本發(fā)明屬于微生物分子檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及一種嗜肺軍團(tuán)菌ST1型菌株的快速檢測(cè)試劑盒及方法。
背景技術(shù)：
：軍團(tuán)菌是一種胞內(nèi)寄生的革蘭陰性桿菌，在土壤和水系統(tǒng)中廣泛存在。目前軍團(tuán)菌屬有59種包括70多個(gè)血清型，并不斷有新的菌種從環(huán)境中分離。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，約有一半的軍團(tuán)菌種與人類疾病有關(guān)，其中約90％軍團(tuán)菌感染是由嗜肺軍團(tuán)菌引起。嗜肺軍團(tuán)菌序列分型(即ST分型)是歐洲軍團(tuán)菌感染工作組(EWGLI)建立的嗜肺軍團(tuán)菌SBT分型方法。該方法對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌7個(gè)基因flaA，pilE，asd，mip，mompS，proA和neuA特異片段進(jìn)行PCR和測(cè)序片段，通過(guò)對(duì)核苷酸序列與EWGLI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，得到基因型別(Sequencetype，ST)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行基因序列分型(Sequence-BasedTyping，SBT)和系統(tǒng)進(jìn)化分析。通過(guò)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，全球流行最廣的嗜肺軍團(tuán)菌菌株為ST1型，約占?xì)W洲軍團(tuán)菌研究小組所報(bào)告的臨床分離菌株的50％以上，表明了嗜肺軍團(tuán)菌ST1型菌株的高致病性。一項(xiàng)對(duì)中國(guó)境內(nèi)六個(gè)城市跨越8年的研究也表明ST1型在主要的軍團(tuán)菌傳染源水環(huán)境中分布最廣，占所有分離到的LP菌株的52％-93％。因此，對(duì)水環(huán)境中分離菌株的ST型快速監(jiān)測(cè)與檢測(cè)的基礎(chǔ)研究有利于軍團(tuán)菌疾病預(yù)防和爆發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估。目前對(duì)軍團(tuán)菌的檢測(cè)鑒定方法主要有血清抗體檢測(cè)、尿可溶性抗原檢測(cè)、軍團(tuán)菌分離培養(yǎng)等。但是上述的檢測(cè)方法存在檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、陽(yáng)性率低、培養(yǎng)基的配置復(fù)雜和價(jià)格昂貴的缺陷，不利于軍團(tuán)菌的快速檢測(cè)。而對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌高致病性ST1型流行株的檢測(cè)方法依賴于PCR、測(cè)序、序列比對(duì)的方法，缺乏較簡(jiǎn)便的方法。多重PCR方法具有很高的特異性與敏感性，其主要是通過(guò)檢測(cè)軍團(tuán)菌中的特異基因，以達(dá)到快速檢測(cè)軍團(tuán)菌的目的。采用多重PCR法，一次反應(yīng)中即可檢測(cè)出軍團(tuán)菌屬，嗜肺軍團(tuán)菌，嗜肺軍團(tuán)菌高致病性ST1型流行株進(jìn)行不僅對(duì)臨床上快速檢測(cè)和鑒定不同類型軍團(tuán)菌感染有重要意義，也對(duì)流行病學(xué)調(diào)查具有一定的意義。中國(guó)專利申請(qǐng)201410607389.6公開(kāi)了一種快速區(qū)分非嗜肺、嗜肺與嗜肺I型軍團(tuán)菌的三重PCR檢測(cè)方法，所述檢測(cè)方法主要是針對(duì)軍團(tuán)菌種屬、嗜肺軍團(tuán)菌種和嗜肺軍團(tuán)菌I型的16SrRNA、danI和ORF9三個(gè)基因的引物，對(duì)dNTPs和引物濃度比例以及退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，建立快速區(qū)分非嗜肺、嗜肺與嗜肺I型軍團(tuán)菌的三重PCR方法，該檢測(cè)方法可以對(duì)分離培養(yǎng)到的可疑軍團(tuán)菌菌株進(jìn)行快速有效的判定。但是，該檢測(cè)方法只對(duì)可疑軍團(tuán)菌菌株進(jìn)行分型，不能檢測(cè)嗜肺軍團(tuán)菌高致病性ST1型流行株，檢測(cè)范圍較狹窄，特異性不強(qiáng)，不利于該檢測(cè)方法的推廣和應(yīng)用。中國(guó)專利CN101717815B公開(kāi)了一種軍團(tuán)菌快速檢測(cè)與分型方法，該方法是以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，對(duì)檢測(cè)出陽(yáng)性PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切反應(yīng)，對(duì)酶切反應(yīng)產(chǎn)物作瓊脂糖凝膠電泳分析進(jìn)行分子分型。該檢測(cè)方法能夠檢測(cè)出軍團(tuán)菌，且能將其分子分型為嗜肺軍團(tuán)菌或非嗜肺軍團(tuán)菌。但是，該檢測(cè)方法的依然不能檢測(cè)嗜肺軍團(tuán)菌ST1型菌株。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為解決現(xiàn)有技術(shù)中軍團(tuán)菌的檢測(cè)試劑盒存在檢測(cè)范圍窄的缺陷，本發(fā)明提供一種嗜肺軍團(tuán)菌ST1型菌株快速檢測(cè)的試劑盒及方法，以解決上述問(wèn)題。本發(fā)明提供一種嗜肺軍團(tuán)菌ST1型菌株快速檢測(cè)的引物，包括細(xì)菌基因組DNA提取液、PCR反應(yīng)液、PCR引物混合液、陽(yáng)性對(duì)照液和陰性對(duì)照液，所述PCR引物混合液、陽(yáng)性對(duì)照液和陰性對(duì)照液含有軍團(tuán)菌屬(GenusLegionella)特異引物、嗜肺軍團(tuán)菌(Legionellapneumophila)特異引物、嗜肺軍團(tuán)菌ST1型菌株(LegionellapneumophilaST1strain)特異引物；所述軍團(tuán)菌屬特異引物為：GL-388F：5’-GGAGGGTTGATAGGTTAAGAGC-3’(SEQIDNO.1)，GL-388R：5’-CCAACAGCTAGTTGACATCGT-3’(SEQIDNO.2)；所述嗜肺軍團(tuán)菌特異引物為：LP-229F：5’-TCCGATGGTCAAGTGCGT-3’(SEQIDNO.3)，LP-229R：5’-TGAAGGGACTTGATGTGGCA-3’(SEQIDNO.4)；所述嗜肺軍團(tuán)菌ST1型菌株特異引物為：flaA1-F：5’-TCGGCAGCATAAAAGCTTCTTAC-3’(SEQIDNO.5)，flaA1-R：5’-TCCTCCTCCAATTGCGATAGAG-3’(SEQIDNO.6)；neuA1-F：5’-CTCCTGTTTAAGTTTCAGCAAATGGAT-3’(SEQIDNO.7)，neuA1-R：5’-ACGACACTTTTCCCCGTTACTTT-3’(SEQIDNO.8)。進(jìn)一步地，所述軍團(tuán)菌屬特異引物靶基因?yàn)?6srRNA基因，嗜肺軍團(tuán)菌特異引物靶基因?yàn)閘pp0267基因，嗜肺軍團(tuán)菌ST1型菌株引物的靶基因?yàn)閒laA1型等位基因和neuA1型等位基因。進(jìn)一步地，所述細(xì)菌基因組DNA提取液的配方為：Chelex100resin5％；Tris-HCl10mM；pH8.3；乙二胺四乙酸二鈉0.1mM；疊氮鈉0.1％；蛋白酶K200μg/ml。進(jìn)一步地，所述PCR反應(yīng)液為2×PCR反應(yīng)液，所述2×PCR反應(yīng)液的組分及其組分濃度為：0.1U/μlEasyTaqDNA聚合酶；500μMdNTP；20mMTris-HCl；pH8.3；100mMKCl；3mMMgCl2。進(jìn)一步地，所述8條引物同時(shí)存在于同一反應(yīng)體系中，所述GL-388F、GL-388R、LP-229F、LP-229R、flaA1-F、flaA1-R、lneuA1-F、neuA1-R的濃度為200nM-500nM。進(jìn)一步地，所述8條引物同時(shí)存在于同一反應(yīng)體系中，所述GL-388F、GL-388R、LP-229F、LP-229R的濃度為200nM；所述flaA1-F、flaA1-R、lneuA1-F、neuA1-R的濃度為250nM。進(jìn)一步地，所述陽(yáng)性對(duì)照液含有嗜肺軍團(tuán)菌ST1型菌株基因組DNA、軍團(tuán)菌屬特異引物、嗜肺軍團(tuán)菌特異引物和嗜肺軍團(tuán)菌ST1型菌株特異引物。另外，本發(fā)明還提供了一種嗜肺軍團(tuán)菌ST1型菌株快速檢測(cè)的方法，包括如下步驟：S1應(yīng)用細(xì)菌基因組DNA提取液提取待測(cè)標(biāo)本中的細(xì)菌基因組DNA；S2以細(xì)菌基因組DNA為模板，采用軍團(tuán)菌屬特異引物和嗜肺軍團(tuán)菌種特異引物、嗜肺軍團(tuán)菌血清型1型特異引物和嗜肺軍團(tuán)菌ST1型菌株引物進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增；S3將陽(yáng)性對(duì)照液和陰性對(duì)照液同時(shí)進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增；S4將所得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。進(jìn)一步地，所述步驟S2和步驟S3中的PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件包括：階段1：94℃3min；階段2：94℃25s；階段3：56℃25s；階段4：72℃40s；35個(gè)循環(huán)；階段5：72℃5min；在4℃貯存。進(jìn)一步地，所述步驟S2中軍團(tuán)菌屬特異引物：(GL-388F)-(GL-388R)擴(kuò)增序列為388bp。其中，GL388F-GL388R引物對(duì)擴(kuò)增序列為軍團(tuán)菌屬16SrDNA基因一段保守序列，具體序列如下：GGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTGAGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTGGGGAGGAGGGTTAATAGGTTAAGAGCTGATTAACTGGACGTTACCCACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGTGGTTGATTAAGTTATCTGTGAAATTCCTGGGCTTAACCTGGGACGGTCAGATAATACTGGTTGACTCGAGTATGGGAGAGGGTAGTGGAATTTCCGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTACCTGGCCTAATACTGACACTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCAACTAGCTGTTGG。進(jìn)一步地，所述步驟S2中嗜肺軍團(tuán)菌特異性引物：(LP-229F)-(LP-229R)引物對(duì)擴(kuò)增片段為229bp；為嗜肺軍團(tuán)菌lpp0267基因內(nèi)一段保守序列，具體序列為：TCCGATGGTCAAGTGCGTAGGTATTGTGCCTGATTATCCACAGCATAAAGGAACAGAGTATCTTACAGCCTCACCTTTATATAACCATTACTTTAAGGCGATAGAGGAGTTTGATAAAGAGTTTGCTGAGGTTCATGAAAAAATTTGGCAGGAGTACCTTACGTATTTCCGTATGACTTATATGCCCGTTTGTATGCGTGATCATTGCCTGCCACATCAAGTCCCTTCA；進(jìn)一步地，所述步驟S2中嗜肺軍團(tuán)菌ST1型菌株引物引物對(duì)：(flaA1-F)-(flaA1-R)擴(kuò)增序列為104bp，為嗜肺軍團(tuán)菌flaA1型等位基因一段保守序列，具體序列如下：TCGGCAGCATAAAAGCTTCTTCCATTGGTGGTATTGCCACGGCAACAGGAACAGAAGTAGCTGGTGCAGCAGCGACAGATATCACTATCGCAATTGGAGGAGGA；(NEUA1-F)-(NEUA1-R)，擴(kuò)增序列為134BP，為嗜肺軍團(tuán)菌NEUA1型等位基因一段保守序列，具體序列如下：CTCCTGTTTAAGTTTCAGCAAATGGATGTTTTTTTTGACAGTGTATTGCTGTTACAACCAACTTCTCCATTTAGGAAGCCAGAAACCATAAGACATGCTGTTGAAATACATAAAGTAACGGGGAAAAGTGTCGT。本發(fā)明提供的嗜肺軍團(tuán)菌ST1型菌株快速檢測(cè)的試劑盒對(duì)于所有軍團(tuán)菌屬細(xì)菌，其會(huì)擴(kuò)增出388bp的目地片段；對(duì)于嗜肺軍團(tuán)菌，其會(huì)擴(kuò)增出除388bp軍團(tuán)菌屬特異性片段外的229bp嗜肺軍團(tuán)菌種特異片段；對(duì)于嗜肺軍團(tuán)菌高致病性ST1型流行菌株，其會(huì)擴(kuò)增出除軍團(tuán)菌屬特異性的388bp片段和嗜肺軍團(tuán)菌種特異性229bp片段外，還會(huì)同時(shí)擴(kuò)增出嗜肺軍團(tuán)菌高致病性ST1型流行菌株104bp和134bp片段。本發(fā)明提供的嗜肺軍團(tuán)菌ST1型菌株快速檢測(cè)的試劑盒的方法是利用多重PCR原理，利用不同類型的軍團(tuán)菌菌株含有不同的特異基因，或相同的基因，其基因片段在不同型別菌種/菌株間的變異性，設(shè)計(jì)出針對(duì)不同類型菌株的4對(duì)特異引物，利用多重PCR的方式進(jìn)行擴(kuò)增，如果擴(kuò)增出某種類型菌株含有的某個(gè)基因的特異片段，則說(shuō)明存在該類型菌株。發(fā)明人經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)方法的研究發(fā)現(xiàn)16srDNA基因388bp片段所有軍團(tuán)菌屬細(xì)菌中高度保守，而lpp0267基因?yàn)槭确诬妶F(tuán)菌所獨(dú)有，flaA1型等位基因和neuA1型等位基因?yàn)槭确诬妶F(tuán)菌ST1型菌株所特有，設(shè)計(jì)針對(duì)上述不同類別特異的引物擴(kuò)增不同大小片段。此外，發(fā)明人經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)方法的分析，也發(fā)現(xiàn)這8條引物，除了上述的4個(gè)引物對(duì)的配對(duì)方法能夠擴(kuò)增出不同長(zhǎng)度的特異片段外，其他方式的兩兩組合方式，共計(jì)54種引物兩兩配對(duì)方式，均無(wú)非特異性片段出現(xiàn)，保證了反應(yīng)的特異性。本發(fā)明提供的嗜肺軍團(tuán)菌ST1型菌株檢測(cè)方法的結(jié)果判定方法是：對(duì)PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果進(jìn)行分析，若出現(xiàn)388bp條帶，則說(shuō)明檢測(cè)標(biāo)本中含有軍團(tuán)菌屬細(xì)菌，反之，則說(shuō)明檢測(cè)標(biāo)本中不含軍團(tuán)菌屬細(xì)菌；若除了出現(xiàn)388bp條帶外還出現(xiàn)了229bp條帶，則說(shuō)明檢出的軍團(tuán)菌為嗜肺軍團(tuán)菌；若除了388bp和229bp條帶，還同時(shí)出現(xiàn)了104bp和134bp條帶，則說(shuō)明檢測(cè)到的嗜肺軍團(tuán)菌軍團(tuán)菌為嗜肺軍團(tuán)菌ST1型菌株；如未同時(shí)出現(xiàn)134bp和104bp條帶，則為嗜肺軍團(tuán)菌其他ST型菌株；其余組合狀況可參考上述對(duì)于不同類型菌株特異性片段的說(shuō)明。本發(fā)明提供嗜肺軍團(tuán)菌ST1型菌株檢測(cè)試劑盒不僅能在臨床中應(yīng)用，還可以應(yīng)用于環(huán)境水標(biāo)本中，為環(huán)境水源風(fēng)險(xiǎn)性控制及軍團(tuán)菌感染流行病學(xué)調(diào)查提供依據(jù)和工具，有利于該檢測(cè)方法的推廣和應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供的嗜肺軍團(tuán)菌ST1型菌株檢測(cè)試劑盒，不僅能夠檢測(cè)軍團(tuán)菌屬細(xì)菌，還能將其分型嗜肺軍團(tuán)菌和非嗜肺軍團(tuán)菌，并且可以進(jìn)一步辨別嗜肺軍團(tuán)菌是否為嗜肺軍團(tuán)菌ST1型菌株，具有特異性好和準(zhǔn)確性高的優(yōu)點(diǎn)，提高了檢測(cè)效率。該檢測(cè)方法無(wú)需進(jìn)行多次凝膠電泳分析，操作簡(jiǎn)便，而且檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，是一種理想的嗜肺軍團(tuán)菌ST1型菌株檢測(cè)方法。附圖說(shuō)明圖1為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖；其中：Marker條帶；從下到上分別為：100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1200bp和1500bp，1-12分別為各個(gè)不同類型菌株鑒定結(jié)果，PC為陽(yáng)性對(duì)照，NC為陰性對(duì)照。具體實(shí)施方式以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說(shuō)明。對(duì)于本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡(jiǎn)單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。其中，Chelex100resin購(gòu)買(mǎi)自bio-rad公司(貨號(hào):1432832)。實(shí)施例1、引物本發(fā)明提供一種嗜肺軍團(tuán)菌ST1型菌株的引物。表1本發(fā)明提供的引物實(shí)施例2、引物的配對(duì)及其擴(kuò)增片段大小本發(fā)明采用實(shí)施例1提供的軍團(tuán)菌屬特異引物對(duì)擴(kuò)增片段為388bp、嗜肺軍團(tuán)菌種特異引物擴(kuò)增片段為229bp、嗜肺軍團(tuán)菌軍團(tuán)菌為ST1型菌株特異引物擴(kuò)增片段為104bp和134bp片段。表2引物的配對(duì)及其擴(kuò)增片段大小其中：(1)GL-388F與GL388-R引物擴(kuò)增的核苷酸序列為：GGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTGAGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTGGGGAGGAGGGTTAATAGGTTAAGAGCTGATTAACTGGACGTTACCCACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGTGGTTGATTAAGTTATCTGTGAAATTCCTGGGCTTAACCTGGGACGGTCAGATAATACTGGTTGACTCGAGTATGGGAGAGGGTAGTGGAATTTCCGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTACCTGGCCTAATACTGACACTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCAACTAGCTGTTGG；(2)LP-229F和LP-229R引物擴(kuò)增的核苷酸序列為：TCCGATGGTCAAGTGCGTAGGTATTGTGCCTGATTATCCACAGCATAAAGGAACAGAGTATCTTACAGCCTCACCTTTATATAACCATTACTTTAAGGCGATAGAGGAGTTTGATAAAGAGTTTGCTGAGGTTCATGAAAAAATTTGGCAGGAGTACCTTACGTATTTCCGTATGACTTATATGCCCGTTTGTATGCGTGATCATTGCCTGCCACATCAAGTCCCTTCA；(3)flaA1-F和flaA1-R擴(kuò)增的核苷酸序列為：TCGGCAGCATAAAAGCTTCTTCCATTGGTGGTATTGCCACGGCAACAGGAACAGAAGTAGCTGGTGCAGCAGCGACAGATATCACTATCGCAATTGGAGGAGGA；neuA1-F和neuA-R擴(kuò)增的核苷酸序列為：CTCCTGTTTAAGTTTCAGCAAATGGATGTTTTTTTTGACAGTGTATTGCTGTTACAACCAACTTCTCCATTTAGGAAGCCAGAAACCATAAGACATGCTGTTGAAATACATAAAGTAACGGGGAAAAGTGTCGT。實(shí)施例3、嗜肺軍團(tuán)菌ST1型菌株快速檢測(cè)的方法1)應(yīng)用細(xì)菌基因組DNA提取液提取待測(cè)標(biāo)本中的細(xì)菌基因組DNA：選取標(biāo)本進(jìn)行預(yù)處理，再使用細(xì)菌基因組DNA提取液提取細(xì)菌基因組DNA，其中，所述DNA提取液的成分如下：DNA提取液組成濃度Chelex100resin5％質(zhì)量濃度Tris-HCl,pH8.310mMEDTA-Na2(乙二胺四乙酸二鈉)0.1mMNaN3(疊氮鈉)0.1％質(zhì)量濃度Protease-K(蛋白酶K)200μg/ml2)以細(xì)菌基因組DNA為模板，采用實(shí)施例1所述的軍團(tuán)菌屬特異引物、嗜肺軍團(tuán)菌種特異引物、嗜肺軍團(tuán)菌ST1型菌株引物進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增；所述的PCR反應(yīng)混合液由以下組分組成：2×PCR反應(yīng)混合液(2×EasyTaqPCRSuperMix，含0.1UTaqPolymerase/μl，500μMdNTP，20mMTris-HCl(pH8.3)，100mMKCl，3mMMgCl2)10μL，ddH2O6.2μL。3)將陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照同時(shí)進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增；4)將所得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。凝膠成像結(jié)果，陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)該有對(duì)照的4條條帶分別為388bp，229bp，134bp和104bp，而陰性對(duì)照則無(wú)上述條帶出現(xiàn)。若凝膠成像后，陰性對(duì)照出現(xiàn)388條帶，或/和陽(yáng)性對(duì)照未出現(xiàn)388bp，229bp，134bp和104bp電泳條帶，則試驗(yàn)結(jié)果不可信，可能存在污染或操作有誤。試驗(yàn)管的產(chǎn)物經(jīng)過(guò)電泳若出現(xiàn)388bp條帶，則說(shuō)明標(biāo)本中檢出了軍團(tuán)菌，若無(wú)388bp條帶出現(xiàn)，則標(biāo)本中未檢出軍團(tuán)菌，即標(biāo)本中不存在軍團(tuán)菌；若除了出現(xiàn)388bp條帶外還出現(xiàn)了229bp條帶，則說(shuō)明檢出的軍團(tuán)菌為嗜肺軍團(tuán)菌；若除了388bp和229bp條帶，還同時(shí)出現(xiàn)了134bp和104bp條帶，則說(shuō)明檢測(cè)到的嗜肺軍團(tuán)菌軍團(tuán)菌為嗜肺軍團(tuán)菌ST1型菌株；如未同時(shí)出現(xiàn)134bp和104bp條帶，則為嗜肺軍團(tuán)菌其他ST型菌株，其余組合狀況可參考上述對(duì)于不同類型菌株特異性片段的說(shuō)明。實(shí)施例4、痰標(biāo)本的軍團(tuán)菌檢測(cè)1、含有嗜肺軍團(tuán)菌和非嗜肺軍團(tuán)菌的痰標(biāo)本處理：1)在1.5ml離心管中加入0.5ml軍團(tuán)菌專用的痰消化液；痰消化液為自制，其具體組成為：二硫蘇糖醇(DTT)0.2g，乙二胺四乙酸0.894g，氯化鉀0.04g，磷酸氫二鉀0.36g和磷酸二氫鉀0.04g,加雙蒸水混勻后定容為10ml。2)用槍頭或滅菌牙簽從痰標(biāo)本中吸取或挑取約0.5ml痰標(biāo)本，置于上述痰消化液中；3)充分混勻后，37℃水浴10～15min；4)在13000rpm的離心機(jī)中離心5分鐘后，棄上清，用0.5ml無(wú)菌水洗滌2次后離心留沉淀。2.標(biāo)本中細(xì)菌基因組DNA的提取：在上述留取沉淀的離心管中加入細(xì)菌基因組DNA提取液100μl，在56℃水浴30min，接著在100℃水浴10min，離心沉淀，在5000rpm下離心5min，上清液即為提取到的基因組DNA，供作DNA模版。3.PCR反應(yīng)1)每個(gè)標(biāo)本準(zhǔn)備3個(gè)PCR管，每管中分別加入兩種引物混合液3μl，標(biāo)記好管的編號(hào)。陽(yáng)性對(duì)照及陰性對(duì)照亦各為一管，編號(hào)為PC或NC，直接加入5μl雙蒸水進(jìn)行反應(yīng)；陽(yáng)性對(duì)照液與陰性對(duì)照液的組成參見(jiàn)表3。表3陽(yáng)性對(duì)照液和陰性對(duì)照液的組成配方PCR反應(yīng)條件為：94℃3min,94℃25s,56℃25s,72℃40s，35個(gè)循環(huán)，72℃5min,4℃貯存。4.瓊脂糖凝膠電泳反應(yīng)完成后，將產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳，取5μlPCR產(chǎn)物和5μlDNAMarker，加入1.5％瓊脂糖凝膠中電泳40min，DNAMarker的條帶從小到大分別為100bp，200bp，300bp，400bp，500bp，600bp，700bp，800bp，900bp，1000bp，1200bp和1500bp。5.試驗(yàn)結(jié)果：試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，其中：Marker條帶；從下到上分別為：100bp，200bp，300bp，400bp，500bp，600bp，700bp，800bp，900bp，1000bp，1200bp和1500bp，1-4分別為各個(gè)不同類型的菌種鑒定結(jié)果，PC為陽(yáng)性對(duì)照，NC為陰性對(duì)照。1-4道均出現(xiàn)了388bp條帶，說(shuō)明均檢出了軍團(tuán)菌屬細(xì)菌；1道僅出現(xiàn)了388bp條帶，說(shuō)明檢出了軍團(tuán)菌，且該軍團(tuán)菌為非嗜肺軍團(tuán)菌菌株；2-4道出現(xiàn)388bp條帶和229bp條帶，說(shuō)明檢出了嗜肺軍團(tuán)菌菌株，但是2-3道未同時(shí)出現(xiàn)104bp和134bp條帶，說(shuō)明檢出的嗜肺軍團(tuán)菌為非ST1型菌株。4道同時(shí)出現(xiàn)了104bp和134bp條帶說(shuō)明檢出的嗜肺軍團(tuán)菌ST1型菌株。本發(fā)明的嗜肺軍團(tuán)菌ST1型菌株檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果與實(shí)際的結(jié)果一致，證明本發(fā)明提供的嗜肺軍團(tuán)菌ST1型菌株檢測(cè)方法具有良好的實(shí)用性。SEQUENCELISTING<110>廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司<120>一種嗜肺軍團(tuán)菌ST1型菌株的快速檢測(cè)試劑盒及方法<130><160>8<170>PatentInversion3.3<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>1ggagggttgataggttaagagc22<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>2cgatctctacgcatttcaccg21<210>3<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>3gtcaaccagtattatctgaccgt23<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>4ctgggcttaacctgggac18<210>5<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>5tcggcagcataaaagcttcttac23<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>6tcctcctccaattgcgatagag22<210>7<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>7ctcctgtttaagtttcagcaaatggat27<210>8<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>8acgacacttttccccgttacttt23當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3