一種表面展示pedv核心抗原coe蛋白重組畢赤酵母菌的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及動物生物醫(yī)藥工程領(lǐng)域，具體公開了一種表面展示豬流行性腹瀉病毒核心抗原COE蛋白重組畢赤酵母菌的制備方法。本發(fā)明采用酵母α凝集素表面展示系統(tǒng)來表達PEDV的抗原核心基因COE基因，使COE蛋白錨定在酵母的細胞壁上，提供一種表面展示豬流行性腹瀉病毒核心抗原COE蛋白重組畢赤酵母菌的制備方法。該重組畢赤酵母可制備成具有良好產(chǎn)業(yè)化前景的新型疫苗產(chǎn)品，隨著這些疫苗的推廣應用，對養(yǎng)豬業(yè)危害嚴重的病毒性腹瀉的預防起到積極的作用，對保護和促進養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展具有重要的實踐意義，同時亦將取得顯著的社會經(jīng)濟效益，擁有廣大的市場并具備產(chǎn)業(yè)化的前景。
【專利說明】—種表面展示PEDV核心抗原COE蛋白重組畢赤酵母菌的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及動物生物醫(yī)藥工程領(lǐng)域，特別是一種表面展示豬流行性腹瀉病毒核心抗原COE蛋白重組畢赤酵母菌的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]自2010年10月份以來，仔豬腹瀉病的發(fā)生與流行在國內(nèi)主要養(yǎng)豬省份均呈持續(xù)上升趨勢，也是引起7日齡以內(nèi)仔豬死亡的重要原因，短短一年多，以廣東省為首的南方10個省市仔豬死亡量超過了 100萬頭，發(fā)病率為60%-100%，死亡率高達80%-100%，嚴重威脅著養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展，造成了巨大的經(jīng)濟損失。豬流行性腹?寫病毒(Porcine epidemicdiarrhea virus，PEDV)是國內(nèi)外學者較為認同的主要致病因素之一。目前防止豬病毒性腹瀉的最為有效的手段是接種疫苗。雖然國內(nèi)用于流行性腹瀉的疫苗主要有:PEDV與TGEV二聯(lián)疫苗(包括二聯(lián)滅活苗及二聯(lián)活疫苗)得到了廣泛的推廣和應用，在一定范圍和程度上減少了病毒性腹瀉的發(fā)病率，但仍然未能完全控制，尤其在2010年10月至今，該病呈持續(xù)性、爆發(fā)性增長趨勢。從目前國內(nèi)外對PEDV、TGEV和RV的研究結(jié)果及應用效果看，仔豬主要通過初乳獲得母源slgA，產(chǎn)生對冠狀病毒性腹瀉的被動免疫保護，血清中的循環(huán)抗體IgG不能提供保護，經(jīng)非腸道免疫不能產(chǎn)生母源免疫。因此，迫切需要研制出安全、有效、廉價并且可以誘導黏膜免疫的新型PEDV 口服疫苗。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0003]本發(fā)明的目的在于為了克服現(xiàn)有技術(shù)中PEDV疫苗存在的上述缺陷，提供一種表面展示豬流行性腹瀉病毒核心抗原COE蛋白重組畢赤酵母菌的制備方法。
[0004]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)的:
一種表面展示豬流行性腹瀉病毒核心抗原COE蛋白重組畢赤酵母菌的制備方法，以α凝集素作為靶基因?qū)OE蛋白錨定在酵母細胞壁上，具體方法如下:
51.pPICZ a A-COE-AGa重組質(zhì)粒的制備:將凝集素AGa基因片段和pPICZ a載體通過酶切、連接技術(shù)構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pPICZ a A-AGa ;將COE基因片段和重組質(zhì)粒pPICZ a A-AGa通過酶切、連接技術(shù)構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pPICZ a A-COE-AG a ;所述凝集素AG a基因片段和COE基因片段的序列如SEQ IDNO:廣2所示；
52.采用電轉(zhuǎn)化法將pPICZa A-COE 一 AG a重組質(zhì)粒導入畢赤酵母X33中，獲得重組酵母 PicAia pas tor is X-33/pPICZ a A-COE-AG a。
[0005]優(yōu)選地，S2所述電轉(zhuǎn)化法為:取80 μ L畢赤酵母感受態(tài)細胞，與5~10 μ g線性化的重組質(zhì)粒pPICZ a A-COE-AG a混合，冰浴15min，在電壓1500V，電容量25 μ F，電阻200 Ω條件下電擊，電擊后立即加入ImL冰浴的lmol/L山梨糖醇，30°C下孵育I~2小時，平板篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子。
[0006]優(yōu)選地，凝集素AG a基因片段的擴增用引物序列如SEQ ID NO:3~4所示，COE基因片段的擴增用引物序列如SEQ ID NO:5~6所示。
[0007]由以上方法制備得到的重組酵母PicAiaX-33/pPICZ a A-COE-AG α。
[0008]所述重組酵母pastor I s X-33/pPICZ a A-COE-AG α在制備預防豬流行性腹瀉口服疫苗中的應用。
[0009]一種預防豬流行性腹瀉口服疫苗的制備方法，包括如下步驟:
51.將重組酵母PicAia pas tor is X-33/pPICZ a A-COE-AG α 接種于 YPD 液體中，30°C >250 r/min振蕩培養(yǎng)過夜；再接種于BMGY體培養(yǎng)基中，30°C振蕩培養(yǎng)24 h，至菌體OD6tltol達到2~6時離心棄去上清，加入BMMY液體培養(yǎng)基，連續(xù)誘導培養(yǎng)72 h ；
52.離心去上清，將菌體用用懸浮緩沖液稀釋得到細菌含量為IXIOkiCFU/mL的菌懸液，菌懸液再制備成口服疫苗，直接灌喂；所述懸浮緩沖液組成為:0.2 mol/L NaHCO3, 5%水解酪蛋白，0.5%葡萄糖懸浮。
[0010]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
本發(fā)明采用酵母α凝集素(a-agglutinin)表面展示系統(tǒng)來表達PEDV的抗原核心基因COE基因，并使COE蛋白錨定在酵母的細胞壁上，提供一種表面展示豬流行性腹瀉病毒核心抗原COE蛋白重組畢赤酵母菌的制備方法。本發(fā)明同時使用其他類型的酵母錨定蛋白來使COE蛋白錨定在酵母細胞壁上，但是結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用α凝集素作為PEDV抗原核心基因COE的錨定蛋白，可以較牢固地將COE錨定在細胞表面，不會輕易地從細胞表面脫落，而且α凝集素可以與COE蛋白序列的C端有效融合而不影響COE蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。而使用其他的錨定蛋白，效果都不好，如a凝集素。a凝集素包括由AGAl編碼的核心亞基和由AGA2編碼的小結(jié)合亞基組成，亞基之間通過二硫橋相連，將COE蛋白的N端或C端展示在酵母表面，容易從酵母細胞壁上脫落，泄露到培養(yǎng)基中。
[0011]作為一種真核表達系統(tǒng)，酵母表面展示系統(tǒng)具有以下優(yōu)點:(I)、展示的蛋白具有天然構(gòu)象；(2)1個細胞中可以展示來自于I種或多種致病細菌的抗原蛋白質(zhì)；(3)安全，表達的外源蛋白無需經(jīng)過純化，可以連同菌體一起服用。目前國內(nèi)外還未見將酵母展示技術(shù)用于展示豬流行性腹瀉病毒的核心抗原COE蛋白。
[0012]本發(fā)明與市場已有疫苗相比，在腸黏膜、糞便、淚液中產(chǎn)生SlgA數(shù)量及抗體維持時間上有優(yōu)勢；酵母屬于真核表達系統(tǒng)，表達出來的重組蛋白更接近于天然蛋白，有利于重組COE蛋白活性的保持；更加安全、廉價，適合于在畜牧生產(chǎn)中進行應用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1.重組載體pPICZ a A-COE-AG α雙酶切鑒定鑒定結(jié)果；Μ.DL2000 DNAMarker ； 1.pPICZ a A-COE-AG a EcoR I ,Kpn I 雙酶切鑒定。
[0014]圖2.重組畢赤酵母PicAiaX-33/pPICZ a A-COE-AG a PCR鑒定結(jié)果；M.DL2000 Marker; 1.重組畢赤酵母AGa PCR鑒定；2.AGa陽性對照；3.重組畢赤酵母COE PCR鑒定；4.COE陽性對照。
[0015]圖3.重組 PicAia pas tor is X-33/pPICZ a A-COE-AG a 的誘導表達結(jié)果；M.蛋白 marker 1.Pichia pas tor is X-33 空白對照；2.Pichia pas tor is X-33/pPICZ a A 空白對照；3.2%甲醇誘導重組酵母表達96h ；4.3%甲醇誘導重組酵母表達96h。
[0016]圖4.畢赤酵母細胞壁蛋白免疫印跡；1.PicAia pas tor is X-33細胞壁蛋白免疫印跡(空白對照)；2.paWoris X-33/pPICZ a A細胞壁蛋白免疫印跡(空白對照)；
3.3%甲醇誘導重組酵母細胞壁蛋白免疫印跡。
[0017]圖5.重組 PicAia pas tor is X-33/pPICZ a A-COE-AG α 的顯微鏡免疫熒光檢測?！揪唧w實施方式】
[0018]下面結(jié)合說明書附圖和具體實施例進一步詳細說明本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、設(shè)備為本【技術(shù)領(lǐng)域】常規(guī)試劑和設(shè)備。
[0019]實施例1
S1.α凝集素表面展示型重組質(zhì)粒pPICZ a A- COE-AG α的構(gòu)建Sll.α凝集素基因AGa和豬流行性腹瀉病毒COE基因上游引物、下游引物的設(shè)計過程:參照GenBank中注冊的α凝集素基因cDNA基因和PEDV COE基因的序列設(shè)計而成，上游引物設(shè)計在該基因起始端，同時根據(jù)表達載體pPICZ a A上的酶切位點，AGa基因上游引物設(shè)計時添加了治7/7 I酶切位點及在式? I酶切位點前加有3個保護性堿基CGG ;下游引物設(shè)計在基因末端，并加上油3 I酶切位點，在油3 I酶切位點位點前加有3個保護性堿基TGC ；C0E基因上游引物設(shè)計時添加了及^7? I酶切位點及在及^7? I酶切位點前加有3個保護性堿基CCG ;下游引物設(shè)計在基因末端，并加上式? I酶切位點，在治μ I酶切位點位點前加有3個保護性堿基CGG。所設(shè)置的AG α基因和COE基因上游引物、下游引物分別為，AGa上游引物:
5? CGGGGTACCTATCAGGGTCGGAACCTC -3? {Κρη I 酶切位點)
AGa下游引物:
5’ - GCACGTAGTCTAGATCATTAGAATAGCAGGTACGACAA-3’ {Xba I 酶切位點)
COE上游引物:
5’ - CCGGAATTCGTTACTTTGCCATCCTTCAACGATC-3’ (.EcoR I 酶切位點)
COE下游引物:
5’ - CGGGGTACCAACATCAGTAACACCTTGAAGTGGC-3’ (Kpn I 酶切位點)。
[0020]S12.AGa基因片段的PCR擴增過程:以提取釀酒酵母Inscl基因組為模板，加入ExTaq DNA聚合酶、AG α上/下游引物、dNTPs進行擴增反應，PCR的反應體系為:10XPCRBuffer (包含 0.5mmol/L MgC12, 50mmol/L KCl, lOmmol/L Tris.HC1，0.001% 明膠)5 μ L，4父(1見1^(包含(^了？，dTTP, dCTP, dGTP 各 2.5mmol/L)4 μ L，濃度均為 20 μ mol/L 的 AG α上、下游引物各I μ L，模板為釀酒酵母Inscl基因組I μ L，ddH20 (雙蒸水)37.5 μ L，濃度為5ymol/L的ExTaq DNA聚合酶(λ 5 μ L，反應過程依次為:a、94°C處理5min ;b、依次94°C處理30s、58°C處理30s、72°C處理30s ;反應過程進行30個循環(huán)；c、72°C延伸IOmin ;即獲得AGa基因的PCR產(chǎn)物，AGa基因的PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察，可見大小約990bp的擴增條帶，與預期的結(jié)果一致。
[0021]S13.COE基因片段的PCR擴增過程:以提取重組質(zhì)粒pCMV_C0E為模板，該質(zhì)粒由華南農(nóng)業(yè)大學動物科學院家禽研究室魏鐘艷獲得保存，加入ExTaq DNA聚合酶、COE上/下游引物、dNTPs進行擴增反應，PCR的反應體系為:10XPCR Buffer (包含0.5mmol/L MgCl2,50mmol/L KCl，10mmol/L Tris.Η(:1，0.001% 明膠)5 μ L，4Χ dNTPs(包含 dATP, dTTP, dCTP,dGTP各2.5mmol/L)4 μ L，濃度均為20 μ mol/L的COE上、下游引物各I μ L，模板為 I μ L，ddH20 (雙蒸水)37.5 μ L，濃度為5 μ mol/L的ExTaq DNA聚合酶0.5 μ L，反應過程依次為:
a、94°C處理5min ;b、依次94°C處理30s、60°C處理30s、72°C處理30s ;反應過程進行30個循環(huán)；c、72°C延伸IOmin ;即獲得COE基因的PCR產(chǎn)物，COE基因的PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察，可見大小約420bp的擴增條帶，與預期的結(jié)果一致。
[0022]S14.重組質(zhì)粒pPICZ a A-AG α的構(gòu)建:將過程S2的AG α基因的PCR產(chǎn)物用氛氯仿抽提純化，加入乙醇獲得沉淀物，將沉淀物干燥后用TE (TE包含有l(wèi)Ommol/L Tris -HCl,lmmoI/L EDTA)溶解，TE溶解物用油al、治wl進行雙酶切處理，膠回收大小約990bp的條帶；以同樣的方法對pPICZ a A質(zhì)粒進行雙酶切處理，膠回收大小約3.6kb的DNA片段，分別取5μ L雙酶切后膠回收的AGa基因片段和3μ L雙酶切后膠回收的pPICZ a A質(zhì)粒，加入I μ L 的 10ΧΤ4 DNA 連接 Buffer (10XT4 DNA 連接 Buffer 包含有 0.5mol/L Tris.HCl，
0.lmol/L MgCl2, 50mmol/L DTT,5mmol/L ΑΤΡ,Ο.25mg/mL BSA), I μ L T4 DNA 連接酶，在16°C下連接處理18小時，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化疋co/i Dh5a感受態(tài)細胞，在含有25 μ g/mLZeocin的低鹽LB瓊脂培養(yǎng)板中，37°C培養(yǎng)過夜，即完成重組質(zhì)粒pPICZ a A-AGa的構(gòu)建。Zeocin、pPICZ a A 質(zhì)粒為 Invitrogen 公司的產(chǎn)品。
[0023]S15.重組質(zhì)粒pPICZ a A-COE-AG α的構(gòu)建:將過程S3的COE基因的PCR產(chǎn)物用氛氯仿抽提純化，加入乙醇獲得沉淀物，將沉淀物干燥后用TE (TE包含有l(wèi)Ommol/LTris.HCl, lmmol/L EDTA)溶解，TE溶解物用EcoKUKpnl進行雙酶切處理，膠回收大小約420bp的條帶；以同樣的方法對S14構(gòu)建的pPICZ a A-AGa質(zhì)粒進行雙酶切處理，膠回收大小約4.6kb的DNA片段，分別取5 μ L雙酶切后膠回收的COE基因片段和3 μ L雙酶切后膠回收的 pPICZ a A-AGa 質(zhì)粒，加入 IyL 的 10XT4 DNA 連接 Buf fer (10XT4 DNA 連接 Buffer 包含有 0.5mol/L Tris.HCl，0.lmol/L MgCl2, 50mmol/L DTT,5mmol/L ATP，0.25mg/mL BSA), I μ L T4 DNA連接酶，在16°C下連接處理18小時，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化萬.Dh5a感受態(tài)細胞，在含有25 μ g/mL Zeocin的低鹽LB瓊脂培養(yǎng)板中，37°C培養(yǎng)過夜，即完成重組質(zhì)粒pPICZ a A-COE-AG α的構(gòu)建。
[0024]S2.含COE基因的表面展示型畢赤酵母重組轉(zhuǎn)化子的篩選
S21.重組質(zhì)粒的提取和線性化:挑取轉(zhuǎn)化入重組質(zhì)粒pPICZ a A-COE-AG α的疋Dh5a陽性菌接種于25 mL含25 μ g/mL Zeocin的低鹽液體LB培養(yǎng)基中，37°C，220 rpm振搖培養(yǎng)24 h。將菌液于4°C，5 OOOrpm離心10 min，沉淀細菌。然后用質(zhì)粒DNA抽提試劑盒抽提質(zhì)粒。用I酶將抽提的重組質(zhì)粒pPICZ a A-COE-AG α線性化。
[0025]S22.畢赤酵母電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞的制備:接種畢赤酵母宿主菌X33單菌落至5mLYPD (含1%酵母抽提物，2%蛋白胨，2%葡萄糖)培養(yǎng)基中，30°C過夜培養(yǎng)。然后接種0.1~
0.5mL過夜培養(yǎng)菌液到500mL新鮮YPD培養(yǎng)液，30°C培養(yǎng)，使OD600nm達到1.2~1.3。4°C 3000r/m離心5min,棄上清；依次以500mL、250mL冰浴滅菌水及20mL冰冷lmol/L山梨糖醇重懸菌體洗漆，4°C 3 000r/m離心5min,離心3次；最后將細胞重懸于ImL冰浴滅菌的Imol/L山梨糖醇，即為感受態(tài)的酵母細胞。
[0026] S23.畢赤酵母的電擊轉(zhuǎn)化:取80 μ L準備好的畢赤酵母感受態(tài)細胞，與5~10 μ g線性化的重組質(zhì)粒pPICZ a A-COE-AG α混合，轉(zhuǎn)移到冰浴的的0.2cm電轉(zhuǎn)杯中，冰浴15min，于2000-Y型基因?qū)雰x進行電擊轉(zhuǎn)化，電脈沖參數(shù)為電壓1500V，電容量25 μ F，電阻200 Ω。電擊后立即加入ImL冰浴的lmol/L山梨糖醇到電轉(zhuǎn)化小杯中，將小杯內(nèi)懸液轉(zhuǎn)移到一個滅菌的15mL的試管中，將試管在30°C下孵育I~2小時，取10、25、50、100與200uL分別鋪到含有100 μ g/mL Zeocin YPDS (1%酵母抽提物，2%蛋白胨，2%葡萄糖，IM山梨糖醇，20g瓊脂粉)平板上以篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子，30°C孵化平板疒3d至出現(xiàn)乳白色的酵母轉(zhuǎn)化菌落即為含COE基因的表面展示型畢赤酵母重組轉(zhuǎn)化子。
[0027]S24.畢赤酵母轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定:抽提轉(zhuǎn)化的酵母基因組DNA，以其為模板，加入ExTaq DNA聚合酶、COE和AG α基因上/下游引物、dNTPs進行擴增反應，PCR的反應體系為:IOXPCR Buffer(包含0.5mmol/L MgC12, 50mmol/L KCl, 10mmol/L Tris.HCl，0.001% 明膠)5 μ L，4 X dNTPs (包含 dATP, dTTP, dCTP, dGTP 各 2.5mmol/L) 4 μ L，濃度均為 20 μ mol/L的COE和AG α上、下游引物各I μ L，模板為抽提轉(zhuǎn)化的酵母基因組DNA I μ L，ddH20 (雙蒸水)37.5 μ L，濃度為5 μ mol/L的ExTaq DNA聚合酶0.5 μ L，反應過程依次為:a、94°C處理3min ;b、依次94°C處理30s、56°C處理30s、72°C處理30s ;反應過程進行30個循環(huán)；c、72°C延伸IOmin ;PCR擴增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察，可見約420bp和990bp的擴增條帶，即表明所抽提的酵母為陽 性酵母轉(zhuǎn)化子。
[0028]S3.含COE基因的表面展示型畢赤酵母重組轉(zhuǎn)化子體外誘導表達過程:挑取經(jīng)鑒定的陽性轉(zhuǎn)化子接種于3 mL YPD液體中，30°C、250 r/min振搖培養(yǎng)過夜；再接種于50 mLBMGY (1%酵母抽提物，2%蛋白胨，lmol/L磷酸鉀緩沖液(pH6.0)，1.34%YNB (無酵母氮源)，4X10-5 %生物素，1%甘油)體培養(yǎng)基中，30°C振蕩培養(yǎng)24 h，至菌體OD6tltol達到2~6時離心棄去上清，加入25 mL BMMY液體培養(yǎng)基(1%酵母抽提物，2%蛋白胨，lmol/L磷酸鉀緩沖液(ρΗ6.0)，1.34%ΥΝΒ(無酵母氮源)，4Χ 10-5 %生物素，0.5%甲醇)，連續(xù)誘導培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)至72h收集樣品，離心，去上清進行提取重組菌細胞壁總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示誘導培養(yǎng)后的菌體蛋白與未誘導的對照組相比，有一條大小約55kD的蛋白表達條帶。經(jīng)western blotting免疫印跡和突光顯微鏡分析,表明目的基因已經(jīng)得到表達在畢赤酵母細胞壁表面上，并且具有一定的免疫活性。
[0029]本發(fā)明所使用的限制性內(nèi)切酶治7/7 !,EcoR l.Pme 1、T4DNA連接酶、ExTaq DNA聚合酶等均購自廣州寶泰克生物科技有限公司。菌株X_33、Zeocin抗生素、pPICZ a A質(zhì)粒為Invitrogen公司的產(chǎn)品。
[0030]實施例2
一種預防豬流行性腹瀉口服疫苗的制備方法，包括如下步驟:
S1.挑取經(jīng)鑒定的陽性轉(zhuǎn)化子接種于3 mL YPD液體中，30°C、250 r/min振搖培養(yǎng)過夜；再接種于50 mL BMGY (1%酵母抽提物，2%蛋白胨，lmol/L磷酸鉀緩沖液(pH6.0)，
1.34%YNB (無酵母氮源)，4X10_5 %生物素，1%甘油)體培養(yǎng)基中，30°C振蕩培養(yǎng)24 h，至菌體OD6tltlnm達到2~6時離心棄去上清，加入25 mL BMMY液體培養(yǎng)基(1%酵母抽提物，2%蛋白胨，lmol/L磷酸鉀緩沖液(ρΗ6.0)，1.34%ΥΝΒ (無酵母氮源)，4Χ 10_5 %生物素，0.5%甲醇)，連續(xù)誘導培養(yǎng)72 h。
[0031]S2.培養(yǎng)至72h收集樣品，離心，去上清，將重組酵母菌用懸浮緩沖液(0.2 mol/LNaHCO3, 5%水解酪蛋白，0.5%葡萄糖懸浮)稀釋得到細菌含量為I X IO10 CFU/mL重組酵母菌懸液，菌懸液再制備成口服疫苗，直接灌喂。
[0032]重組酵母菌懸液的使用方法:為初步研究重組菌是否能夠誘導黏膜免疫，采用60只7周齡的BALB/c小鼠隨機分為3組飼養(yǎng)，每組20只，第I組為PBS對照，第2組免疫重組酵母菌懸液(即口服疫苗)，第3組免疫PEDV+TGEV 二聯(lián)弱毒苗。采用灌胃或腹腔注射的方式免疫，分別于第1、14和28天進行口服免疫，每次連續(xù)免疫三天，劑量為0.2mL/只。于免疫前及初次免疫后第7、14、28、35、42、50、60天每組隨機選擇2只小鼠，采集血清、腸黏膜、淚液、糞便樣品，用PEDV全病毒做抗原，ELISA檢測樣品中分泌型IgA (slgA)水平。
[0033]ELISA方法檢測結(jié)果表明:免疫重組菌后腸道、糞便、淚液中均能產(chǎn)生slgA，實驗組(重組酵母菌懸液)中腸黏膜在免疫后第14天即能檢測到較高的slgA水平，達到抗體高峰，顯著高于對照組(PBS組)(P < 0.05)。且在免疫后第50天和第60天出現(xiàn)了第二次抗體水平峰值，顯著高于對照組(PBS組)(P <0.05)。初步證實該重組菌懸液可以誘導小鼠產(chǎn)生黏膜抗體，為開發(fā)新型口服疫苗預防PED提供理論基礎(chǔ)。
[0034]對比例I
本發(fā)明同時使用其他類型的酵母錨定蛋白來使COE蛋白錨定在酵母細胞壁上，但是結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用α凝集素作為PEDV抗原核心基因COE的錨定蛋白，可以較牢固地將COE錨定在細胞表面，不會輕易地從細胞表面脫落，而且α凝集素可以與COE蛋白序列的C端有效融合而不影響COE蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。而使用其他的錨定蛋白，效果都不好，如a凝集素。a凝集素包括由AGAl編碼的核心亞基和由AGA2編碼的小結(jié)合亞基組成，亞基之間通過二硫橋相連，將COE蛋白的N端或C端展示在酵母表面，容易從酵母細胞壁上脫落，泄露到培養(yǎng)基中。
【權(quán)利要求】
1.一種表面展示豬流行性腹瀉病毒核心抗原COE蛋白重組畢赤酵母菌的制備方法，其特征在于，以α凝集素作為靶基因?qū)OE蛋白錨定在酵母細胞壁上，具體方法如下: .51.pPICZ a A-COE-AGa重組質(zhì)粒的制備:將凝集素AGa基因片段和pPICZ a載體通過酶切、連接技術(shù)構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pPICZ a A-AGa ;將COE基因片段和重組質(zhì)粒pPICZ a A-AGa通過酶切、連接技術(shù)構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pPICZ a A-COE-AG a ;所述凝集素AG a基因片段和COE基因片段的序列如SEQ IDNO:廣2所示； .52.采用電轉(zhuǎn)化法將pPICZa A-COE 一 AG a重組質(zhì)粒導入畢赤酵母X33中，獲得重組酵母 PicAia X-33/pPICZ a A-COE-AG a。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述重組畢赤酵母菌的制備方法，其特征在于，S2所述電轉(zhuǎn)化法為:取80 μ L畢赤酵母感受態(tài)細胞，與5~10 μ g線性化的重組質(zhì)粒pPICZ a A-COE-AG a混合，冰浴15min，在電壓1500V，電容量25 μ F，電阻200 Ω條件下電擊，電擊后立即加入ImL冰浴的lmol/L山梨糖醇，30°C下孵育1~2小時，平板篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述重組畢赤酵母菌的制備方法，其特征在于，凝集素AGa基因片段的擴增用引物 序列如SEQ ID NO:3~4所示，COE基因片段的擴增用引物序列如SEQ ID NO:.5~6所示。
4.權(quán)利要求1至3任一項所述方法制備得到的重組酵母/7ZcAiapas tor is X-33/pPICZa A-COE-AG a。
5.權(quán)利要求4所述重組酵母Z7ZcAiapastoris X-33/pPICZ a A-COE-AG a在制備預防豬流行性腹瀉口服疫苗中的應用。
6.一種預防豬流行性腹瀉口服疫苗的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: . 51.將重組酵母PicAia pastoris X-33/pPICZ a A-COE-AG a 接種于 YPD 液體中，.300C >250 r/min振蕩培養(yǎng)過夜；再接種于BMGY體培養(yǎng)基中，30°C振蕩培養(yǎng)24 h，至菌體.OD6tltol達到2~6時離心棄去上清，加入BMMY液體培養(yǎng)基，連續(xù)誘導培養(yǎng)72 h ； .52.離心去上清，將菌體用用懸浮緩沖液稀釋得到細菌含量為IXIOkiCFU/mL的菌懸液，菌懸液再制備成口服疫苗，直接灌喂；所述懸浮緩沖液組成為:0.2 mol/L NaHCO3, 5%水解酪蛋白，0.5%葡萄糖懸浮。
【文檔編號】C12R1/84GK103952432SQ201410192205
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年5月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月8日
【發(fā)明者】馬靜云, 袁堯, 胡文鋒, 李智麗, 曾喜多, 孫寶麗, 畢英佐 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學