑒別3種倉儲粉盜，特異性強，操作簡單且可重復(fù)，靈敏度高且較穩(wěn)定，是鑒別倉儲粉盜的理想方法。

附圖說明

圖1是用于鑒定小粉盜的引物對的特異性檢測結(jié)果，其中，泳道M為DNA相對分子量標(biāo)準(DL 2000DNA Marker)，其他泳道信息為：1：亞扁粉盜(廣東肇慶)，2：亞扁粉盜(福建龍巖)，3：亞扁粉盜(浙江溫州)，4：亞扁粉盜(廣東江門)，5：亞扁粉盜(廣東中山)，6：姬粉盜(福建龍巖)，7：姬粉盜(廣西柳州)，8：姬粉盜(廣東江門)，9：姬粉盜(廣東汕尾)，10：姬粉盜(廣東中山)，11：姬粉盜(深圳)，12：小粉盜(福建廈門)，13：小粉盜(福建漳州)，14：陰性對照；

圖2是用于鑒定姬粉盜的引物對的特異性檢測結(jié)果，其中，泳道M為DNA相對分子量標(biāo)準(DL 2000DNA Marker)，其他泳道信息為：1：亞扁粉盜(廣東肇慶)，2：亞扁粉盜(福建龍巖)，3：亞扁粉盜(浙江溫州)，4：亞扁粉盜(廣東江門)，5：亞扁粉盜(廣東中山)，6：姬粉盜(福建龍巖)，7：姬粉盜(廣西柳州)，8：姬粉盜(廣東江門)，9：姬粉盜(廣東汕尾)，10：姬粉盜(廣東中山)，11：姬粉盜(深圳)，12：小粉盜(福建廈門)，13：小粉盜(福建漳州)，14：陰性對照；

圖3是用于鑒定亞扁粉盜的引物對的特異性檢測結(jié)果，其中，泳道M為DNA相對分子量標(biāo)準(DL 2000DNA Marker)，其他泳道信息為：1：亞扁粉盜(廣東肇慶)，2：亞扁粉盜(福建龍巖)，3：亞扁粉盜(浙江溫州)，4：亞扁粉盜(廣東江門)，5：亞扁粉盜(廣東中山)，6：姬粉盜(福建龍巖)，7：姬粉盜(廣西柳州)，8：姬粉盜(廣東江門)，9：姬粉盜(廣東汕尾)，10：姬粉盜(廣東中山)，11：姬粉盜(深圳)，12：小粉盜(福建廈門)，13：小粉盜(福建漳州)，14：陰性對照；

圖4是用于鑒定小粉盜的引物對的靈敏度檢測結(jié)果，其中，泳道M為DNA相對分子量標(biāo)準(DL 2000DNA Marker)，其他泳道信息為：1：DNA模板用量為10ng，2：DNA模板用量為1ng，3：DNA模板用量為0.1ng，4：DNA模板用量為0.01ng，5：DNA模板用量為0.001ng；

圖5是用于鑒定姬粉盜的引物對的靈敏度檢測結(jié)果，其中，泳道M為DNA相對分子量標(biāo)準(DL 2000DNA Marker)，其他泳道信息為：1：DNA模板用量為10ng，2：DNA模板用量為1ng，3：DNA模板用量為0.1ng，4：DNA模板用量為0.01ng，5：DNA模板用量為0.001ng；

圖6是用于鑒定亞扁粉盜的引物對的靈敏度檢測結(jié)果，其中，泳道M為DNA相對分子量標(biāo)準(DL 2000DNA Marker)，其他泳道信息為：1：DNA模板用量為10ng，2：DNA模板用量為1ng，3：DNA模板用量為0.1ng，4：DNA模板用量為0.01ng，5：DNA模板用量為0.001ng。

具體實施方式

下面對本發(fā)明的技術(shù)方案進行詳細說明。

首先需要說明的是，下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實驗使用的三種倉儲粉盜分別為：小粉盜、姬粉盜、亞扁粉盜。其中，小粉盜涉及如下地理種群：福建廈門，福建漳州；姬粉盜涉及如下地理種群：福建龍巖，廣西柳州，廣東江門，廣東汕尾，廣東中山，深圳；亞扁粉盜涉及如下地理種群：廣東肇慶，福建龍巖，浙江溫州，廣東江門，廣東中山。

實施例1針對3種倉儲粉盜的特異性引物的設(shè)計與合成

1.1 3種倉儲粉盜COI序列的獲得

實驗材料：涉及3種倉儲粉盜，具體為小粉盜、姬粉盜、亞扁粉盜；其中，小粉盜涉及如下地理種群：福建廈門，福建漳州；姬粉盜涉及如下地理種群：福建龍巖，廣西柳州，廣東江門，廣東汕尾，廣東中山，深圳；亞扁粉盜涉及如下地理種群：廣東肇慶，福建龍巖，浙江溫州，廣東江門，廣東中山。

1.1.1粉盜基因組DNA的提取

采用Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒提取(生工，上海)提取DNA，并對其進行部分修改，具體方法如下：

(1)取粉盜成蟲樣品，用磷酸緩沖液清洗干凈，晾干；

(2)將處理后的個體放入1.5ml離心管中，加入180μL Buffer ACL，放入鋼珠，之后放入組織研磨儀70Hz，研磨90s；

(3)再加入20μL Proteinase K溶液，震蕩混勻，56℃水浴1h至細胞完全裂解；

(4)加入200μL Buffer CL，充分顛倒混勻；

(5)加入200μL的-20℃無水乙醇，充分顛倒混勻；

(6)將吸附柱放入收集管中，用移液器將溶液和半透明纖維狀懸浮物全部加入吸附柱中，靜置2min，于10,000rpm室溫離心1min，倒掉收集管中廢液；

(7)將吸附柱放回收集管中，向吸附柱中加入500μl CW1Solution，于10,000rpm離心30s，倒掉收集管廢液；

(8)將吸附柱放回收集管中，向吸附柱中加入500μl CW2Solution，于10,000rpm離心30s，倒掉收集管廢液；

(9)將吸附柱重新放回收集管中，于12,000rpm室溫離心2min，離去殘留的CW2Solution；

(10)取出吸附柱，放入一個新的1.5ml離心管中，加入50～200μL CE Buffer靜置3min，于12,000rpm室溫離心2min，收集DNA溶液，提取的DNA可立即進行下一步實驗或-20℃保存。

1.1.2 COI序列PCR擴增

上游引物：COIF-5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′，SEQ ID No：10；

下游引物：COIR-5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAATCA-3′，SEQ ID No：11；

SEQ ID No：10和SEQ ID No：11是參照Folmer et al.在1994年所發(fā)表的文章中設(shè)計的COI通用引物。

利用上述上游引物和下游引物擴增粉盜的COI序列，擴增產(chǎn)物長度均為658bp；PCR反應(yīng)體系為25μL，其中Premix Taq^TM(TaKaRa Taq^TM Version 2.0plus dye)12.5μL，超純水8.5μL，上游引物和下游引物各1μL(10μM)，模板DNA 2μL(約20～50ng/μL)。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3min；35個循環(huán)：94℃45s，48℃45s，72℃45s；最后72℃延伸6min。取4μL PCR擴增產(chǎn)物，以DNA 2000Marker為參照，在含有Gold View I染色劑的1％的瓊脂糖凝膠上進行電泳分離(電泳液為1×TBE)，100V電泳40min后，以凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.1.3 COI序列的獲得

將電泳檢測合格的PCR產(chǎn)物進行膠回收，膠回收采用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒(生工，上海)進行，之后，進行基因的鏈接和轉(zhuǎn)化，具體參照pMD-19Vector(TaKaRa，上海)。將陽性克隆送南京金斯瑞生物科技有限公司進行雙向測序。

1.2針對3種倉儲粉盜的特異性引物的設(shè)計與合成

1.2.1引物的設(shè)計

將獲得的3種倉儲粉盜(每個種包含多個地理種群)COI序列在Chromas version 2.3和BioEdit 7.0.4.1上進行比對和分析，采用Primer Primeier5.0軟件分別設(shè)計針對3種倉儲粉盜的特異引物，具體見表1。

表1 3種倉儲粉盜的特異引物

實施例2利用針對3種倉儲粉盜COI序列的特異性引物進行特異性檢測

2.1實驗材料

涉及3種倉儲粉盜，具體為小粉盜、姬粉盜、亞扁粉盜。其中，小粉盜涉及如下地理種群：福建廈門，福建漳州；姬粉盜涉及如下地理種群：福建龍巖，廣西柳州，廣東江門，廣東汕尾，廣東中山，深圳；亞扁粉盜涉及如下地理種群：廣東肇慶，福建龍巖，浙江溫州，廣東江門，廣東中山。

2.2實驗方法

采用Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒提取(生工，上海)提取DNA，提取單頭待測粉盜成蟲整個蟲體的總DNA。參照試劑盒說明書進行，具體操作同實施例1。以所得基因組DNA為模板，采用實施例1所設(shè)計的針對3種倉儲粉盜COI序列特異引物(表1所示)中的每個引物對分別進行PCR擴增，從而檢測實施例1所設(shè)計的針對3種倉儲粉盜COI序列特異引物(表1所示)的特異性。

2.2.1 PCR反應(yīng)體系為25μL：其中Premix Taq^TM(TaKaRa Taq^TM Version 2.0plus dye)12.5μL，超純水8.5μL，上游引物和下游引物各1μL(10μM)，模板DNA 2μL(約20～50ng/μL)；

2.2.2同時設(shè)置以水代替模板的陰性對照；

2.2.3擴增條件為：94℃預(yù)變性3min；35個循環(huán)：94℃45s，58℃45s，72℃45s；最后72℃延伸6min。取PCR擴增產(chǎn)物，以DNA 2000Marker為參照，在含有Gold View I染色劑的1％的瓊脂糖凝膠上進行電泳分離(電泳液為1×TBE)，100V電泳40min后，以凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。同時，擴增產(chǎn)物直接送南京金斯瑞生物科技有限公司雙向測序，測序結(jié)果通過序列比對，進一步確定特異引物所擴增片段屬于該特異種。

2.3實驗結(jié)果

2.3.1小粉盜

利用自行設(shè)計獲得的引物對1(SEQ ID No：1和SEQ ID No：2)來檢測常規(guī)PCR方法下該引物對的特異性，實驗材料中除鑒定區(qū)分的小粉盜外，還將姬粉盜，亞扁粉盜一起進行特異引物常規(guī)PCR反應(yīng)。引物對1常規(guī)PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果如圖1所示，除了小粉盜有特異性擴增，在272bp處有一特異性擴增片段(經(jīng)測序序列如SEQ ID No：7所示)外，其他2種倉儲粉盜和水陰性對照，均沒有擴增反應(yīng)，即產(chǎn)物中無特異性的目標(biāo)片段，說明該引物只能特異性的鑒定小粉盜，而對其他2種粉盜無效。

2.3.2姬粉盜

利用自行設(shè)計獲得的引物對2(SEQ ID No：3和SEQ ID No：4)來檢測常規(guī)PCR方法下該引物對的特異性，實驗材料中除鑒定區(qū)分的姬粉盜外，還將小粉盜，亞扁粉盜一起進行特異引物常規(guī)PCR反應(yīng)。引物對2常規(guī)PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果如圖2所示，除了姬粉盜有特異性擴增，在285bp處有一特異性擴增片段(經(jīng)測序序列如SEQ ID No：8所示)外，其他2種倉儲粉盜和水陰性對照，均沒有擴增反應(yīng)，即產(chǎn)物中無特異性的目標(biāo)片段，說明該引物只能特異性的鑒定姬粉盜，而對其他2種粉盜無效。

2.3.3亞扁粉盜

利用自行設(shè)計獲得的引物對3(SEQ ID No：5和SEQ ID No：6)來檢測常規(guī)PCR方法下該引物對的特異性，實驗材料中除鑒定區(qū)分的亞扁粉盜外，還將小粉盜，姬粉盜一起進行特異引物常規(guī)PCR反應(yīng)。引物對3常規(guī)PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果如圖3所示，除了亞扁粉盜有特異性擴增，在427bp處有一特異性擴增片段(經(jīng)測序序列如SEQ ID No：9所示)外，其他2種倉儲粉盜和水陰性對照，均沒有擴增反應(yīng)，即產(chǎn)物中無特異性的目標(biāo)片段，說明該引物只能特異性的鑒定亞扁粉盜，而對其他2種粉盜無效。

實施例3 3種倉儲粉盜COI序列特異引物的靈敏度檢測

3.1實驗材料

涉及3種倉儲粉盜，具體為小粉盜、姬粉盜、亞扁粉盜。其中，小粉盜的地理種群為：福建廈門；福建漳州；姬粉盜的地理種群為：福建龍巖；廣西柳州；廣東江門；廣東汕尾；廣東中山；深圳；福建廈門；福建漳州；；亞扁粉盜的地理種群為：廣東肇慶；福建龍巖；浙江溫州；廣東江門；廣東中山。

3.2實驗方法

采用Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒提取(生工，上海)提取DNA，提取單頭待測粉盜成蟲整個蟲體的總DNA。具體操作參見試劑盒說明書。以所得基因組DNA為模板，采用實施例1所設(shè)計的針對3種倉儲粉盜COI序列特異引物(見表1或序列表SEQ ID No：1-6所示)中的每個引物對分別進行PCR擴增。從而檢測實施例1所設(shè)計的針對3種倉儲粉盜COI序列特異引物的靈敏度。

3.2.1 PCR反應(yīng)體系為25μL：其中Premix Taq^TM(TaKaRa Taq^TM Version 2.0plus dye)12.5μL，超純水9.5μL，上游引物和下游引物各1μL(10μM)，模板DNA 1μL。其中，作為模板的待測粉盜基因組DNA在反應(yīng)體系中的用量設(shè)置梯度為：10ng，1ng，0.1ng，0.01ng，0.001ng。

3.2.2擴增條件為：94℃預(yù)變性3min；35個循環(huán)：94℃45s，58℃45s，72℃45s；最后72℃延伸6min。取PCR擴增產(chǎn)物，以DNA 2000Marker為參照，在含有Gold View I染色劑的1％的瓊脂糖凝膠上進行電泳分離(電泳液為1×TBE)，100V電泳40min后，以凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。同時，擴增產(chǎn)物直接送南京金斯瑞生物科技有限公司雙向測序，測序結(jié)果通過序列比對，進一步確定特異引物所擴增片段屬于該特異種。

3.3實驗結(jié)果

3.3.1小粉盜

利用自行設(shè)計獲得的引物對1(SEQ ID No：1和SEQ ID No：2)來檢測常規(guī)PCR方法下該引物對的靈敏度。不同濃度(10ng，1ng，0.1ng，0.01ng，0.001ng)的小粉盜常規(guī)PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果如圖4所示。DNA模板的濃度從孔1到5依次為10、1、0.1、0.01和0.001ng/μl，M：DNA Marker。當(dāng)模板濃度為0.1ng時，擴增帶比較微弱，僅有微量的目標(biāo)片段出現(xiàn)；而當(dāng)模板濃度大于0.1ng時，均能發(fā)生特異性擴增。

3.3.2姬粉盜

利用自行設(shè)計獲得的引物對2(SEQ ID No：3和SEQ ID No：4)來檢測常規(guī)PCR方法下該引物對的靈敏度。不同濃度(10ng，1ng，0.1ng，0.01ng，0.001ng)的姬粉盜常規(guī)PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果如圖5所示。當(dāng)模板濃度小于0.01ng時，擴增帶比較微弱，僅有微量的目標(biāo)片段出現(xiàn)；而當(dāng)模板濃度大于0.01ng時，均能發(fā)生特異性擴增。

3.3.3亞扁粉盜

利用自行設(shè)計獲得的引物對3(SEQ ID No：5和SEQ ID No：6)來檢測常規(guī)PCR方法下該引物對的靈敏度。不同濃度(10ng，1ng，0.1ng，0.01ng，0.001ng)的亞扁粉盜常規(guī)PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果如圖6所示。當(dāng)模板濃度小于0.01ng時，擴增帶比較微弱，僅有微量的目標(biāo)片段出現(xiàn)；而當(dāng)模板濃度大于0.01ng時，均能發(fā)生特異性擴增。

實施例4鑒定倉儲粉盜的試劑盒

鑒定倉儲粉盜的試劑盒，包括下列引物對中的至少一種：

由SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示的序列組成的引物對；

由SEQ ID No：3和SEQ ID No：4所示的序列組成的引物對；

由SEQ ID No：5和SEQ ID No：6所示的序列組成的引物對；

并且組成每個引物對的兩條單鏈DNA的摩爾數(shù)相等。

鑒定倉儲粉盜的試劑盒具體如下：

包括：分別單獨包裝的SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示的序列的單鏈DNA，兩條單鏈DNA的摩爾數(shù)相等，

或分別單獨包裝的SEQ ID No：3和SEQ ID No：4所示的序列的單鏈DNA，兩條單鏈DNA的摩爾數(shù)相等，

或分別單獨包裝的SEQ ID No：5和SEQ ID No：6所示的序列的單鏈DNA，兩條單鏈DNA的摩爾數(shù)相等；

還包括：下述物質(zhì)中的至少一種：

PCR反應(yīng)緩沖液、DNA聚合酶、4種dNTP。

以上所述僅為本發(fā)明的實施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書及附圖內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)變換，或直接或間接運用在其他相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，均包括在本發(fā)明的專利保護范圍內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南工業(yè)大學(xué) 河南省環(huán)境監(jiān)測中心

<120> 用于鑒定倉儲粉盜的引物對、試劑盒及方法

<130>

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物

<400> 1

tccacccgca ggatcaaaga 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物

<400> 2

atattgctca cggagggtcc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物

<400> 3

aggatcaccc cctcctgtag 20

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 引物

<400> 4

tccaacattg ctcatggagg at 22

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物

<400> 5

ataggatctc ctcctccggc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物

<400> 6

taggagcccc agacatagca 20

<210> 7

<211> 272

<212> DNA

<213> 小粉盜

<400> 7

tccacccgca ggatcaaaga atgatgtatt aatatttcga tcagttaata atatagtaat 60

agctcctgct aaaactggga gggaaagaag taaaagtaca gcagtaataa ctactgccca 120

tacaaataaa ggtattcgat caaatgttat accttgaggt cgcatattaa ttactgtggt 180

aataaaattt actgctccta agatagagga gatacctgct aaatgaaggc taaagattgc 240

taaatcaaca gaggaccctc cgtgagcaat at 272

<210> 8

<211> 285

<212> DNA

<213> 姬粉盜

<400> 8

aggatcaccc cctcctgtag ggtcaaaaaa tgaggtatta atattacgat ctgtaagtaa 60

tattgtaata gcacctgcaa gaacaggtag tgataaaaga agtaaaacgg cagtaattac 120

tactgctcat acaaataaag gtattcgatc aaaagttatt ccttgaggac gtatattaat 180

tacagtggta atgaaattaa ctgctcctaa aattgaagaa attccagcta aatgtaaact 240

aaaaattgct aaatctactg aagatcctcc atgagcaatg ttgga 285

<210> 9

<211> 427

<212> DNA

<213> 亞扁粉盜

<400> 9

ataggatctc ctcctccggc aggatcaaaa aaggaagtat taatatttcg atctgttaga 60

agtatagtaa tagctcctgc taaaacaggg agtgaaagta atagtagaac agcagtaatg 120

actacggctc atacgaataa aggtattcga tcaaaagtta ttccttgggg tcgtatatta 180

attactgtgg tgataaaatt aactgctcct aaaattgaag agattccagc taaatgaaga 240

ctaaaaattg ctaaatcaac tgaggatcct ccgtgggcaa tatttgatga cagtgggggg 300

taaactgttc atcctgttcc tgctcctctt tctacaattc ttcttattaa tagaagagtt 360

aatgaaggag gtagtagtca aaatcttatg ttgtttattc gaggaaatgc tatgtctggg 420

gctccta 427

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 引物

<400> 10

ggtcaacaaa tcataaagat attgg 25

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 引物

<400> 11

taaacttcag ggtgaccaaa aatca 25