本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體地，本發(fā)明涉及一種口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，特別是口蹄疫A型病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
：口蹄疫(FootandMouthDisease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdiseasevirus,FMDV)引起的以感染偶蹄動(dòng)物為主的急性、熱性、高度接觸傳染性和快速遠(yuǎn)距離傳播的動(dòng)物疫病,以傳染性強(qiáng)、傳播速度快、危害嚴(yán)重而著稱(謝慶閣,2004)。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為必須通報(bào)的多種動(dòng)物共患傳染病之一，我國(guó)將其列為一類動(dòng)物傳染病?？谔阋邆魅拘愿?，傳播迅速，感染豬、牛、羊等牲畜常導(dǎo)致幼畜死亡，成年動(dòng)物生產(chǎn)能力急劇下降。該病傳播迅速,可以引起世界性的大流行,不僅對(duì)畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,而且嚴(yán)重影響動(dòng)物及其產(chǎn)品的國(guó)際貿(mào)易和聲譽(yù)。由于FMD的巨大危害性,美國(guó)權(quán)威著作《家畜傳染病》早在1981年版中就聲明:FMD不僅是經(jīng)濟(jì)性疾病,同時(shí)也是政治性疫病?？谔阋卟《緦儆谛『颂呛怂岵《究疲谔阋卟《緦?。由“假”20面體對(duì)稱的衣殼和病毒核酸構(gòu)成，該病毒粒子的整個(gè)外形是球形，不是嚴(yán)格的正20面體。完整的病毒顆粒包括衣殼和RNA兩部分，衣殼由VP1,VP2，VP3和VP4等4種結(jié)構(gòu)蛋白各60個(gè)分子組成。結(jié)構(gòu)蛋白VP1大部分暴露在病毒粒子表面,是決定病毒抗原性的主要成分,也是刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主要蛋白。4種結(jié)構(gòu)蛋白中VP1變異性最大,VP2較為保守,VP4最保守。病毒衣殼蛋白的功能有:保護(hù)RNA免遭核酸酶降解；識(shí)別特異性細(xì)胞受體,決定宿主范圍和組織嗜性；決定病毒的抗原性；釋放和傳遞病毒RNAZ通過細(xì)胞膜進(jìn)入易感細(xì)胞內(nèi)；指導(dǎo)選擇和包裝病毒RNA。2004年OIE公布的口蹄疫血清學(xué)檢測(cè)方法有3種：病毒中和試驗(yàn)(VNT)、液相阻斷ELISA(LPB-ELISA)、固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA(SPC-ELISA)，其中病毒中和試驗(yàn)是3種方法中最為經(jīng)典的方法，是評(píng)價(jià)其他方法的黃金標(biāo)準(zhǔn)。1996年，口蹄疫世界參考實(shí)驗(yàn)室建立了液相阻斷ELISA方法，經(jīng)過不斷完善和健全，已成為各國(guó)大規(guī)模血清學(xué)檢測(cè)的方法，用于檢測(cè)動(dòng)物免疫抗體、評(píng)估動(dòng)物免疫狀況、進(jìn)行血清學(xué)調(diào)查等，該方法的敏感性、特異性和穩(wěn)定性一直在國(guó)際上得到公認(rèn)，是目前使用最廣的口蹄疫血清學(xué)檢測(cè)方法。2001年，口蹄疫世界參考實(shí)驗(yàn)室建立了固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，該方法除了具有液相阻斷ELISA方法的傳統(tǒng)優(yōu)勢(shì)外，其特異性更好，操作更為簡(jiǎn)單(其操作時(shí)間僅為3.5h)，2004年被OIE確立為口蹄疫血清學(xué)調(diào)查的最新推薦方法?？谔阋呤顷P(guān)系到國(guó)家經(jīng)濟(jì)安全的重大動(dòng)物疫病，目前,大多數(shù)發(fā)展中國(guó)家和地區(qū)都通過接種疫苗的方法來控制口蹄疫的流行。我國(guó)防控FMD主要采取疫苗免疫和抗體監(jiān)測(cè)為主的綜合防控政策,通過接種疫苗提高畜群整體抗體水平來預(yù)防口蹄疫的感染和傳播。因此口蹄疫感染的快速診斷、豬和牛免疫效果評(píng)價(jià)、自然感染和疫苗免疫的鑒別診斷成為防控口蹄疫的部分關(guān)鍵技術(shù)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種新的基于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，用于檢測(cè)豬、牛血清中是否含有口蹄疫A型病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體的試劑盒。本發(fā)明利用VP1結(jié)構(gòu)蛋白,建立一種特異性、敏感性和重復(fù)性好的間接ELISA方法,為豬、?？谔阋呙庖呖贵w的檢測(cè)和感染抗體的診斷提供一種簡(jiǎn)便有效的新方法,為口蹄疫綜合防控提供技術(shù)支持。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明首先篩選得到了性能優(yōu)異的抗原表位多肽，本發(fā)明提供的口蹄疫A型病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1抗原表位多肽，為序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2或序列表中序列3所示的多肽。更進(jìn)一步的，本發(fā)明提供一種口蹄疫A型病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1抗原表位多肽組合物，其有效成分為序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2的多肽和序列表中序列3所示的多肽中的一種或兩種以上任意組合。本發(fā)明的口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，包括口蹄疫A型病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1抗原表位多肽包被的酶聯(lián)反應(yīng)板和酶標(biāo)二抗；所述口蹄疫A型病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1抗原表位多肽為序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2所示的多肽和序列表中序列3所示的多肽。本發(fā)明的口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒中，所述序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2所示的多肽和序列表中序列3所示的多肽的質(zhì)量比為0.5～2.0:0.5～2.0:1，優(yōu)選為1:1:1。所涉及的包被抗原采用固相化學(xué)合成的方法生產(chǎn)，包被抗原含有口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1的主要抗原位點(diǎn)，可與口蹄疫病毒感染后或免疫后產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)蛋白VP1抗體特異結(jié)合。所述酶標(biāo)二抗的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶；所述酶標(biāo)二抗為酶標(biāo)記葡萄球菌A蛋白；所述酶標(biāo)二抗優(yōu)選為辣根過氧化物酶標(biāo)記的葡萄球菌A蛋白。所述酶聯(lián)反應(yīng)板為可拆卸96孔酶標(biāo)板；所述口蹄疫A型結(jié)構(gòu)蛋白VP1抗原表位多肽為化學(xué)人工合成得到。所述口蹄疫A型結(jié)構(gòu)蛋白VP1抗原表位多肽包被的酶聯(lián)反應(yīng)板的板的最佳制備條件是：將所述口蹄疫A型結(jié)構(gòu)蛋白VP1抗原表位多肽溶于100μl的pH9.6的碳酸鹽溶液，然后加到96孔聚苯乙烯酶聯(lián)反應(yīng)板，每孔每肽50ng抗原，在37℃放置2～4h，再4～8℃下放置過夜，使多肽抗原與酶聯(lián)反應(yīng)板充分結(jié)合，然后按照300μl/孔加入含有1％(g/ml)牛血清白蛋白(BSA)的PBS緩沖液(pH＝7.4)，37℃封閉處理2～3h，用洗滌緩沖液(濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水20倍稀釋得到洗滌緩沖液)洗滌后甩干，待酶聯(lián)反應(yīng)板干燥后4℃密封保存。所述試劑盒中含有顯色液和終止液；當(dāng)標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶時(shí)顯色液由顯色液A液和顯色液B液組成，所述顯色液A液為含0.6mg/ml過氧化氫尿素的檸檬酸磷酸鹽緩沖液；所述顯色液B液為0.2mg/ml的四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶液,使用時(shí)兩者以1:1的比例混合；當(dāng)標(biāo)記酶為堿性磷酸酶時(shí)，顯色液為4-硝基酚磷酸鹽緩沖液；所述終止液為2mol/L的硫酸溶液。所述試劑盒還包括陰性對(duì)照血清、陽性對(duì)照血清；所述陰性對(duì)照血清為用無口蹄疫抗體的正常豬血清；所述陽性對(duì)照血清為以所述口蹄疫A型病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1抗原表位多肽為免疫原免疫豬得到的血清；所涉及的陽性對(duì)照血清是具體是以上述人工化學(xué)合成的包被抗原(口蹄疫A型病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1抗原表位多肽)作為免疫原(免疫25～35日齡無特定病源體豬)制備高免血清，過0.2μm濾膜除菌，作為試劑盒的陽性對(duì)照血清。所涉及的陰性對(duì)照血清是用無口蹄疫抗體的正常豬血清，過0.22μm濾膜除菌，作為試劑盒陰性對(duì)照血清。所述試劑盒還包括樣品稀釋液和濃縮洗滌液；樣品稀釋液為含有0.5％(g/ml)酪蛋白的0.01M、pH為7.4的PBS緩沖液(過0.22μm濾膜)；濃縮洗滌液：0.01M，pH7.4，含有0.8％～1.2％(ml/ml，優(yōu)選0.5％ml/ml)Tween-20和0.05％(g/ml)疊氮鈉防腐劑的磷酸鹽緩沖液(經(jīng)過0.22μm濾膜除菌)。本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)程序?yàn)椋?、平衡：將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出，置室溫平衡30min備用；液體試劑用前混勻。2、配液：將濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水20倍稀釋得到洗滌緩沖液；3、設(shè)定：2個(gè)陰性對(duì)照孔和2個(gè)陽性對(duì)照孔，其余為待測(cè)樣本孔。4、待測(cè)標(biāo)本預(yù)稀釋：使用樣品稀釋液將待檢樣品血清、陰性對(duì)照血清、陽性對(duì)照血清按照1：20的比例稀釋。5、加樣：2個(gè)陰性對(duì)照孔各加100μl陰性對(duì)照，2個(gè)陽性對(duì)照孔各加100μl陽性對(duì)照；其余孔分別按預(yù)先設(shè)定加100μl稀釋的待測(cè)樣本。加樣過程時(shí)間跨度應(yīng)盡量短。6、溫育：震蕩混勻，置37℃溫箱或水浴鍋中，反應(yīng)30min。7、洗板：棄去反應(yīng)液，每孔加300μl稀釋后的洗滌緩沖液，浸泡15s，甩棄洗液。連續(xù)洗板4次后拍干。8、加酶：各孔加100μl辣根過氧化物酶標(biāo)記的葡萄球菌A蛋白。9、溫育：置37℃溫箱或水浴鍋中，反應(yīng)30min。10、洗板：棄去反應(yīng)液，每孔加入稀釋后的洗滌緩沖液300μl，浸泡15s，甩棄洗滌液。連續(xù)洗板4次后拍干。11、顯色每孔分別加入100μl的底物顯色液(其中溶液A和溶液B以體積比為1：1的比例混合)。加蓋，37℃恒溫箱里反應(yīng)15min；12、每孔分別加入50μl終止液終止反應(yīng)，混勻；13、測(cè)定每孔的OD450值(加終止液的反應(yīng)板應(yīng)在15min內(nèi)讀取OD450值)。檢測(cè)結(jié)果的判定：1、陰性對(duì)照OD450平均值應(yīng)該≤0.15，否則無效。2、陽性對(duì)照每個(gè)檢測(cè)值應(yīng)該在0.9-2.3之間，否則無效。3、臨界值的計(jì)算：牛血清臨界值＝0.15×陽性對(duì)照OD450值平均值豬血清臨界值＝0.18×陽性對(duì)照OD450值平均值待檢血清測(cè)定OD450值≥臨界值者判為陽性；待檢血清測(cè)定OD450值<臨界值者判為陰性。本發(fā)明的上述試劑盒，可用于檢測(cè)口蹄疫A型病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體，以判斷被檢動(dòng)物是否存在感染或免疫后產(chǎn)生的口蹄疫A型病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1抗體，其中，動(dòng)物口蹄疫病毒病為豬、牛口蹄疫病毒病，具體可以為豬、牛口蹄疫A型病毒引起的口蹄疫病毒病。在制備檢測(cè)是否感染動(dòng)物口蹄疫病毒病的試劑盒中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；本發(fā)明的積極效果在于：本發(fā)明采用生物信息學(xué)方法對(duì)結(jié)構(gòu)蛋白的抗原表位進(jìn)行精確分析，從VP1蛋白上的主要抗原表位上篩選出適合ELISA檢測(cè)用的肽段。該肽段集中了抗原表位，具有靈敏性高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)，采用先進(jìn)的固相合成肽技術(shù)合成多肽抗原用于包被酶標(biāo)反應(yīng)板以及制備試劑盒中的陽性對(duì)照血清。另外，由于試劑盒中使用的包被抗原是化學(xué)合成多肽，不含雜蛋白，純度高，進(jìn)一步提高了檢測(cè)口蹄疫結(jié)構(gòu)蛋白抗體的效率，以判斷被檢動(dòng)物是否感染口蹄疫病毒或接種疫苗。總之，本試劑盒采用化學(xué)合成結(jié)構(gòu)蛋白VP1主要抗原位點(diǎn)的抗原肽包被酶聯(lián)反應(yīng)板，抗原用量少、靈敏度高、特異性強(qiáng)，可以有效地檢測(cè)口蹄疫病毒感染或接種滅活疫苗后產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)蛋白VP1抗體，以判斷被檢動(dòng)物是否感染口蹄疫病毒或接種疫苗，與口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白抗體檢測(cè)試劑盒聯(lián)用，可區(qū)分口蹄疫病毒感染動(dòng)物及疫苗免疫動(dòng)物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的試劑盒重復(fù)性好，特異性強(qiáng)，靈敏度高。能滿足不同層次人員的需要，具有廣闊的市場(chǎng)前景和良好的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)效益。本發(fā)明所涉及的口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)診斷試劑盒用于檢測(cè)動(dòng)物是否感染口蹄疫病毒或接種口蹄疫疫苗，有利于減少我國(guó)口蹄疫爆發(fā)所帶來的損失，也有利于我國(guó)口蹄疫防控體系的建立。具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例1、口蹄疫A型結(jié)構(gòu)蛋白VP1抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒包被抗原的制備本試驗(yàn)針對(duì)國(guó)內(nèi)口蹄疫流行毒株的不同，采用生物信息學(xué)方法對(duì)口蹄疫病毒A型VP1結(jié)構(gòu)蛋白多個(gè)亞型進(jìn)行精確分析，篩選出合適的肽段，用全自動(dòng)多肽合成儀分別合成出根據(jù)流行毒株序列設(shè)計(jì)的3條肽，序列分別為序列表中序列1、序列2和序列3所示，制成純度約90％的更新更全的包被抗原，能夠適應(yīng)口蹄疫病毒不斷突變的特性，提高抗體陽性的檢出率。多肽合成方法可為常規(guī)方法，本發(fā)明使用如下方法合成本發(fā)明的三條多肽，作為本發(fā)明試劑盒的包被原。本發(fā)明的包被抗原可使用AppliedBiosystem全自動(dòng)多肽合成儀(型號(hào)433A)制備。運(yùn)用Merrifield固相合成法，采用的是Fmoc(9-fluorenylmethyloxycarbonyl，9-芴甲氧羰基)修飾的氨基酸，使用RinkAmideMBHA樹脂作為固相載體。生產(chǎn)過程包括多肽抗原固相合成、多肽裂解和鑒定、抗原純化、冷凍干燥以及保存五部分。以下分別進(jìn)行說明：一、包被抗原固相合成1、合成試劑的準(zhǔn)備合成包被抗原氨基酸序列如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示。依據(jù)包被抗原序列以及合成規(guī)模準(zhǔn)備合適的Fmoc修飾的氨基酸(購(gòu)自NOVA公司)，加入至對(duì)應(yīng)的Cartridge中。同樣按要求合成規(guī)模稱樹脂5g，放入反應(yīng)腔，將上下蓋子擰緊，貼標(biāo)簽，記錄所合成肽的名稱，批號(hào)，反應(yīng)腔的TARE及所稱樹脂的重量。將反應(yīng)腔裝入合成儀。配制適量的合成試劑包括100％的NMP、3％的AIM(已酰咪唑)、35％的PIP(哌啶)、100％的MeOH(甲醇)等放置到相對(duì)應(yīng)的試劑瓶中。2、合成儀狀態(tài)的檢測(cè)檢查433A多肽合成儀器是否正常運(yùn)行，開機(jī)后，運(yùn)行RunSelfTest程序，儀器自檢各項(xiàng)指標(biāo)是否正常。另外檢查氮?dú)馐欠癯渥?，系統(tǒng)表壓是否正常(433A正常表壓10.2psi)。合成前應(yīng)對(duì)儀器的性能有所了解，所以要對(duì)每種合成試劑的流速進(jìn)行測(cè)定。433A合成儀：發(fā)送FlowRate1-18到合成儀，選擇MainMenu—ModuleTest—按Prer或next找ModuleA、ModuleD、ModuleI、ModuleI、ModuleA)—按Start—按more進(jìn)行測(cè)量或觀察，若流量不合適，則調(diào)節(jié)下閥門壓力，直至達(dá)到要求(具體檢測(cè)要求見下表1)。表1.多肽合成儀流速檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)表試劑瓶號(hào)Module標(biāo)準(zhǔn)范圍35％Piperidine1A1.0～1.2ml3％AIM4D1.0～1.2ml100％MeOH9I3.5～4.0mlDIC8I0.45～0.55g100％NMP10A2.6～2.8ml3、包被抗原合成開始在433A合成儀的程序中將要合成的氨基酸序列發(fā)送StdFmoc1.0SolDIC90到合成儀上。File-New-Sequence-編輯合成肽的序列，保存。File-New-Run，檢查Chemistry是否為StdFmoc1.0SolDIC90；Sequence是否為所存名字；設(shè)定Cycles；保存。最后發(fā)送到合成儀上。MainMenu—CycleMonitor—begin，開始運(yùn)行。4、包被抗原合成進(jìn)行Fmoc基團(tuán)的脫除，F(xiàn)moc基團(tuán)的芴環(huán)系的吸電子作用使9-H具有酸性，易被較弱堿除去，反應(yīng)時(shí)用哌啶(PIP)進(jìn)攻9-H,β消除形成二苯芴烯，很容易被二級(jí)環(huán)胺進(jìn)攻形成穩(wěn)定的加成物。Fmov基團(tuán)的脫除后暴露出“－NH2”基團(tuán)以進(jìn)行合成反應(yīng)。然后加入活化的下一個(gè)Fmoc基團(tuán)保護(hù)的氨基酸和1-羥基苯并三唑(1-hydroxybenzotriazole，HOBT)至反應(yīng)器內(nèi)。如上述的多肽序列，合成的時(shí)候是從C端開始至N端，依照特定的順序，依次不斷地重復(fù)合成步驟(合成按程序自動(dòng)完成，具體循環(huán)步驟如下表2)。期間觀察記錄試劑用量及運(yùn)行情況。表2.包被抗原合成循環(huán)步驟5、包被抗原合成結(jié)束包被抗原合成結(jié)束后合成儀將自動(dòng)停止，并且肽樹脂(肽連接在樹脂上)基本洗滌干凈。然后從多肽合成儀上取下反應(yīng)器，再用100％甲醇洗滌肽樹脂3次后，在通風(fēng)櫥內(nèi)吹干，然后將多肽樹酯全部轉(zhuǎn)移至棕色的聚乙烯瓶?jī)?nèi)，放入-20℃冰箱內(nèi)，封口膜密封備用。二、包被抗原的裂解及鑒定1、多肽抗原的裂解經(jīng)上述反應(yīng)所得到的多肽是與固相載體通過化學(xué)鍵結(jié)合在一起的，必須通過特定的有機(jī)強(qiáng)酸的酸解把多肽與固相載體分離。酸解的同時(shí)也除去了各個(gè)氨基酸官能團(tuán)上的保護(hù)基。步驟如下：從冰箱內(nèi)取出合成的肽樹酯(多肽連接在樹脂上)，放入一只2L的圓底燒瓶?jī)?nèi)，在通風(fēng)櫥內(nèi)向燒瓶中加入90ml三氟乙酸(Trifluoroaceticacid,TFA)、10ml的三丙基硅烷(TIS)和磁力攪拌子，然后穩(wěn)定地將燒瓶放置在磁力攪拌器上，室溫下持續(xù)攪拌1h至反應(yīng)完全。反應(yīng)結(jié)束后，使用帶冷阱的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀持續(xù)蒸發(fā)30～120min除去粗產(chǎn)品中的TFA。然后用二甲基甲酰氨(DMF)多次清洗多肽抗原的粗品，最后將混合在一起的樹脂用砂心漏斗過濾出來，既得到包被抗原。2、包被抗原的鑒定多肽抗原合成完畢后用基質(zhì)輔助激光解吸飛試時(shí)間質(zhì)譜法(MODAL-TOF)和反相高壓液相色譜法(RP-HPLC)進(jìn)行定性定量分析，用常見的氨基酸分析來鑒定所合成的肽。3、包被抗原純化將環(huán)化后的多肽抗原使用循環(huán)式切向過濾膜包進(jìn)行超濾(用PALL公司生產(chǎn)的TangentialFlowDevice循環(huán)式切向過濾膜包以及與其配套的蠕動(dòng)泵)，多肽抗原作為大分子不能通過一定孔徑的濾膜，而前期合成過程以及后期環(huán)化反應(yīng)形成或引進(jìn)的小分子雜質(zhì)則可以通過濾膜。然后再通過孔徑為0.2μm過濾器除菌，將最后所得溶液分裝到無菌塑料瓶?jī)?nèi)，貼上標(biāo)簽。標(biāo)簽上注明多肽的名稱、編號(hào)、生產(chǎn)批號(hào)、濃度、生產(chǎn)日期、保存期限及保存條件，分裝后，儲(chǔ)存于-20℃或-40℃?zhèn)溆谩?、包被抗原冷凍干燥為了便于長(zhǎng)期保存和運(yùn)輸，需要將包被抗原進(jìn)行冷凍干燥以得到固體狀態(tài)的多肽。將預(yù)先冷凍好的包被抗原放置于Labconco的冷凍干燥機(jī)上進(jìn)行干燥，得到固體狀態(tài)的包被抗原。包裝后貼上標(biāo)簽。標(biāo)簽上注明多肽的名稱、編號(hào)、生產(chǎn)批號(hào)、濃度、生產(chǎn)日期、保存期限及保存條件。實(shí)施例2、口蹄疫A型結(jié)構(gòu)蛋白VP1抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的制備口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒包括：(1)包被有口蹄疫病毒抗原的96孔可拆聚苯乙烯酶聯(lián)反應(yīng)板；2×96孔。(2)辣根過氧化物酶標(biāo)記的葡萄球菌A蛋白(購(gòu)自abcam公司，貨號(hào)ab7456)，2瓶(各12ml)。(3)陽性對(duì)照血清：是以實(shí)施例1中人工化學(xué)合成的包被抗原作為免疫原，分別免疫25～35日齡無特定病源體豬制備的高免血清，過0.22μm濾膜除菌，作為試劑盒的陽性對(duì)照血清(1管，1.5ml/管)。(4)陰性對(duì)照血清：是用無口蹄疫抗體的正常豬血清，過0.22μm濾膜除菌，作為試劑盒陰性對(duì)照血清(1管，1.5ml/管)。(5)底物顯色液：由兩種溶液混合組成，溶液A為含0.6mg/ml過氧化氫尿素的檸檬酸磷酸鹽緩沖液(1瓶，12ml/瓶)；溶液B為0.2mg/ml的四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶液(1瓶，12ml/瓶)；使用時(shí)兩者以體積比為1:1的比例混合。(6)濃縮洗滌液(20×)：含有0.5％(ml/ml)Tween-20和0.05％(g/ml)疊氮鈉防腐劑的0.01M磷酸鹽緩沖液，pH為7.4，后經(jīng)過0.22μm濾膜除菌(2瓶，50ml/瓶)。(7)終止液：2mol/L的硫酸溶液(1瓶，12ml/瓶)。(8)樣品稀釋液：含有0.5％(g/ml)酪蛋白的0.01M、pH為7.4的PBS緩沖液，過0.22μm濾膜(2瓶，12ml/瓶)。根據(jù)需要，試劑盒中還可以有血清稀釋板(2塊，96孔/塊)，用于血清樣品的稀釋。其中，包被有口蹄疫病毒抗原的96孔可拆聚苯乙烯酶聯(lián)反應(yīng)板的制備方法為：將實(shí)施例1制備的多肽抗原溶于pH9.6的碳酸鹽溶液，然后加到96孔聚苯乙烯酶聯(lián)反應(yīng)板，每孔每肽50ng抗原(其中序列表中序列1所示的多肽與序列表中序列2所示的多肽及序列表中序列3所示的多肽，三種多肽的質(zhì)量比為1:1:1)，在37℃放置2～4h，再4～8℃下放置8h，使多肽抗原與酶聯(lián)反應(yīng)板充分結(jié)合。然后按照300μl/孔濃度加入含1％(g/ml)牛血清白蛋白(BSA)的PBS緩沖液(pH＝7.4)，37℃封閉2～3h，用洗滌緩沖液(濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水20倍稀釋得到洗滌緩沖液)洗滌后甩干，待反應(yīng)板干燥后4℃密封保存。實(shí)施例3、口蹄疫A型病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的符合率試驗(yàn)一、口蹄疫A型結(jié)構(gòu)蛋白VP1抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的使用方法1、平衡：將保存在4℃的試劑盒取出，平衡至室溫備用；液體試劑用前混勻。2、配液：將濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水20倍稀釋得到洗滌緩沖液；3、設(shè)定：2個(gè)陰性對(duì)照孔和2個(gè)陽性對(duì)照孔，其余為待測(cè)樣本孔。4、待測(cè)標(biāo)本預(yù)稀釋：使用樣品稀釋液將待檢樣品血清、陰性對(duì)照血清、陽性對(duì)照血清按照1：20的比例稀釋。5、加樣：2個(gè)陰性對(duì)照孔各加100μl陰性對(duì)照，2個(gè)陽性對(duì)照孔各加100μl陽性對(duì)照；其余孔分別按預(yù)先設(shè)定加100μl稀釋的待測(cè)樣本。加樣時(shí)間跨度應(yīng)盡量短。6、溫育：震蕩混勻，置37℃溫箱或水浴鍋中，反應(yīng)30min。7、洗板：棄去反應(yīng)液，每孔加300μl步驟2中得到的洗滌緩沖液，浸泡15s，甩棄洗滌液。連續(xù)洗板4次后拍干。8、加酶：各孔加100μl辣根過氧化物酶標(biāo)記的葡萄球菌A蛋白。9、溫育：置37℃溫箱或水浴鍋中，反應(yīng)30min。10、洗板：棄去反應(yīng)液，每孔加入稀釋后的洗滌緩沖液300μl，浸泡15s，甩棄洗滌液。連續(xù)洗板4次后拍干。11、顯色：每孔分別加入100μl的底物顯色液(其中溶液A和溶液B以體積比為1：1的比例混合)。加蓋，37℃恒溫箱里反應(yīng)15min；12、每孔分別加入100μl終止液終止反應(yīng)，混勻；13、測(cè)定每孔的OD450值(加終止液的反應(yīng)板應(yīng)在15min內(nèi)讀取OD450值)。檢測(cè)結(jié)果的判定：1、陰性對(duì)照OD450平均值應(yīng)該≤0.15，否則無效。2、陽性對(duì)照每個(gè)檢測(cè)值應(yīng)該在0.9～2.3之間，否則無效。3、臨界值的計(jì)算：牛血清臨界值＝0.15×陽性對(duì)照OD450值平均值豬血清臨界值＝0.18×陽性對(duì)照OD450值平均值待檢血清測(cè)定OD450值≥臨界值者判為陽性；待檢血清測(cè)定OD450值<臨值者判為陰性。二、乳鼠血清中和試驗(yàn)(MSN)方法目前國(guó)內(nèi)常用的口蹄疫血清學(xué)檢測(cè)方法之一是乳鼠中和試驗(yàn)(MSN)，因此用本試劑盒同乳鼠中和試驗(yàn)進(jìn)行符合率試驗(yàn)。材料1.免疫血清，50頭份免疫豬血清(豬口蹄疫滅活疫苗(口蹄疫O型、A型、亞洲I型三價(jià)滅活疫苗，貨號(hào)ABB10601730250)免疫后28天)；50頭份免疫牛血清(牛口蹄疫滅活疫苗(口蹄疫O型、A型、亞洲I型三價(jià)滅活疫苗，貨號(hào)ABB10601730250)免疫后21天)，由中牧實(shí)業(yè)股份有限公司蘭州生物藥廠提供。2.健康豬血清50份、健康牛血清50份，由中牧實(shí)業(yè)股份有限公司蘭州生物藥廠提供。3.試驗(yàn)用病毒為口蹄疫AF/72病毒，毒種由蘭州獸醫(yī)研究所提供，由中牧實(shí)業(yè)股份有限公司蘭州生物藥廠保存和使用，將病毒經(jīng)6～8日齡乳鼠傳2代后，收集病毒。用3～4日齡乳鼠測(cè)定并調(diào)整其毒價(jià)至1000LD50/0.2ml，置于-20℃保存待用。乳鼠血清中和試驗(yàn)方法如下：將血清用PBS作2倍稀釋，取1ml與等量100LD50/ml的AF/72系病毒液混合，于37℃孵育1小時(shí)，然后接種3日齡乳鼠(頸部皮下注射0.2ml)，每組(亦即每個(gè)待檢血清)4只，同時(shí)設(shè)立病毒對(duì)照、健康對(duì)照及標(biāo)準(zhǔn)陽性血清對(duì)照組，每組3只，觀察7d，記錄乳鼠死亡比率并判定結(jié)果，若乳鼠4/4或3/4健活，則待檢血清為陽性(R)，若乳鼠4/4或3/4死亡，則待檢血清為陰性(-)；若乳鼠2/4健活或2/4死亡，則判定結(jié)果可疑(±)，需加倍重復(fù)測(cè)定，重復(fù)試驗(yàn)中，有1組呈陽性，則判定為陽性。敏感性＝判定陽性血清樣本數(shù)/待測(cè)血清樣本數(shù)三、符合率試驗(yàn)結(jié)果：利用實(shí)施例2制備的口蹄疫A型病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒與乳鼠中和試驗(yàn)(MSN)分別檢測(cè)100份豬血清(免疫血清50份，健康血清50份)，100份牛血清(免疫血清50份，健康血清50份)?？谔阋逜型病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒對(duì)豬血清的檢測(cè)結(jié)果見表3。試劑盒的敏感性為98％，而乳鼠血清中和試驗(yàn)的敏感性為92％，在50份免疫豬血清中，兩種方法檢測(cè)結(jié)果一致的為47份。因此，本試劑盒和乳鼠血清中和試驗(yàn)的符合率為94％，因此本試劑盒具有較高的敏感性。對(duì)健康豬血清的測(cè)試兩者的符合率為100％，檢測(cè)結(jié)果均為陰性(見表3)?？谔阋逜型病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒與乳鼠中和試驗(yàn)一共檢測(cè)100份豬血清，其中97份豬血清兩種方法檢測(cè)結(jié)果一致，3份豬血清檢測(cè)結(jié)果有差異，符合率為97％。表3.口蹄疫A型病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒及乳鼠血清中和試驗(yàn)法對(duì)免疫豬血清和健康豬血清的檢測(cè)結(jié)果口蹄疫A型病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒對(duì)牛血清的檢測(cè)結(jié)果見表4。結(jié)果表明，試劑盒的敏感性為98％，而乳鼠血清中和試驗(yàn)的敏感性為94％，在50份免疫牛血清中，兩種方法檢測(cè)結(jié)果一致的為48份，因此，本試劑盒和乳鼠血清中和試驗(yàn)的符合率為96％，因此本試劑盒具有較高的敏感性。對(duì)健康牛血清的測(cè)試兩者的符合率為100％，檢測(cè)結(jié)果均為陰性(見表4)?？谔阋逜型病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒與乳鼠中和試驗(yàn)一共檢測(cè)100份牛血清，其中98份牛血清兩種方法檢測(cè)結(jié)果一致，2份牛血清檢測(cè)結(jié)果有差異，符合率為98％。表4.口蹄疫A型病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒及乳鼠血清中和試驗(yàn)法對(duì)免疫牛血清和健康牛血清的檢測(cè)結(jié)果實(shí)施例4、口蹄疫A型病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的敏感性試驗(yàn)敏感性試驗(yàn)是使用實(shí)施例3中的口蹄疫A型病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒檢測(cè)分別檢測(cè)豬源和牛源血清的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。豬感染血清由中牧實(shí)業(yè)股份有限公司蘭州生物藥廠提供，為豬口蹄疫A型病毒感染血清。豬源免疫血清為豬口蹄疫A型病毒合成肽疫苗(合成肽疫苗的多肽序列為序列表中序列4)免疫后血清，由中牧實(shí)業(yè)股份有限公司蘭州生物藥廠提供。牛感染血清由中牧實(shí)業(yè)股份有限公司蘭州生物藥廠提供，為?？谔阋逜型病毒感染血清。牛源疫苗免疫血清為?？谔阋逜型病毒合成肽疫苗(合成肽疫苗的多肽序列為序列表中序列5)免疫后血清，由中牧實(shí)業(yè)股份有限公司蘭州生物藥廠提供。使用實(shí)施例2制備的三批口蹄疫A型病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)診斷試劑盒(批次ZMAVP001、ZMAVP002、ZMAVP003)，依照實(shí)施例3中口蹄疫A型病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒使用方法分別對(duì)豬、?？谔阋逜型病毒感染血清各200份及豬、?？谔阋逜型病毒合成肽疫苗免疫血清各200份進(jìn)行敏感性試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。使用實(shí)施例2所述的方法制備序列1、序列2和序列3所示的三個(gè)多肽，分別單獨(dú)包被酶標(biāo)板組裝的A型病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒(ZMAVP1-1、ZMAVP1-2、ZMAVP1-3)，依照實(shí)施例3中口蹄疫A型病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒使用方法分別對(duì)豬、?？谔阋逜型病毒感染血清各200份及豬、?？谔阋逜型病毒合成肽疫苗免疫血清各200份進(jìn)行敏感性試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。ZMAVP001試劑盒對(duì)200份感染豬血清檢測(cè)的敏感性為196/200×100％＝98％；對(duì)200份免疫豬血清檢測(cè)的敏感性為198/200×100％＝99％。ZMAVP002試劑盒對(duì)200份感染豬血清檢測(cè)的敏感性為197/200×100％＝98.5％；對(duì)200份免疫豬血清檢測(cè)的敏感性為198/200×100％＝99％。ZMAVP003試劑盒對(duì)200份感染豬血清檢測(cè)的敏感性為197/200×100％＝98.5％；對(duì)200份免疫豬血清檢測(cè)的敏感性為197/200×100％＝98.5％。ZMAVP1-1試劑盒對(duì)200份感染豬血清檢測(cè)的敏感性為193/200×100％＝96.5％；對(duì)200份免疫豬血清檢測(cè)的敏感性為195/200×100％＝97.5％。ZMAVP1-2試劑盒對(duì)200份感染豬血清檢測(cè)的敏感性為194/200×100％＝97％；對(duì)200份免疫豬血清檢測(cè)的敏感性為194/200×100％＝97％。ZMAVP1-3試劑盒對(duì)200份感染豬血清檢測(cè)的敏感性為194/200×100％＝97％；對(duì)200份免疫豬血清檢測(cè)的敏感性為193/200×100％＝96.5％。ZMAVP001試劑盒對(duì)200份感染牛血清檢測(cè)的敏感性為197/200×100％＝98.5％；對(duì)200份免疫牛血清檢測(cè)的敏感性為196/200×100％＝98％。ZMAVP002試劑盒對(duì)200份感染牛血清檢測(cè)的敏感性為197/200×100％＝98.5％；對(duì)200份免疫牛血清檢測(cè)的敏感性為197/200×100％＝98.5％。ZMAVP003試劑盒對(duì)200份感染牛血清檢測(cè)的敏感性為197/200×100％＝98.5％；對(duì)200份免疫牛血清檢測(cè)的敏感性為198/200×100％＝99％。ZMAVP1-1試劑盒對(duì)200份感染牛血清檢測(cè)的敏感性為195/200×100％＝97.5％；對(duì)200份免疫牛血清檢測(cè)的敏感性為194/200×100％＝97％。ZMAVP1-2試劑盒對(duì)200份感染牛血清檢測(cè)的敏感性為194/200×100％＝97％；對(duì)200份免疫牛血清檢測(cè)的敏感性為193/200×100％＝96.5％。ZMAVP1-3試劑盒對(duì)200份感染牛血清檢測(cè)的敏感性為193/200×100％＝96.5％；對(duì)200份免疫牛血清檢測(cè)的敏感性為195/200×100％＝97.5％。表5.口蹄疫A型病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒對(duì)豬、牛血清的敏感性檢測(cè)結(jié)果實(shí)施例5、口蹄疫A型病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的特異性試驗(yàn)使用實(shí)施例4中的三批試劑盒依照實(shí)施例3中所述的口蹄疫A型病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的使用方法對(duì)200份健康豬血清(中牧實(shí)業(yè)股份有限公司保山廠和蘭州生物藥廠提供)、2份豬口蹄疫亞洲Ⅰ型(Asia1)陽性血清(中牧實(shí)業(yè)股份有限公司蘭州生物藥廠提供)、2份豬口蹄疫O型(O)陽性血清(中牧實(shí)業(yè)股份有限公司蘭州生物藥廠提供)、2份豬瘟陽性血清(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)、2份豬水泡病陽性血清(中牧實(shí)業(yè)股份有限公司提供)、2份豬圓環(huán)陽性血清(中牧實(shí)業(yè)股份有限公司提供)和2份豬藍(lán)耳病陽性血清(中牧實(shí)業(yè)股份有限公司提供)分別進(jìn)行檢測(cè)。試劑盒的特異性檢測(cè)結(jié)果如下表(表6)顯示。對(duì)200份健康豬血清的檢測(cè)結(jié)果表明，ZMAVP001試劑盒的特異性為99.0％，ZMAVP002試劑盒的特異性為99.5％，ZMAVP003試劑盒的特異性為99.0％。對(duì)2份豬口蹄疫亞洲Ⅰ型(AsiaⅠ)陽性血清、2份豬口蹄疫O型(O)陽性血清、2份豬瘟陽性血清、2份豬水泡病陽性血清、2份豬圓環(huán)陽性血清和2份豬藍(lán)耳病陽性血清的檢測(cè)結(jié)果均顯示為陰性，因此三個(gè)試劑盒對(duì)這12份豬陽性血清檢測(cè)的特異性均為100％。試劑盒的特異性檢測(cè)結(jié)果如下表(表6)顯示。對(duì)200份健康牛血清的檢測(cè)結(jié)果顯示，ZMAVP001試劑盒的特異性為99.0％，ZMAVP002試劑盒的特異性為99.5％，ZMAVP003試劑盒的特異性為99.5％。對(duì)2份?？谔阋邅喼蔻裥?AsiaⅠ)陽性血清、2份?？谔阋逴型(O)陽性血清、2份牛病毒性腹瀉陽性血清的檢測(cè)結(jié)果均顯示為陰性，因此三個(gè)試劑盒對(duì)這6份牛陽性血清檢測(cè)的特異性均為100％。表6.口蹄疫A型病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒特異性檢測(cè)結(jié)果使用實(shí)施例2所述的方法制備序列1、序列2和序列3所示的三個(gè)多肽，分別單獨(dú)包被酶標(biāo)板組裝的A型病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒(ZMAVP1-1、ZMAVP1-2、ZMAVP1-3)，依照實(shí)施例3中口蹄疫A型病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒使用方法分別對(duì)200份健康豬血清(中牧實(shí)業(yè)股份有限公司保山廠和蘭州生物藥廠提供)、2份豬口蹄疫亞洲Ⅰ型(Asia1)陽性血清(中牧實(shí)業(yè)股份有限公司蘭州生物藥廠提供)、2份豬口蹄疫O型(O)陽性血清(中牧實(shí)業(yè)股份有限公司蘭州生物藥廠提供)、2份豬瘟陽性血清(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)、2份豬水泡病陽性血清(中牧實(shí)業(yè)股份有限公司提供)、2份豬圓環(huán)陽性血清(中牧實(shí)業(yè)股份有限公司提供)和2份豬藍(lán)耳病陽性血清(中牧實(shí)業(yè)股份有限公司提供)分別進(jìn)行檢測(cè)。試劑盒的特異性檢測(cè)結(jié)果如下表(表7)顯示。對(duì)200份健康豬血清的檢測(cè)結(jié)果表明，ZMAVP1-1試劑盒的特異性為97.0％，ZMAVP1-2試劑盒的特異性為98.5％，ZMAVP1-3試劑盒的特異性為98.0％。對(duì)2份豬口蹄疫亞洲Ⅰ型(AsiaⅠ)陽性血清、2份豬口蹄疫O型(O)陽性血清、2份豬瘟陽性血清、2份豬水泡病陽性血清、2份豬圓環(huán)陽性血清和2份豬藍(lán)耳病陽性血清的檢測(cè)結(jié)果均顯示為陰性，因此三個(gè)試劑盒對(duì)這12份豬陽性血清檢測(cè)的特異性均為100％。試劑盒的特異性檢測(cè)結(jié)果如下表(表7)顯示。對(duì)200份健康牛血清的檢測(cè)結(jié)果顯示，ZMAVP1-1試劑盒的特異性為98.0％，ZMAVP1-2試劑盒的特異性為97.5％，ZMAVP1-3試劑盒的特異性為97.5％。對(duì)2份?？谔阋邅喼蔻裥?AsiaⅠ)陽性血清、2份牛口蹄疫O型(O)陽性血清、2份牛病毒性腹瀉陽性血清的檢測(cè)結(jié)果均顯示為陰性，因此三個(gè)試劑盒對(duì)這6份牛陽性血清檢測(cè)的特異性均為100％。表7.單獨(dú)肽特異性檢測(cè)結(jié)果當(dāng)前第1頁1 2 3