本發(fā)明屬于多肽藥物制備方法技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種特異性微波合成制備醋酸戈那瑞林的方法。

背景技術(shù)：

中文名稱：醋酸戈那瑞林，英文名稱：cetrorelix Acetate，

結(jié)構(gòu)式：Ac-D-2-Nal-D-Cpa-D-3-Pal-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2，

分子式：C70H92N17O14Cl，分子量：1431.06

醋酸戈那瑞林是一種有效的黃體酮釋放激素抑制素受體拮抗劑，用于控制卵巢的刺激作用，來預(yù)防不成熟卵泡的過早排出，幫助受孕。由于醋酸戈那瑞林的自身物理性質(zhì)易被胃腸道中的酵素分解破壞，不能通過口服使用，因此常作注射用戈那瑞林制劑，通過皮下或肌肉注射吸收，迅速發(fā)揮作用。醋酸戈那瑞林對(duì)卵巢癌、前列腺癌、子宮纖維瘤、子宮內(nèi)膜異位等疾病有較好的療效，而且對(duì)良性前列腺肥大和卵巢過度刺激綜合征有預(yù)防和改善作用。

目前市場(chǎng)上的戈那瑞林制備方法，多采用了液相合成法，這些方法中都用到了毒性較大的如吡啶、氨水等試劑，若用于戈那瑞林的大量制備，定會(huì)長(zhǎng)期接觸此類試劑，對(duì)人身體傷害較大；在專利CN 105646671 A中公開了一種戈那瑞林的純化方法，該專利的純化過程較復(fù)雜，須對(duì)樣品進(jìn)行多次純化，且需要對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行減壓旋蒸濃縮，工序較多，各個(gè)反應(yīng)中的取樣不便，不利于快速大規(guī)模的生產(chǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種純化率高、副產(chǎn)物少且工序操作簡(jiǎn)單的特異性微波合成制備醋酸戈那瑞林的方法，具體通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

特異性微波合成制備醋酸戈那瑞林的方法，包括以下步驟：

步驟一：以Fmoc-D-Ala-Wang Resin氨基樹脂為起始樹脂載體，依次與活化的保護(hù)氨基酸溶液于恒溫震蕩器中反應(yīng)，通過固相合成法的縮合反應(yīng)接入相對(duì)應(yīng)的保護(hù)氨基酸，得到戈那瑞林前體肽Ⅰ-氨基樹脂：

Fmoc-D-Nal-D-Cpa-D-Pal-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-氨基樹脂；

步驟二：對(duì)戈那瑞林前體肽Ⅰ-氨基樹脂脫掉D-Nal保護(hù)基，進(jìn)行N端的乙酰化反應(yīng)，得到戈那瑞林中間體肽Ⅱ-氨基樹脂：

Ac-D-Nal-D-Cpa-D-Pal-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-氨基樹脂；

步驟三：對(duì)戈那瑞林中間體肽Ⅱ-氨基樹脂進(jìn)行脫保護(hù)并洗滌，進(jìn)行切割反應(yīng)，沉降后，得到戈那瑞林粗肽Ⅲ：

Ac-D-Nal-D-Cpa-D-Pal-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2

步驟四：將戈那瑞林粗品Ⅲ溶解并過濾，采用反相高效液相色譜法制備純化，收集目標(biāo)樣品并凍干得到戈那瑞林多肽；將戈那瑞林多肽用醋酸溶解，室溫下加入到強(qiáng)陰離子交換樹脂中攪拌吸附，取出吸附液補(bǔ)加醋酸，凍干后得醋酸戈那瑞。

所述步驟一中的縮合反應(yīng)時(shí)間為20-30min，縮合反應(yīng)后加入0.5ml DIEA，再利用微波進(jìn)行戈那瑞林粗品Ⅰ-氨基樹脂的合成反應(yīng)，微波合成反應(yīng)時(shí)間為20-30s。

將保護(hù)氨基酸依次和HOBT放入離心管中，并加入20％Pip或DMF試劑，得到混合試液；向混合試液溶液中滴加DIEA，混合均勻后即得到所述的活化的保護(hù)氨基酸溶液；其中，HBTU為縮合劑，DIEA為活化試劑，20％Pip或DMF溶液為脫保護(hù)試劑，進(jìn)行與氨基樹脂的連續(xù)縮合反應(yīng)。

所述的Fmoc-D-Ala-Wang Resin氨基樹脂的取代度為0.3mmol/g。

反相高效液相色譜法制備純化的條件為：5um C18制備柱，流動(dòng)相為A：0.1％乙酸/水，B：0.1％乙酸/乙腈，流速9ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)214nm，洗脫梯度為B.Cone/％：2-55，時(shí)間梯度為0.01-30min。

步驟二中的乙?；磻?yīng)的試劑是以體積比為醋酐：DIEA：DMF＝1:1:4配置的混合溶液，反應(yīng)液體積為反應(yīng)器容積的1/3-1/2。

切割反應(yīng)的切割試劑為TFA、茴香硫醚、EDT和水的混合液，反應(yīng)溫度為20℃，切割反應(yīng)的用量為1g樹脂8ml切割試劑，樹脂切割兩次，對(duì)反應(yīng)后含有戈那瑞林粗肽Ⅲ的溶液用-20℃低溫預(yù)冷的無水乙醚進(jìn)行離心沉降。

對(duì)步驟一中的Fmoc-D-Ala-Wang Resin氨基樹脂以及步驟三中戈那瑞林中間體肽Ⅱ-氨基樹脂均進(jìn)行脫保護(hù)并洗滌。

脫保護(hù)并洗滌步驟如下：用真空泵將反應(yīng)器中的脫保護(hù)溶液抽干，然后加入1/3-1/2反應(yīng)器體積的DMF溶液，置于30r/min的脫色搖床上搖1min，抽干反應(yīng)器中溶液再加入DMF洗滌，重復(fù)操作3次。

固相合成法依次縮合的保護(hù)氨基酸為：Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Cit-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-D-Ala(3-pyridyl)-OH、Fmoc-D-Phe(4-Cl)-OH、Fmoc-D-2-Nal-OH。

本發(fā)明的有益技術(shù)效果：

本發(fā)明利用Fmoc固相合成原理，開發(fā)了固相高效合成技術(shù)，采用常見易得、低成本的原料試劑來合成制備，通過工藝優(yōu)化以及微波反應(yīng)技術(shù)處理，在工序操作簡(jiǎn)單化的同時(shí)，戈那瑞林粗品收率高達(dá)92％，其純品得率達(dá)到40％，大大提高了戈那瑞林的得率；

本發(fā)明還采用強(qiáng)陰離子交換樹脂-醋酸轉(zhuǎn)鹽技術(shù)處理戈那瑞林純品，大大降低了純品中三氟醋酸的含量，徹底清除了三氟醋酸對(duì)生物體的毒性，避免了因長(zhǎng)期接觸此類試劑對(duì)人身體造成的傷害。

本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)過程取樣方便，易于中控，并且合成周期短，生產(chǎn)成本低，副產(chǎn)物少，產(chǎn)品收率高，利于快速地大規(guī)模生產(chǎn)。

具體實(shí)施方式

為了便于本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。

實(shí)施例1：一種特異性微波合成制備醋酸戈那瑞林的方法，操作步驟如下：

(1)：氨基樹脂的溶脹

稱量取代度為0.3mmol/g的Fmoc-D-Ala-Wang Resin氨基樹脂0.2g，從開口端加入至多肽合成反應(yīng)器中，取DCM試劑加入至反應(yīng)器中，使樹脂完全浸沒在DCM溶劑中，與溶劑充分接觸，溶脹2h；

用真空泵將反應(yīng)器中的脫保護(hù)溶液抽干，然后加入1/3反應(yīng)器體積的DMF溶液，置于30r/min的脫色搖床上搖1min，抽干反應(yīng)器中溶液再加入DMF洗滌，重復(fù)操作3次，使用茚三酮顯色檢測(cè)，合格后得到目標(biāo)氨基樹脂；

(2)：保護(hù)氨基酸的制備

依次將保護(hù)氨基酸和HOBT放入離心管中，并加入DMF試劑，得到混合試液；向混合試液溶液中滴加DIEA，混合均勻后即得到所述的活化的保護(hù)氨基酸溶液；

保護(hù)氨基酸從樹脂端起算第1-9個(gè)氨基酸相對(duì)應(yīng)的保護(hù)氨基酸及分子量如下表所示：

以Fmoc-Pro-D-Ala-氨基樹脂為例，按照料量稱取30mg Fmoc-Pro-OH和40mgHBTU于離心管中，加入2ml DMF將其溶解，再取10ul DIEA加入離心管中，混合均勻得到活化的保護(hù)氨基酸溶液；

(3)：戈那瑞林樹脂I的合成

將上述活化的保護(hù)氨基酸溶液加到抽干的反應(yīng)器中，保護(hù)氨基酸的投料量為所投氨基樹脂摩爾數(shù)的1.5倍，再將反應(yīng)器置于25℃的恒溫震蕩器中反應(yīng)25min，微波合成20s。采用上述同樣方法，依次縮合第2-9個(gè)Fmoc-保護(hù)氨基酸，即得到戈那瑞林前體肽Ⅰ-氨基樹脂：

Fmoc-D-Nal-D-Cpa-D-Pal-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-氨基樹脂。

(4)：戈那瑞林樹脂II的制備

對(duì)戈那瑞林前體肽Ⅰ-氨基樹脂脫掉D-Nal保護(hù)基，進(jìn)行N端的乙?；磻?yīng)，乙酰化反應(yīng)的試劑為體積比是醋酐：DIEA：DMF＝1:1:4配置的混合溶液，反應(yīng)液體積為反應(yīng)器容積的1/3，反應(yīng)后得到戈那瑞林中間體肽Ⅱ-氨基樹脂：

Ac-D-Nal-D-Cpa-D-Pal-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-氨基樹脂；

(5)：戈那瑞林粗肽Ⅲ的制備

用真空泵將反應(yīng)器中的脫保護(hù)溶液抽干，然后加入1/3反應(yīng)器體積的DMF溶液，置于30r/min的脫色搖床上搖1min，抽干反應(yīng)器中溶液再加入DMF洗滌，重復(fù)操作3次。

將反應(yīng)器中的樹脂溶液抽干，得到乳膠狀的戈那瑞林中間體肽Ⅱ-氨基樹脂，配置切割反應(yīng)的切割試劑100ml，配方為:88ml TFA+5ml茴香硫醚+5ml水+2mlEDT，切割反應(yīng)溫度為20℃，并用-20℃低溫預(yù)冷的無水乙醚進(jìn)行多肽粗品的沉降，得到戈那瑞林粗肽Ⅲ：

Ac-D-Nal-D-Cpa-D-Pal-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2

(6)：戈那瑞林粗肽的粗品收率

切割沉降后的粗品呈乳膠狀態(tài)，其中含有較多的TFA鹽和切割試劑，采用反相高效液相色譜法進(jìn)行除鹽，制備條件為：5um C18制備柱，流動(dòng)相為A：0.1％乙酸/水，B：0.1％乙酸/乙腈，流速9ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)214nm，按照如下程序進(jìn)樣分析：

稱量?jī)龈珊蟮哪繕?biāo)樣品，質(zhì)量為68.8mg，經(jīng)計(jì)算粗品收率為91.8％，比現(xiàn)有技術(shù)僅60-70％的收率有大幅度提高。

(7)：醋酸戈那瑞林的制備

將戈那瑞林粗肽用1％醋酸溶解，加入到強(qiáng)陰離子交換樹脂中室溫?cái)嚢栉?h，取出吸附液補(bǔ)加醋酸含量到5％送凍干，經(jīng)稱量得到醋酸戈那瑞林純品31.2mg，純度達(dá)到99.613％，純品收率為41.2％；分別稱取轉(zhuǎn)鹽前后的戈那瑞林多肽各1mg，按藥典方法測(cè)定醋酸含量，轉(zhuǎn)鹽前醋酸含量為1.56％，轉(zhuǎn)鹽后醋酸含量為6.9％，符合藥典要求(醋酸含量范圍4％-8％)，目標(biāo)物醋酸戈那瑞林產(chǎn)品合格。

實(shí)施例2

本發(fā)明進(jìn)行了戈那瑞林制備方法收率的對(duì)比實(shí)驗(yàn)，即縮合反應(yīng)①正常縮合反應(yīng)25min后洗滌②正?？s合反應(yīng)20min后，分別加0.5ml DIEA，微波氨基樹脂25s后洗滌；經(jīng)過上述實(shí)驗(yàn)方法合成得到的戈那瑞林粗品的收率為①82.7％、②91.8％，經(jīng)純化、轉(zhuǎn)鹽制備得到醋酸戈那瑞林純品①24.1mg、②31.5mg，純品收率為①31.8％、②41.2％。

實(shí)施例3

本發(fā)明進(jìn)行了二次重復(fù)合成，以確定實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性，縮合反應(yīng)①正?？s合反應(yīng)25min后洗滌②正?？s合反應(yīng)22min后，分別加0.5ml DIEA，微波氨基樹脂25s后洗滌；經(jīng)過上述實(shí)驗(yàn)方法得到戈那瑞林粗品收率為①83.1％、②92.4％，經(jīng)純化、轉(zhuǎn)鹽制備得到醋酸戈那瑞林純品①24.3mg、②31.3mg，純品收率為①32.4％、②40.7％；證實(shí)本發(fā)明實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的正確性和穩(wěn)定性。

經(jīng)上述實(shí)施例2和例3實(shí)驗(yàn)，得出在正常合成后再微波反應(yīng)，制備得到的醋酸戈那瑞林純品的收率更高，效果較佳。

其中，實(shí)施例中所使用的英文縮寫含義如下：Fmoc:芴甲氧羰基、3-pyridyl-D-Ala:3-D-苯丙氨酸、DMF:N,N-二甲基甲酰胺。D-Cit:D-瓜氨酸、pbf:2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰、D-2-Nal:D-2-萘基丙氨酸、Pip:六氫吡啶、TFA:三氟醋酸、tBu:叔丁基、DIC:N,N-二異丙基碳化二亞胺、DIEA:N,N-二異丙基乙胺、HOBt:1-羥基苯并三唑。

以上內(nèi)容僅僅是對(duì)本發(fā)明所作的舉例和說明，所屬本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)所描述的具體實(shí)施例做各種各樣的修改或補(bǔ)充或采用類似的方式替代，只要不偏離發(fā)明或者超越本權(quán)利要求書所定義的范圍，均應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。