本發(fā)明屬于生物應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種乙型肝炎病毒表面抗原檢測試紙的制備方法。
背景技術(shù)：
乙型肝炎病毒簡稱乙肝病毒，是一種DNA病毒，屬于嗜肝DNA病毒科。根據(jù)目前所知，乙型肝炎病毒就只對人和猩猩有易感性，引發(fā)乙型病毒性肝炎疾病，其是傳染性疾病，不是遺傳病。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計資料顯示，在全球范圍內(nèi)，大約有二十多億的人為乙肝病毒攜帶者，約占全世界總?cè)丝诘陌俜种笥?，是全世界范圍?nèi)感染人數(shù)最多的一種慢性傳染性疾病。因其傳染性疾病的性質(zhì)，患病者在婚情、入學(xué)、就業(yè)、社交等多種與人交往的活動中受到不同程度的歧視，同時其對人類健康有非常大的影響，因此受到人們的重視。
乙型病毒型肝炎的致病菌的重要血清學(xué)標志物為乙肝病毒表面抗原。乙肝表面抗原是健康查體必查項目。在臨床檢測中，乙肝病毒表面抗原測定是判斷乙型病毒性肝炎病毒攜帶者或乙型病毒性肝炎患者的病情判斷和臨床狀況分析的重要臨床參考指標，乙型病毒性肝炎病毒的測定不僅對乙型肝炎的診斷和評價具有重要的臨床意義，同時，為有效阻斷乙型病毒性肝炎在人群間的廣泛傳播起到非常重要的作用。
在臨床檢測過程中，目前用于檢測乙型病毒性肝炎表面抗原的方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、膠體金免疫層析法（Colloidal gold immunochromatographic assay，GICA）、時間分辨熒光免疫法（Time resolved fluoroisnmuno assay，TRFIA）以及微粒子酶免疫分析法（Microparticle enzyme immunoassay，MEIA)和化學(xué)發(fā)光免疫分析法（Immunochemiluminometry assay，CLIA）等不同方式和不同作用原理的檢測方式?，F(xiàn)有的乙型病毒性肝炎表面抗原的檢測方法存在一些缺點，有的檢測方法得到結(jié)果的時間長，需要長時間等待，有的檢測方法需要借助儀器，有的檢測方法步驟繁瑣，不能進行批量檢測，這些檢測方法不容易在基層門診進行推廣應(yīng)用。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明主要解決的技術(shù)問題是提供一種乙型肝炎病毒表面抗原檢測試紙的制備方法，該制備方法得到的檢測試紙適用于急診或者手術(shù)前急查HBV病毒的定性檢查，診斷快速且結(jié)果準確，可單份或成批測定，不需任何儀器，是一種較好的快速初篩普查方法，適合于廣大基層門診推廣。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的一個技術(shù)方案是：提供一種乙型肝炎病毒表面抗原檢測試紙的制備方法，包括步驟為：
（1）制備重懸液：所述重懸液中包括聚乙烯吡咯烷酮PVP、蔗糖、海藻糖、牛血清白蛋白和三羥甲基氨基甲烷，將聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、海藻糖、牛血清白蛋白和三羥甲基氨基甲烷溶于水并定容，調(diào)節(jié)pH值至8-9，得到重懸液；制備包被基液：所述包被基液中包括海藻糖，用海藻糖溶于0.01M，pH值為7-8的磷酸緩沖溶液PB，得到包被基液；
（2）向膠體金中加入碳酸鉀，調(diào)節(jié)pH，再依次加入抗乙型肝炎病毒表面抗原單克隆抗體（標記抗體）、牛血清白蛋白溶液混合，離心得到沉淀，所述沉淀用步驟（1）制備的重懸液重懸得到用抗乙型肝炎病毒表面抗原單克隆抗體（標記抗體）標記的免疫金；
（3）用步驟（1）制備的包被基液、無水乙醇稀釋抗乙型肝炎病毒表面抗原單克隆抗體（包被抗體）得到檢測線包被液，用步驟（1）制備的包被基液稀釋羊抗鼠IgG多克隆抗體得到對照線包被液；
（4）用步驟（2）制備的用抗乙型肝炎病毒表面抗原單克隆抗體（標記抗體）標記的免疫金對金墊噴金得到免疫金墊，用步驟（3）制備的所述檢測線包被液、所述對照線包被液分別在貼有硝酸纖維素膜的聚氯乙烯底板上劃線，得到點膜的聚氯乙烯底板；
（5）將樣品墊、免疫金墊、點膜的聚氯乙烯底板和吸水紙組裝得到乙型肝炎病毒表面抗原檢測試紙。
在本發(fā)明一個較佳實施例中，步驟（1）中所述聚乙烯吡咯烷酮、所述蔗糖、所述海藻糖、所述牛血清白蛋白、所述三羥甲基氨基甲烷和所述定容后總體積的比例為0.5g：10g：5g：1g：0.242g：100mL。
在本發(fā)明一個較佳實施例中，步驟（1）中所述重懸液的pH值是用1M鹽酸調(diào)節(jié)至8.4；所述磷酸緩沖溶液是0.01M、pH值為7.4的磷酸緩沖溶液。
在本發(fā)明一個較佳實施例中，步驟（2）的具體過程為：往攪拌的膠體金中加入碳酸鉀，調(diào)節(jié)pH并攪拌10min，加入抗乙型肝炎病毒表面抗原單克隆抗體（標記抗體）并攪拌15min，再加入牛血清白蛋白溶液，攪拌15min，在4℃、轉(zhuǎn)速為10000r/min的條件下離心3min，吸取得到第一沉淀，剩下上清液，將所述上清液繼續(xù)在4℃、轉(zhuǎn)速為10000r/min的條件下離心10min，吸取得到第二沉淀，將所述第一沉淀和所述第二沉淀合并，用所述重懸液重懸至離心前體積的1/10，得到用抗乙型肝炎病毒表面抗原單克隆抗體（標記抗體）標記的免疫金，其中所述攪拌是置于磁力攪拌器上實現(xiàn)的。
在本發(fā)明一個較佳實施例中，步驟（2）中所述碳酸鉀為0.2M碳酸鉀，所述牛血清白蛋白溶液為質(zhì)量分數(shù)為10%的牛血清白蛋白溶液；所述碳酸鉀和所述抗乙型肝炎病毒表面抗原單克隆抗體（標記抗體）的比例為4uL/mL:14μg/mL；所述牛血清白蛋白溶液的加入體積為所述膠體金體積的1/10。
在本發(fā)明一個較佳實施例中，步驟（3）中所述檢測線包被液中所述抗乙型肝炎病毒表面抗原單克隆抗體（包被抗體）的濃度為0.45mg/mL，所述對照線包被液中所述羊抗鼠IgG抗體的濃度為1.5mg/mL。
在本發(fā)明一個較佳實施例中，步驟（4）中所述噴金過程是通過點膜噴金設(shè)備實現(xiàn)的；所述金墊采用玻璃纖維膜；所述點膜的聚氯乙烯底板放入37℃±3℃、相對濕度≤30%的條件下烘干2h。
在本發(fā)明一個較佳實施例中，步驟（5）中所述樣品墊采用玻璃纖維膜；在使用前用樣品墊處理液對所述樣品墊浸泡10min后干燥，其中所述樣品墊處理液是將比例為0.2g：1mL：20mg：1.21g的牛血清白蛋白、吐溫80、鼠抗人紅細胞抗體和三羥甲基氨基甲烷溶于水中定容至100 mL，pH值調(diào)節(jié)至8.0；所述乙型肝炎病毒表面抗原檢測試紙是組裝后切割得到的。
本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明的乙型肝炎病毒表面抗原檢測試紙的制備方法，得到的檢測試紙基于免疫側(cè)向流層析技術(shù)，不需任何儀器設(shè)備，能夠通過手工操作、肉眼讀取判斷血液樣本中是否含有乙型肝炎病毒表面抗原，診斷快速且結(jié)果準確，不會對受檢者身體造成傷害。所述檢測試紙容易在基層門診進行推廣應(yīng)用，不僅對乙型肝炎的診斷和評價具有重要的臨床意義，同時，為有效阻斷乙型病毒性肝炎在人群間的廣泛傳播起到非常重要的作用。
具體實施方式
下面將對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅是本發(fā)明的一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其它實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
（一）容器及材料
容器設(shè)備：燒杯、量筒、容量瓶、玻璃棒、磁力攪拌機、電子天平、移液槍、點膜噴金設(shè)備、裁切機、切條機、封口機、壓殼機、pH計、鼓風(fēng)干燥箱。
試劑輔料：氯金酸、檸檬酸三鈉、K2CO3、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、無水乙醇、Tris（三羥甲基氨基甲烷）、HCl、BSA（牛血清白蛋白）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、Tween-80（吐溫80）、蔗糖、海藻糖、鼠抗人紅細胞抗體。
物料：玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜、聚氯乙烯底板、吸水紙、塑料卡、干燥劑、一次性滴管、鋁箔袋。
環(huán)境：潔凈、室溫、相對濕度干區(qū)≤30%，濕區(qū)45-65%，水質(zhì)：高純水。
（二）制備過程
1、膠體金的制備：采用檸檬酸三鈉還原法
50 mL 2%氯金酸溶液配制：取1g/瓶的氯金酸溶于高純水中，容量瓶定容至50 mL，2-8℃保存?zhèn)溆谩?/p>
100 mL 5%檸檬酸三鈉溶液配制：稱取5.00g檸檬酸三鈉溶于高純水中，容量瓶定容至100 mL，用0.22 μm濾頭過濾，現(xiàn)配現(xiàn)用。
膠體金制備方法：取兩只潔凈燒杯，分別加入400mL和200mL高純水，前者加入2%氯金酸溶液，后者加入5%檸檬酸三鈉溶液，于磁力攪拌機上加熱至煮沸，待兩種溶液都沸騰時，將檸檬酸三鈉溶液快速倒入沸騰的氯金酸溶液中，繼續(xù)煮沸30min，冷卻后加高純水稀釋，2-8℃保存?zhèn)溆谩?/p>
各組份加入體積：
2、樣品墊的處理：
1L樣品墊處理液配制：稱取2g牛血清白蛋白、12.1g Tris和0.2g鼠抗人紅細胞抗體，量取10mL Tween-80溶于高純水中，容量瓶定容至1L，用1M鹽酸調(diào)pH為8.0，2-8℃密閉保存?zhèn)溆谩?/p>
將型號為RB45的玻璃纖維膜在樣品墊處理液中浸潤，浸泡10min，取出，相對濕度≤30%，風(fēng)干4h，裁去邊緣，防止邊緣效應(yīng)，裝入鋁箔袋中室溫保存?zhèn)溆谩?/p>
3、重懸液、包被基液、膜封閉液溶液配制
100mL 1M鹽酸配制：量取8.59 mL濃鹽酸溶于高純水中，容量瓶定容至100 mL，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>
100mL重懸液配制：稱取0.5g聚乙烯吡咯烷酮、0.242g Tris、10g蔗糖、5g海藻糖和1g BSA溶于高純水，在100mL容量瓶中定容，用1M鹽酸調(diào)pH為8.4，用0.22μm濾頭過濾，2-8℃密閉保存?zhèn)溆谩?/p>
磷酸緩沖液（PB）配制：稱取2.84g磷酸氫二鈉溶于高純水，容量瓶定容至100 mL，即為0.2M磷酸氫二鈉溶液；稱取2.40g磷酸二氫鈉溶于高純水，容量瓶定容至100 mL，即為0.2M磷酸二氫鈉溶液；用0.22 μm濾頭過濾，2-8℃保存?zhèn)溆?。量?9 mL0.2M磷酸二氫鈉溶液，81 mL0.2M磷酸氫二鈉溶液，加入1900 mL高純水，混勻，即為0.01M，pH=7.4的磷酸緩沖液（PB），2-8℃密閉保存?zhèn)溆谩?/p>
包被基液配制：稱取1.00g海藻糖溶于磷酸緩沖液（PB），容量瓶定容至100 mL，2-8℃密閉保存?zhèn)溆谩?/p>
4、免疫金制備
100mL 0.2 M碳酸鉀溶液配制：稱取2.76 g碳酸鉀溶于高純水，容量瓶定容至100mL，用0.22 μm濾頭過濾，2-8℃密閉保存?zhèn)溆谩?/p>
100mL 10％BSA溶液配制：稱取10 g BSA溶于高純水中，容量瓶定容至100mL，0.22 μm濾頭過濾，2-8℃密閉保存?zhèn)溆谩?/p>
標記：取燒杯，加入膠體金，置磁力攪拌機上攪拌，加入4uL/mL的0.2M碳酸鉀，調(diào)節(jié)pH并攪拌10min，緩慢加入14μg/mL的抗乙型肝炎病毒表面抗原單克隆抗體（標記抗體），攪拌15min，緩慢加入10% BSA保護劑，至終濃度1%，攪拌15min，在4℃下轉(zhuǎn)速為10000r/min的條件下離心3min，吸取沉淀，將上清液繼續(xù)在4℃下轉(zhuǎn)速為10000r/min的條件下離心10min，保留沉淀，向收集到的沉淀中用重懸液重懸至原體積的1/10，得到免疫金，2-8℃保存?zhèn)溆谩?/p>
5、點膜噴金操作
噴金：打開點膜噴金設(shè)備，將噴金模塊壓下去，劃線模塊抬上來，防止劃線頭碰觸到板面，打開真空泵至0.5個大氣壓。
按[運行]進入運行畫面，選擇[程序]轉(zhuǎn)換到噴金工作模式。進入程序數(shù)據(jù)畫面后選擇好程序號，編輯好“長度”、“濃度”、“速度”、“原點X、Y、Z”等參數(shù)，修改好參數(shù)后，按[保存]保存數(shù)據(jù)，按[永久保存]將永久保存數(shù)據(jù)。
按[手動]進入手動畫面，將2號泵（噴金模式）樣品管道插入高純水試管中，管道末端準備接水的器皿。選擇[清洗]使用高純水清洗5遍。待拿走高純水試管后，選擇[排液]直至管道內(nèi)無水分。此時將2號泵樣品管道插入試管中，按[加液]直至管道內(nèi)充滿免疫金。將金墊放在板面上的合適位置，按[運行]進入運行畫面，按[開始]進行噴金。
噴金完畢，將2號泵樣品管道插入高純水試管中，管道末端準備接水的器皿。選擇[清洗]使用高純水清洗5遍。按[主菜單]的[氣操作]開氣至氣壓為零。
噴金處理后的金墊于相對濕度≤30%風(fēng)干1h。干燥處理后的免疫金墊置于鋁箔袋中，加干燥劑室溫密封保存?zhèn)溆谩?/p>
配制檢測線包被液：用包被基液、無水乙醇稀釋抗乙型肝炎病毒表面抗原單克隆抗體（包被抗體）至終濃度為0.45mg/mL，得到檢測線包被液即T線工作液，2-8℃保存?zhèn)溆谩?/p>
配制對照線包被液：用包被基液將羊抗鼠IgG多抗稀釋至終濃度為1.5mg/mL，得到對照線包被液即C線工作液，2-8℃保存?zhèn)溆谩?/p>
點膜：將劃線模塊壓下去，將噴金模塊抬上來，形成一定的落差，防止噴金頭觸碰板面。
按[運行]進入運行畫面，選擇[程序]轉(zhuǎn)換到劃線工作模式。進入程序數(shù)據(jù)畫面后選擇好程序號，編輯好“長度”、“濃度”、“速度”、“原點X、Y、Z”等參數(shù)，其中“速度”不可太快，為80mm/s，修改好參數(shù)后，按[保存]保存數(shù)據(jù)，按[永久保存]將永久保存數(shù)據(jù)。
按[手動]進入手動畫面，將1、3號泵（劃線模式）樣品管道插入高純水試管中，管道末端準備接水的器皿。選擇[清洗]使用高純水清洗5遍。待拿走高純水試管后，選擇[排液]直至管道內(nèi)無水分。此時將1號泵（劃線模式）樣品管道插入C線工作液中，將3號泵（劃線模式）樣品管道插入T線工作液中，按[加液]直至管道內(nèi)充滿工作液。將準備好的的粘貼有硝酸纖維素膜的聚氯乙烯底板放在板面上的合適位置，按[運行]進入運行畫面，按[開始]進行劃線。
劃線操作完畢，將1、3號泵樣品管道插入高純水試管中，管道末端準備接水的器皿。選擇[清洗]使用高純水清洗5遍。關(guān)閉點膜噴金儀。劃線完成后的硝酸纖維素膜即反應(yīng)膜，將粘有反應(yīng)膜的聚氯乙烯底板置于干燥箱中，37℃±3℃，相對濕度≤30%，烘干2h。干燥完成后將所述聚氯乙烯底板置于鋁箔袋中，加干燥劑室溫密封保存?zhèn)溆谩?/p>
6、組裝切割、裝配、包裝
將樣品墊、免疫金墊、粘有反應(yīng)膜的聚氯乙烯底板和吸水紙組裝在一起，使用自動斬切機切割成3.0/4.0mm試紙條。每張試紙條裝配至塑料卡中，使用壓殼機壓緊。加入一個干燥劑、一個一次性滴管后裝入鋁箔袋中保存，即為成品。
所述乙型肝炎病毒表面抗原檢測試紙在硝酸纖維素膜的檢測區(qū)固定了抗乙型肝炎病毒表面抗原單克隆抗體（包被抗體），在對照區(qū)固定了羊抗鼠IgG多抗，在玻璃纖維素膜上預(yù)包被抗乙型肝炎病毒表面抗原單克隆抗體（標記抗體）-膠體金。測試時，滴加50uL血清、血漿即可，如檢測全血，還需再滴加一滴（約35μL）全血緩沖液（生理鹽水），水平放置。免疫金墊上的抗乙型肝炎病毒表面抗原單克隆抗體（標記抗體）-膠體金會溶解，如樣本中含有乙型肝炎病毒表面抗原，抗乙型肝炎病毒表面抗原單克隆抗體（標記抗體）-膠體金與樣本中的乙型肝炎病毒表面抗原結(jié)合在一起，形成“抗原-抗體-金”復(fù)合物，復(fù)合物沿著試紙條向后方移動，首先到達包被了抗乙型肝炎病毒表面抗原單克隆抗體（包被抗體）的檢測區(qū)，“抗原-抗體-金”復(fù)合物，將同抗乙型肝炎病毒表面抗原單克隆抗體（包被抗體）結(jié)合，并在檢測線上滯留下來，形成一條紅色的線，這表示陽性結(jié)果。線條顏色的深淺同樣本中的抗體數(shù)量沒有比例關(guān)系。該區(qū)里如果沒有帶顏色的線條表示樣本中不含乙型肝炎病毒表面抗原或乙型肝炎病毒表面抗原低于本試紙最低檢出限。復(fù)合物繼續(xù)移動，到達包被了羊抗鼠IgG多抗的對照區(qū)，游離的“抗體-金”復(fù)合物將同羊抗鼠IgG多抗結(jié)合在一起而富集在對照區(qū)，形成一條紅色的線。對照線的出現(xiàn)證明試紙條檢測功能正常。無論樣本中是否含有乙型肝炎病毒表面抗原，在有效試驗中，試紙條的對照區(qū)都應(yīng)當(dāng)出現(xiàn)淡紅至紫紅色的對照線。樣本繼續(xù)移動，通過對照區(qū)進入吸收區(qū)。吸收區(qū)的作用是吸附剩余的復(fù)合物，使其在試紙條內(nèi)移動，并消除本底的顏色。自試紙條加入稀釋后的樣本混合液起計時，10~15分鐘內(nèi)方可讀取結(jié)果。
以上所述僅為本發(fā)明的實施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運用在其它相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護范圍內(nèi)。