本發(fā)明涉及動(dòng)物疫苗領(lǐng)域，更特別地，涉及一種分離純化高純度豬圓環(huán)病毒Cap蛋白的層析方法。

背景技術(shù)：

豬圓環(huán)病毒是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning multsystemic wasting syndrome，PMWS)的病原，該病毒可引起斷奶仔豬發(fā)生進(jìn)行性消瘦、咳嗽、呼吸困難、腹瀉、皮膚蒼白或者黃染、淋巴結(jié)腫大、腎臟灰白水腫等癥狀。同時(shí)該病毒還會(huì)造成一定程度上的的免疫抑制，容易造成其它疾病的繼發(fā)或并發(fā)感染。自1991年加拿大首次發(fā)現(xiàn)臨床豬圓環(huán)病毒以來(lái)，該病已給全世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

豬圓環(huán)病毒Cap蛋白是豬圓環(huán)病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，可自我裝配成病毒性粒子，并含有可中和病毒的抗原表位，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的抗體反應(yīng)并獲得免疫保護(hù)，是設(shè)計(jì)動(dòng)物疫苗的首選目標(biāo)基因。已有昆蟲桿狀病毒表達(dá)豬圓環(huán)病毒Cap蛋白制備的基因工程亞單位疫苗實(shí)現(xiàn)商業(yè)化應(yīng)用，但是，大部分動(dòng)物疫苗都是滅活、減毒或無(wú)毒的病原體疫苗(第一代動(dòng)物疫苗)，滅活、減毒或無(wú)毒的病原體疫苗因?yàn)闅埩舸罅康牟≡w及其碎片、HCP、DNA片段而導(dǎo)致免疫后動(dòng)物出現(xiàn)不同程度的不良反應(yīng)，而且其免疫原性和反應(yīng)原性較低。

為了克服不良反應(yīng)的問(wèn)題，研究者嘗試采用基因改造、更換表達(dá)系統(tǒng)、添加蛋白標(biāo)簽來(lái)提高產(chǎn)量、純度，從側(cè)面降低副反應(yīng)。而這些方式所達(dá)到的效果均不顯著，并且這些方法涉及到生產(chǎn)工藝的變更，疫苗免疫原性和反應(yīng)原性也可能有不同程度的降低。

因此，需要一種分離純化豬圓環(huán)病毒Cap蛋白以制作高純度的動(dòng)物疫苗的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決以上問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種分離純化高純度豬圓環(huán)病毒Cap蛋白的層析方法，包括以下步驟：

S1：將表達(dá)豬圓環(huán)病毒Cap蛋白的昆蟲細(xì)胞破碎離心后，取上清用孔徑為0.45μm的濾膜過(guò)濾，得到包含豬圓環(huán)病毒Cap蛋白的原樣品液；

S2：使所述原樣品液經(jīng)歷弱陰離子交換層析，得到去除了DNA和部分宿主細(xì)胞蛋白的第一純化液；

S3：使所述第一純化液經(jīng)歷強(qiáng)陽(yáng)離子交換層析，得到去除了色素和部分宿主細(xì)胞蛋白并且所述豬圓環(huán)病毒Cap蛋白被濃縮的第二純化液；

S4：使所述第二純化液經(jīng)歷凝膠過(guò)濾層析，得到高純度豬圓環(huán)病毒Cap蛋白溶液。

進(jìn)一步地，在S2中，所述弱陰離子交換層析使用的填料為匯瓊離DEAE-6FF，并且使用的溶液包括第一平衡液、洗雜液和第一洗脫液，所述第一平衡液、洗雜液均為含有0.1M NaCl的pH值為6.8的20mM磷酸鹽緩沖液，所述第一洗脫液為含有1.0M NaCl的pH值為6.8的20mM磷酸鹽緩沖液。

進(jìn)一步地，在S3中，所述強(qiáng)陽(yáng)離子交換層析使用的填料為匯瓊離SP-HPR，并且使用的溶液包括第一平衡、洗雜液和第二洗脫液，所述第一平衡、洗雜液均為含有0.1M NaCl的pH值為6.8的20mM磷酸鹽緩沖液，所述第二洗脫液為含有0.5M NaCl的pH值為6.8的20mM磷酸鹽緩沖液。

進(jìn)一步地，在S4中，所述凝膠過(guò)濾層析使用的填料為匯瓊凝G25，并且使用的溶液包括第二平衡、第三洗脫液，所述第二平衡、第三洗脫液均為含有0.15M NaCl的pH值為7.0的20mM磷酸鹽緩沖液。

進(jìn)一步地，所述方法包括以下步驟：

S1：將表達(dá)豬圓環(huán)病毒Cap蛋白的昆蟲細(xì)胞破碎離心后，取上清用孔徑為0.45μm的濾膜過(guò)濾，得到包含豬圓環(huán)病毒Cap蛋白的原樣品液；

S2：取10ml所述第一平衡液以1.0ml/min的流速平衡裝有填料匯瓊離DEAE-6FF 1ml的柱子后標(biāo)定此時(shí)在280nm處的吸光度值A(chǔ)₂₈₀為零點(diǎn)，使所述原樣品液以1.0ml/min的流速加載至所述裝有填料匯瓊離DEAE-6FF1ml的柱子中，監(jiān)測(cè)從所述裝有填料匯瓊離DEAE-6FF 1ml的柱子的出液口流出的液體的在280nm處的吸光度值A(chǔ)₂₈₀，當(dāng)A₂₈₀出現(xiàn)上升后開始收集流出液體；用15ml所述洗雜液1.0ml/min的流速流經(jīng)所述裝有填料匯瓊離DEAE-6FF 1ml的柱子，A₂₈₀回歸到零點(diǎn)時(shí)停止收集流出液體；用20ml所述第一洗脫液1.0ml/min流速流經(jīng)所述裝有填料匯瓊離DEAE-6FF 1ml的柱子，檢測(cè)A₂₈₀，當(dāng)A₂₈₀開始上升時(shí)收集從出液口流出的的洗脫液，待A₂₈₀回到零點(diǎn)時(shí)停止收集，所收集的液體即為所述第一純化液；所述零點(diǎn)為在本步驟中平衡后從出液口流出的液體的A280值；

S3：取10ml所述第一平衡以1.0ml/min的流速平衡裝有填料匯瓊離SP-HPR 1ml的柱子后標(biāo)定此時(shí)在280nm處的吸光度值A(chǔ)₂₈₀為零點(diǎn)，將S2中收集所述第一純化液以1.0ml/min的流速加載至所述裝有填料匯瓊離SP-HPR 1ml的柱子中，監(jiān)測(cè)從所述裝有填料匯瓊離SP-HPR 1ml的柱子的出液口流出的液體的在280nm處的吸光度值A(chǔ)₂₈₀，當(dāng)A₂₈₀出現(xiàn)上升后開始收集流出液體；用15ml所述洗雜液1.0ml/min的流速流經(jīng)所述裝有填料匯瓊離SP-HPR 1ml的柱子，A₂₈₀回歸到零點(diǎn)時(shí)停止收集流出液體；用20ml所述第二洗脫液1.0ml/min流速流經(jīng)所述裝有填料匯瓊離SP-HPR的柱子，檢測(cè)A₂₈₀，當(dāng)A₂₈₀出現(xiàn)上升后收集從出液口流出的洗脫液，待A₂₈₀回到零點(diǎn)時(shí)停止收集,所收集的液體即為所述第二純化液；所述零點(diǎn)為在本步驟中平衡后從出液口流出的液體的A₂₈₀值；

S4：取10ml所述第二平衡以5.0ml/min的流速平衡裝有填料匯瓊凝G25 5ml的柱子后標(biāo)定此時(shí)在280nm處的吸光度值A(chǔ)₂₈₀為零點(diǎn)，從S3中收集所述第二純化液中取1.5ml以5.0ml/min的流速加載至所述裝有填料匯瓊凝G25 5ml的柱子中，監(jiān)測(cè)從所述裝有填料匯瓊凝G25 5ml的柱子的出液口流出的液體的在280nm處的吸光度值A(chǔ)₂₈₀；用10ml所述第三洗脫液5.0ml/min流速流經(jīng)所述裝有填料匯瓊凝G25 5ml的柱子，監(jiān)測(cè)A₂₈₀，當(dāng)A₂₈₀出現(xiàn)上升后收集從出液口流出的洗脫液，待A₂₈₀回到零點(diǎn)時(shí)停止收集，所收集的液體即為高純度的豬圓環(huán)病毒Cap蛋白溶液；所述零點(diǎn)為在本步驟中平衡后從出液口流出的液體的A₂₈₀值。

通過(guò)使用本發(fā)明的方法可去除從表達(dá)豬圓環(huán)病毒Cap蛋白的昆蟲細(xì)胞得到的粗原樣品液中的DNA、色素、宿主細(xì)胞蛋白，并且將豬圓環(huán)病毒Cap蛋白大大濃縮，從而得到高濃度高純度的豬圓環(huán)病毒Cap蛋白，有利于提高Cap蛋白的免疫原性和反應(yīng)原性，且降低副作用。

附圖說(shuō)明

圖1為原樣品液流經(jīng)匯瓊離DEAE-6FF 1ml柱子時(shí)的A₂₈₀圖譜；

圖2為第一純化液流經(jīng)匯瓊離SP-HPR 1ml柱子時(shí)的A²⁸⁰圖譜；

圖3為第二純化液流經(jīng)匯瓊凝G25 5ml柱子時(shí)的A₂₈₀圖譜；

圖4為使用本發(fā)明的方法純化前的原樣品液和純化過(guò)程中收集的液體的SDS-PAGE膠電泳照片，圖中各泳道的上載的樣品如下：1、原樣品液，2、Maker，3、上樣15ml的流穿液，4、上樣30ml的流穿液，5、洗雜后的液體，6、洗脫后的液體；7、第一純化液，8、上樣15ml的流穿液，9、上樣30ml的流穿液，10、洗雜后的液體，11、洗脫后的液體，其中泳道1、3-6為過(guò)SP-HPR柱子的樣液，泳道7-11為過(guò)SP-HPR柱子的樣液。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。

1.匯瓊離DEAE-6FF 1ml柱子純化

具體工藝如下：

溶液配制

第一平衡液：20mM PB、0.1M NaCl，pH 6.8

洗雜液：20mM PB、0.1M NaCl，pH 6.8

第一洗脫液：20mM PB、1.0M NaCl，pH 8.0

第一清洗液：1.0M NaOH

裝柱

取沉降后的匯瓊離DEAE-6FF 1.5g加入到12ml重力柱中，用10ml純化水重懸后靜置至純化水流干，再用10ml純化水重懸后靜置至純化水流干。

稱取上述清洗后的匯瓊離DEAE-6FF 1.2g，用5ml純化水重懸后用一次性吸管加入到1.2ml空柱中，靜置2小時(shí)后壓入上堵頭。

樣品處理

取20ml樣液，在11500rpm離心30分鐘，取上清；將上清液用0.45μm濾膜過(guò)濾。

平衡

用10ml第一平衡液以1.0ml/min流速平衡柱子，平衡完成后標(biāo)定此時(shí)280nm處吸光值為零點(diǎn)。

上樣

將20ml處理后的樣液以1.0ml/min流速上樣，當(dāng)吸光值(A₂₈₀)出現(xiàn)上升后收集流穿液。

洗雜

用15ml洗雜液以1.0ml/min流速?zèng)_洗柱子，待吸光值(A₂₈₀)回歸到零點(diǎn)后停止收集。

洗脫

用20ml洗脫液以1.0ml/min流速進(jìn)行洗脫，當(dāng)吸光值(A₂₈₀)出現(xiàn)上升后收集洗脫液，待吸光值(A₂₈₀)回歸到零點(diǎn)后停止收集。

清洗(用于填料的清洗和再生，用于恢復(fù)填料使用時(shí)的最佳性能)

用20ml純化水以1.0ml/min流速清洗柱子，再用20ml第一清洗液以0.5ml/min流速進(jìn)行清洗，最后用純化水以1.0ml/min流速?zèng)_洗柱子直至流穿液中pH至中性。

匯瓊離DEAE-6FF 1ml柱子純化圖譜如圖1所示。

2.匯瓊離SP-HPR 1ml柱子純化

溶液配制

第一平衡液：20mM PB、0.1M NaCl，pH 6.8

洗雜液：20mM PB、0.1M NaCl，pH 6.8

第二洗脫液：20mM PB、0.5M NaCl，pH 6.8

第一清洗液：1.0M NaOH

裝柱

取沉降后的匯瓊離SP-HPR 1.5g加入到12ml重力柱中，用10ml純化水重懸后靜置至純化水流干，再用10ml純化水重懸后靜置至純化水流干。

稱取上述清洗后的匯瓊離SP-HPR 1.2g，用5ml純化水重懸后用一次性吸管加入到1.2ml空柱中，靜置2小時(shí)后壓入上堵頭。

樣品處理

將匯瓊離DEAE-6FF 1ml柱子純化后的第一純化液用0.45μm濾膜過(guò)濾。

平衡

用10ml第一平衡液以1.0ml/min流速平衡柱子，平衡完成后標(biāo)定此時(shí)280nm處吸光值為零點(diǎn)。

上樣

將匯瓊離DEAE-6FF 1ml柱子純化后的第一純化液經(jīng)過(guò)以1.0ml/min流速上樣，當(dāng)吸光值(A₂₈₀)出現(xiàn)上升后收集流穿液。

洗雜

用15ml平衡液以1.0ml/min流速?zèng)_洗柱子，待吸光值(A₂₈₀)回歸到零點(diǎn)后停止收集。

洗脫

用20ml洗脫液以1.0ml/min流速進(jìn)行洗脫，當(dāng)吸光值(A₂₈₀)出現(xiàn)上升后收集洗脫液，待吸光值(A₂₈₀)回歸到零點(diǎn)后停止收集。

清洗(用于填料的清洗和再生，用于恢復(fù)填料使用時(shí)的最佳性能)

用20ml純化水以1.0ml/min流速清洗柱子，再用20ml第一清洗液以0.5ml/min流速進(jìn)行清洗，最后用純化水以1.0ml/min流速?zèng)_洗柱子直至流穿液中pH至中性。

匯瓊離SP-HPR 1ml柱子純化圖譜如圖2所示。

3.匯瓊凝G25 5ml柱子純化

溶液配制

第二平衡液：20mM PB、0.15M NaCl，pH 7.0

第三洗脫液：20mM PB、0.15M NaCl，pH 7.0

第二清洗液：0.5M NaOH

裝柱

取沉降后的匯瓊凝G25 7.5g加入到30ml重力柱中，用25ml純化水重懸后靜置至純化水流干，再用25ml純化水重懸后靜置至純化水流干。

稱取上述清洗后的匯瓊凝G25 5.8g，用10ml純化水重懸后用一次性吸管加入到5.0ml空柱中，靜置2小時(shí)后壓入上堵頭。

樣品處理

將匯瓊離SP-HPR 1ml純化中的第二純化液用0.45μm濾膜過(guò)濾。

平衡

用10ml第二平衡液以5.0ml/min流速平衡柱子，平衡完成后標(biāo)定此時(shí)280nm處吸光值為零點(diǎn)。

上樣

取1.5ml處理后的樣液，以5.0ml/min流速上樣。

洗脫

用10ml第三洗脫液以5.0ml/min流速進(jìn)行洗脫，當(dāng)吸光值(A₂₈₀)出現(xiàn)上升后收集洗脫液，待吸光值(A₂₈₀)回歸到零點(diǎn)后停止收集。所收集的洗脫液即高濃度的高純度豬圓環(huán)病毒Cap蛋白溶液。

清洗

用15ml純化水以5.0ml/min流速清洗柱子，再用15ml清洗液以0.5ml/min流速進(jìn)行清洗，最后用純化水以5.0ml/min流速?zèng)_洗柱子直至流穿液中pH至中性。

匯瓊凝G25 5ml柱子純化如圖3所示。

使用SDS-PAGE膠電泳檢測(cè)本發(fā)明的方法純化前的原樣品液和純化過(guò)程中收集的液體中的蛋白質(zhì)純度，結(jié)果如圖4所示，原本富含DNA、色素、宿主細(xì)胞蛋白的樣品溶液經(jīng)過(guò)匯瓊離DEAE-6FF 1ml柱子、匯瓊離SP-HPR 1ml柱子純化后，DNA、色素和雜質(zhì)蛋白都被基本消除了，提高了豬圓環(huán)病毒Cap蛋白的純度，同時(shí)還提高了豬圓環(huán)病毒Cap蛋白的濃度。此外，通過(guò)和匯瓊凝G25 5ml柱子純化后，電導(dǎo)率降低，說(shuō)明將高鹽緩沖液置換成了低鹽緩沖液，并且去除了一些小分子雜質(zhì)。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。