本發(fā)明涉及一種試劑盒，具體的說是一種豬瘟病毒抗體競爭化學(xué)發(fā)光定量檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
豬瘟又名霍亂，我國俗稱俗稱“爛腸瘟”，是由豬瘟病毒引起豬的一種高度接觸性傳染病，會出現(xiàn)小血管壁變性、內(nèi)臟器官多發(fā)性出血、壞死和梗死。該病傳播快、流行廣、發(fā)病率高和死亡率高，危害極大。世界衛(wèi)生組織將其列為法定的報告動物疫病，我國2008年修訂的《一、二、三類動物疫病病種記錄》將其列為一類動物疫病。我國豬瘟特征是以非典型豬瘟或溫和型豬瘟以及妊娠母豬繁殖障礙為主要表現(xiàn)形式，持續(xù)感染、隱性感染、混合感染和免疫失敗現(xiàn)象普遍存在。目前我國的防治措施中以疫苗免疫為主，對疫苗免疫效果的評價主要通過豬瘟抗體水平的檢測。
因此豬瘟病毒抗體快速檢測成為了控制和消滅該病的前提。目前的豬瘟診斷技術(shù),主要有補體結(jié)合試驗、瓊脂免疫擴散試驗、病毒中和試驗等方法。但是,傳統(tǒng)的檢測方法都需要較長時間的診斷過程,以及一定的實驗技能和儀器設(shè)備,一般只適用實驗室的診斷。近年來，ELISA診斷技術(shù)取得了很大的進步，有許多敏感性高、特異性好的ELISA方法已經(jīng)運用到疫苗免疫群體的大規(guī)模血清學(xué)檢驗當(dāng)中，這些方法主要是間接ELISA和阻斷ELISA。這些方法雖然靈敏度高、特異性強，但存在內(nèi)源性酶干擾、底物大部分有毒或為致癌物質(zhì)等缺點。開發(fā)一種安全、靈敏、高效的檢測診斷方法十分必要。
化學(xué)發(fā)光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay, CLIA)是近十年來在世界范圍內(nèi)發(fā)展非常迅速的非放射性免疫分析，是繼放射免疫分析和酶免疫分析之后發(fā)展起來的一種超高靈敏度的微量測定技術(shù)。化學(xué)發(fā)光免疫分析將抗原與杭體的高特異性免疫反應(yīng)與高靈敏的化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)相結(jié)合，將化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記杭原或杭體，再進行免疫結(jié)合反應(yīng)，即可進行定性、定量測定。該方法具有高靈敏度、檢測范圍寬、操作簡便快速、標(biāo)記物穩(wěn)定、無污染、儀器簡單經(jīng)濟等優(yōu)點。如果將兩種方法有效的結(jié)合在一起，就可以使口蹄疫的檢測更快速、更靈敏、更準確、更安全。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明目的是為解決上述技術(shù)問題的不足，提供一種豬瘟病毒抗體競爭化學(xué)發(fā)光定量檢測試劑盒，其具有檢測時間短，檢測信號大大增強，靈敏度高等優(yōu)點，且實現(xiàn)了豬瘟病毒抗體定量檢測。
本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：
一種豬瘟病毒抗體競爭化學(xué)發(fā)光定量檢測試劑盒，包括抗原包被板、酶標(biāo)抗體、校準品、濃縮洗滌液、發(fā)光底物A、發(fā)光底物B；
所述抗原包被板，將純化的豬瘟病毒E2蛋白作為包被抗原，使用PH9.6的碳酸鹽緩沖液將豬瘟病毒E2蛋白包被在不透明聚苯乙烯板上；
所述酶標(biāo)抗體為酶標(biāo)抗體由辣根過氧化物酶標(biāo)記的豬瘟病毒單克隆抗體；采用戊二醛方法進行標(biāo)記，即將豬瘟病毒單克隆抗體、戊二醛和辣根過氧化物酶加入容器中進行交聯(lián)，所得混合物，進行透析除去過量的戊二醛；在透析后的混合物中，加入等體積的甘油，置于-20℃保存；
所述校準品，將活疫苗免疫的高免血清采用校準品稀釋液分別稀釋到濃度為0 NU/mL、2NU/mL、5 NU/mL、10 NU/mL、30 NU/mL和60NU/mL；
所述劑量單位NU/mL的建立方法為，根據(jù)血清的細胞中和試驗結(jié)果，挑選效價分別為全陰血清、1:2、1:20、1:80、1:960、1:2560的血清，建立起和中和試驗血清效價相對應(yīng)的線性關(guān)系，并且建立起和中和試驗血清效價分別為全陰血清、1:2、1:20、1:80、1:960、1:2560相對應(yīng)的校準品，校準品分別為0、2、5、10、30、60，并且建立劑量單位NU/ml；
所述濃縮洗滌液，為含有0.05%的Tween-20的PBS緩沖液，使用時采用蒸餾水進行稀釋；
所述發(fā)光底物A中含有魯米諾0.15mmol/L，羥基香豆素0.59mmol/L、沒食子酸0.35mmol/L和Tris-Hcl緩沖液0.2mol/L，余量為水；
所述發(fā)光底物B中含有氨基酸氧化酶0.85mmol/L，吐溫-20 體積濃度為.8%， DTPA 0.5mmol/L、維生素C 0.12mmol/L和乙酸-乙酸鹽緩沖液0.2mol/L，余量為水；
所述校準品稀釋液為每1000mL PBS緩沖液中加入10g牛血清白蛋白，再加入質(zhì)量濃度為0.5‰的NaN3（三氮化鈉）。
所述豬瘟病毒抗體競爭化學(xué)發(fā)光定量檢測試劑盒檢測豬瘟病毒抗體的方法，包括以下步驟：
（1）加樣 取出抗原包被板，每塊板可檢測樣本90份，設(shè)校準品6孔；樣本孔每孔加入50μl的樣本，校準品孔每孔各加入50μl，再向以上各孔中立即加入50μl酶結(jié)合物；
（2）孵育 置37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30±1分鐘；
（3）洗板 采用蒸餾水進行對濃縮洗滌液進行稀釋得到洗滌液；將各孔的液體棄入廢液筒，每孔加入洗滌液28±20μl，浸泡約30秒，棄去洗滌液，連續(xù)洗滌5次；在最后一次洗滌液棄去后，將孔中殘留的洗滌液在吸水紙上拍干；
（4）加入發(fā)光底物、測定 每孔加入50μl發(fā)光底物A和50μl發(fā)光底物B，18～26℃避光5min后在發(fā)光儀上測定；
（5）結(jié)果判定 以校準品發(fā)光值為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的校準品濃度為橫坐標(biāo)，繪制校準品的四參數(shù)標(biāo)準曲線，四參數(shù)模式為Y=(a-d)/[1+(x/c)b]+d；（其中a--吸光度上限值，b-吸光度增長速率參數(shù)，相當(dāng)于曲線的斜率；c--吸光度增長速度開始發(fā)生變化的濃度值，相當(dāng)于半數(shù)反應(yīng)濃度（EC50）；d--吸光度下限值；y-發(fā)光值，x-最終得到的實際含量；）將樣本的發(fā)光值代入標(biāo)準曲線中，從校準曲線上直接讀出樣品中豬瘟病毒抗體的含量，劑量值≥2.5 NU/mL，判定為陽性；劑量值＜2.5 NU/mL，判定為陰性。
所述步驟（4）中每孔加入50μl發(fā)光底物A和50μl發(fā)光底物B可替換為，發(fā)光底物A和發(fā)光底物B等體積比混勻后，添加洗滌液補充至100μl。
有益效果是：
1、本發(fā)明試劑盒，可檢測0～2000萬的發(fā)光值，線性范圍大，30min可檢出結(jié)果；傳統(tǒng)酶免分析法，可檢測0～3.5的OD值，線性范圍小，75min可檢出結(jié)果；化學(xué)發(fā)光實現(xiàn)了檢測時間短，檢測信號大大增強；敏感性檢驗結(jié)果顯示其具有檢測更為準確靈敏。
2、根據(jù)血清中和試驗的不同血清效價如全陰血清、1:2、1:20、1:80、1:960、和1:2560等建立起相應(yīng)的校準品濃度及單位，建立起和中和試驗血清效價相對應(yīng)的線性關(guān)系，并且建立新的劑量單位NU/mL，在大分子上首先實現(xiàn)了豬瘟病毒抗體定量檢測，并可以快速的定量檢測大批樣本，快速準確，具有技術(shù)上的顯著進步。酶標(biāo)單抗隆抗體的制備，實現(xiàn)了一步法30min出結(jié)果，血清不需要稀釋直接加樣，縮短了反應(yīng)時間，簡化了操作過程。采用發(fā)光底物，相較傳統(tǒng)的顯色底物，加入發(fā)光底物后無需終止可以直接讀值，縮短了操作時間，致癌性和危害性較小，更為安全無污染。
具體實施方式
一種豬瘟病毒抗體競爭化學(xué)發(fā)光定量檢測試劑盒，包括抗原包被板、酶標(biāo)抗體、校準品、濃縮洗滌液、發(fā)光底物A、發(fā)光底物B；
所述抗原包被板，將純化的豬瘟病毒E2蛋白作為包被抗原，使用PH9.6的碳酸鹽緩沖液將豬瘟病毒E2蛋白包被在不透明聚苯乙烯板上；
所述酶標(biāo)抗體為酶標(biāo)抗體由辣根過氧化物酶標(biāo)記的豬瘟病毒單克隆抗體；采用戊二醛方法進行標(biāo)記，即將豬瘟病毒單克隆抗體、戊二醛和辣根過氧化物酶加入容器中進行交聯(lián)，所得混合物，進行透析除去過量的戊二醛；在透析后的混合物中，加入等體積的甘油，置于-20℃保存；
所述校準品，將活疫苗免疫的高免血清采用校準品稀釋液分別稀釋到濃度為0 NU/mL、2NU/mL、5 NU/mL、10 NU/mL、30 NU/mL和60NU/mL；
所述劑量單位NU/mL的建立方法為，根據(jù)血清的細胞中和試驗結(jié)果，挑選效價分別為全陰血清、1:2、1:20、1:80、1:960、1:2560的血清，建立起和中和試驗血清效價相對應(yīng)的線性關(guān)系，并且建立起和中和試驗血清效價分別為全陰血清、1:2、1:20、1:80、1:960、1:2560相對應(yīng)的校準品，校準品分別為0、2、5、10、30、60，并且建立劑量單位NU/ml；劑量單位NU/mL建立，首先實現(xiàn)了定量、快速檢測，可以快速的定量檢測大批樣本。
所述濃縮洗滌液，為含有0.05%的Tween-20的PBS緩沖液，使用時采用蒸餾水進行稀釋；
所述發(fā)光底物A中含有魯米諾0.15mmol/L，羥基香豆素0.59mmol/L、沒食子酸0.35mmol/L和Tris-Hcl緩沖液0.2mol/L，余量為水；
所述發(fā)光底物B中含有氨基酸氧化酶0.85mmol/L，吐溫-20 體積濃度為.8%， DTPA 0.5mmol/L、維生素C 0.12mmol/L和乙酸-乙酸鹽緩沖液0.2mol/L，余量為水；
所述校準品稀釋液為每1000mL PBS緩沖液中加入10g牛血清白蛋白，再加入質(zhì)量濃度為0.5‰的NaN3。
所述豬瘟病毒抗體競爭化學(xué)發(fā)光定量檢測試劑盒檢測豬瘟病毒抗體的方法，包括以下步驟：
1、加樣 取出抗原包被板，每塊板可檢測樣本90份，設(shè)校準品6孔。樣本孔每孔加入50μl的樣本，校準品孔每孔加入S1～S6各50μl，再向以上各孔中立即加入50μl酶結(jié)合物。
2、孵育 置37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30分鐘（±1分鐘）。
3、洗板 將各孔的液體棄入廢液筒，每孔加入洗滌液280μl（±20μl），浸泡約30秒，棄去洗滌液，連續(xù)洗滌5次。在最后一次洗滌液棄去后，將孔中殘留的洗滌液在吸水紙上拍干。
4、加入發(fā)光底物、測定 每孔加入50μl發(fā)光底物A和50μl發(fā)光底物（也可發(fā)光底物A、B等比例混勻后加100μl），18～26℃避光5min后在發(fā)光儀上測定。
5、結(jié)果判定 以校準品發(fā)光值為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的校準品濃度為橫坐標(biāo)，繪制校準品的四參數(shù)擬合曲線，四參數(shù)模式為Y=(a-d)/[1+(x/c)b]+d。將樣本的發(fā)光值代入標(biāo)準曲線中，從標(biāo)準曲線上直接讀出樣品中豬瘟病毒抗體實際含量。
劑量值≥2.5 NU/mL，判定為陽性；
劑量值＜2.5 NU/mL，判定為陰性。
相關(guān)實驗
一、特異性檢驗
按照說明書操作要求測定豬丹毒、豬偽狂犬、副豬嗜血桿菌、豬圓環(huán)Ⅱ型、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（PRRSV）陽性血清，檢驗結(jié)果為豬丹毒、豬偽狂犬、副豬嗜血桿菌、豬圓環(huán)Ⅱ型、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（PRRSV）陽性血清的濃度值均小于2.5 NU/mL，無特異性反應(yīng)。數(shù)據(jù)如下：
二、敏感性檢驗
敏感性以陽性檢出率來表示，選擇30份豬血清（其中10份陰性、10份弱陽、10份強陽），以中和試驗為金標(biāo)準，數(shù)據(jù)如下：
中和試驗效價大于1:10為陽性，效價小于1:10為陰性；本試劑盒劑量值大于等于2.5NU/mL為陽性，劑量值小于2.5NU/mL為陰性；有數(shù)據(jù)可知本試劑盒和中和試驗的陽性符合率為100%，說明本試劑盒有較好的敏感性。